CC BY
116
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.21294/1814-4861-2016-15-2-36-41 УДК: 616-006.66, 616-006.699, 616-035.1
анализ мутаций в генах KRAS И BRAF При раке толстой и прямой кишки в российской популяции
Е.Е. Писарева1, Л.н. Любченко2, с.П. коваленко1, в.А. Шаманин1
НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г Новосибирск1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, г Москва2 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2/12, e-mail: [email protected]
Аннотация
Образцы опухоли толстой и прямой кишки (РТПК) от российских пациентов на наличие мутаций в генах КИЛБ и БЯЛР исследовали с помощью двух высокочувствительных методов анализа: аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (ас-рв ПЦР) и секвенирования по Сэнгеру с блокированием аллеля дикого типа. Материал и методы. В качестве материала для исследования использовали срезы свежезамороженной и фиксированной в формалине и заключенной в парафин ткани опухоли от 80 пациентов. На гистологическом исследовании было определено содержание опухолевых клеток в каждом образце. Образцы были протестированы методом ас-рв ПЦР на мутации в гене КЯЛБ ^12С, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D) и мутации ВЯА^600Е. Затем была проведена амплификация ДНК образцов в присутствии олигонуклеотида, блокирующего амплификацию аллеля KRAS дикого типа с дальнейшем секвенированием ДНК по Сэнгеру. результаты. По данным гистологического заключения из 80 образцов низкое содержание опухолевых клеток (<20 %) было обнаружено в 5 (6 %) случаях. В модельных экспериментах оба метода анализа позволяли детектировать 5 % аллеля с мутацией. Мутации в генах КЯЛБ и БЯЛР были обнаружены в 37 (46 %) и 3 (3,8 %) случаях соответственно. Совпадение результатов анализа с помощью обоих методов произошло в 79 (98,8 %) случаях. Расхождение результатов анализа для одного образца связано с тем, что секвени-рование ДНК по Сэнгеру обнаружило мутацию KRЛSG13R, тогда как ас-рв ПЦР не включала методику детекции этой мутации. Кроме того, мутация в гене ^ЛБ была обнаружена в 2 образцах с низким содержанием опухолевых клеток. Обнаружены 2 случая с несколькими мутациями: 1 образец с мутациями в гене KRASG12V и G13D, а также 1 образец с мутациями KRASG13D и BRAFV600E. Заключение. Частота мутаций при РТПК для мутаций в гене ^ЛБ составила 46 %, для BRЛF- 3,8 %. Показана сходимость результатов анализа с помощью ас-рв ПЦР и секвенирования по Сэнгеру в 98,8 %. Полученные данные о частотах мутаций согласуются с исследованиями в других странах. В исследовании впервые обнаружен образец РТПК, одновременно содержащий мутации KRASG13D и BRAFV600E.
ключевые слова: ПЦр в режиме реального времени, секвенирование по сэнгеру, рак толстой и прямой кишки, мутации, №ЛЭ, BRAF.
В России рак толстой и прямой кишки (РТПК) занимает третье место в структуре онкологической патологии. Заболеваемость в РФ составляет 10,4 чел. на 100 тыс. населения в год, при средней пятилетней выживаемости - 50 % [1]. В патогенезе данного заболевания главным является пролиферация эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника. Ранее было показано, что в 80 % случаев РТПК есть гиперэкспрессия EGFR, которая приводит к усиленному росту и делению клеток опухоли вследствие гиперактивации RAS-МАРК сигнального каскада [16]. Для лечения таких больных успешно применяются препараты на основе моноклональных антител к EGFR, которые, связываясь с ним на поверхности клетки, блокируют запуск сигнального каскада и таким
образом препятствуют росту и развитию опухоли [11]. Эффективность лечения этими препаратами зависит от молекулярно-генетических изменений в опухоли: статуса EGFR, наличия мутаций в других участниках сигнального каскада - онкогенах KRAS и BRAF - и некоторых других факторов. При отсутствии мутаций в гене KRAS эффективность лечения РТПК очень высока, увеличивается средняя продолжительность жизни, уменьшается количество рецидивов. В то же время при наличии в клетках опухоли активирующих мутаций в гене KRAS использование анти-EGFR антител не приводит к положительным результатам [13]. В 30-40 % случаев РТПК выявляются следующие мутации в 12 и 13 кодонах KRAS (85-90 %), которые коррелируют с резистентностью опухолей к анти-EGFR терапии:
^ Писарева Екатерина Евгеньевна, [email protected]
G12C, G12S, G12R, G12A, G12V, G12D, G13D. Значительно реже выявляются мутации в кодонах 61 (5 %) и 146 (5 %) [13, 19]. Таким образом, тест на наличие мутации гена KRAS необходим пациентам с РТПК для оценки возможности применения таргетной терапии анти-EGFR антителами [13, 19]. Активирующие мутации BRAF встречаются, по разным данным, в 5-15 % случаев РТПК, в 95 % случаев это мутация V600E [2-4, 21]. Существуют противоречивые данные о предсказательной роли мутации BRAFV600E в отношении ответа опухоли на анти-EGFR терапию и прогностической значимости в отношении прогрессирования заболевания [7, 8, 12, 17]. В настоящее время имеются немногочисленные исследования частоты мутаций в гене KRAS и одно исследование мутаций в гене BRAF при РТПК у российских пациентов [2-4, 21].
Соматические мутации возникают в клетках опухоли, которые всегда окружены нормальной тканью. Для гистологического исследования, как правило, берется часть опухолевой и нормальной ткани для приготовления фиксированной в формалине и заключенной в парафин (ФФЗП) ткани в виде блоков. Срезы блоков далее окрашиваются для определения типа опухоли и относительного содержания опухолевых клеток, и несколько срезов используются для выделения ДНК. Для анализа соматических мутаций в ДНК опухоли необходим высокочувствительный метод, позволяющий обнаруживать ДНК с мутацией при содержании минимального количества (5-10 %) опухолевых клеток в образце на фоне ДНК дикого типа из нормальной ткани. В большинстве исследований соматических мутаций используется метод секвенирования по Сэнгеру, который детектирует мутацию только при ее содержании в образце более 20 %, что может привести к ложноотрицательным результатам при меньшем содержании ДНК с мутацией в образце [10, 18]. В некоторых случаях эта проблема может быть решена с помощью макродиссекции опухолевой ткани для обогащения опухолевыми клетками, однако в случае диффузного расположения опухолевых клеток выполнить макродиссекцию не представляется возможным. Для точного анализа мутационного статуса всех опухолей необходим более чувствительный метод. Метод аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (ас-рв ПЦР) обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять мутацию при наличии всего 1-5 % ДНК с мутацией в образце [14].
Целью исследования является анализ частот и спектра мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS и мутации BRAFV600E при РТПК у российских пациентов с помощью высокочувствительных методов анализа.
Материалы и методы
Проводили анализ образцов опухолей от 80 российских больных РТПК из НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и онкологических диспансеров г. Новосибирска. Группа больных состояла из 49 женщин и 31 мужчины в возрасте 24-85 лет (средний возраст - 60,9 года).
Образцы ткани РТПК (n=80), фиксированной в формалине и заключенной в парафин (n=26) и замороженной (n=54), были предоставлены Российским онкологическим научным центром им. Н.Н. Блохина (n=72) и онкологическими диспансерами г. Новосибирска (n=8). Окрашенные срезы ФФЗП ткани были исследованы патомор-фологом для определения количества опухолевых клеток. ДНК из замороженной ткани выделяли с помощью набора «QlAampDNATissueMiniKit» (Qiagen, Германия), предварительно подвергнув образцы ручной макродиссекции для обогащения раковыми клетками. ДНК из срезов ФФЗП ткани выделяли с помощью набора «RealLineFFPETex-traction100- («БиоЛинк», РФ) без предварительной макродиссекции.
Анализ мутаций KRAS проводили, тестируя образцы в ас-рв ПЦР, используя набор реагентов «KRAS-7M» («БиоЛинк», РФ), который позволяет обнаруживать наиболее частые мутации 12 и 13 кодонов гена KRAS. Анализ мутации BRAFV600E также проводили с помощью ас-рв ПЦР, используя набор реагентов «BRAFV600E» («БиоЛинк», РФ). Данные тестирования были валидированы с помощью секвенирования.
Набор «KRAS-7M» позволяет проводить анализ мутаций 12 и 13 кодонов гена KRAS методом ас-рв ПЦР для определения наиболее распространённых мутаций: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A и G13D. Диагностика с помощью этого метода возможна, если содержание ДНК с мутацией составляет более 5 %. При этом образец ДНК тестируется в отдельной для каждой мутации реакции, содержащей специфичные праймеры. В каждом эксперименте тестируется положительный стандарт, содержащий 5 % ДНК с мутацией. Полученные кривые амплификации и значения Ct для образца ДНК сравниваются с таковыми для положительного стандарта для определения наличия или отсутствия мутации в исследуемом образце. Анализ мутации BRAFV600E проводили также методом ас-рв ПЦР с помощью набора реагентов «BRAF-V600E». Метод позволяет детектировать наличие мутации при ее содержании в образце более 1 % [15]. Анализ методом ас-рв ПЦР проводили, используя амплификатор «CFX96 Real-Time PCR detection System» (BioRad, США).
Секвенирование ДНК по Сэнгеру проводили для анализа мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS. Продукт ПЦР для секвенирования получали с помощью набора «KRAS-HiSenSeq» («БиоЛинк»,
РФ), который содержит реагенты для амплификации участка гена KRAS, включающего 12 и 13 кодоны. Амплификация происходит в присутствии олигонуклеотида, имеющего последовательность 12 и 13 кодонов KRAS дикого типа и поэтому связывающегося преимущественно с ДНК без мутации, что приводит к ингибированию амплификации ДНК дикого типа и увеличению амплификации ДНК с мутацией [5]. Благодаря обогащению му-тантным аллелем в ходе ПЦР становится возможным детектировать мутацию при ее содержании в образце ДНК более 5 % (данные будут опубликованы дополнительно). Продукты амплификации очищали, используя набор реагентов QIA quick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия), и далее проводили секвенирующую реакцию, используя набор реагентов Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Продукты секве-нирующей реакции очищали с помощью набора реагентов Dye Ex2.0 Spin Kit (Qiagen, Германия) и далее анализировали на автоматическом секве-наторе 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
Данное исследование соответствует гуманистическим и этическим нормам (Хельсинкская декларация, 2000, Директивы Европейского Сообщества 86/609 ЕС), о чем имеется заключение комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ МББ» СО РАМН от 23.10.2012.
Результаты и обсуждение
В данной работе мутации в генах KRAS и BRAF анализировали с помощью высокочувствительного метода ас-рв ПЦР с использованием наборов «KRAS-7M» и «BRAF-V600E». Наборы содержат несколько пар аллель-специфичных праймеров. Такие праймеры на своем 3'-конце содержат последовательность, специфичную к исследуемому ал-лелю дикого типа или мутантному аллелю, а также TaqMan-зонд для детекции сигнала амплификации в режиме реального времени. При тестировании образцов ДНК со специфичными к мутации прай-мерами кривая амплификации появляется только при наличии в образце ДНК с мутацией. Если об-
Дикий тип Мутация 12 и 13 кодона
Мутация О^ Мутация О^ Мутация О12С Мутация О12А Мутация О12Б Мутация О^ Мутация От Всего
разец ДНК не содержит мутации, то эффективность амплификации снижается, что приводит к отсутствию кривой или ее отставанию от кривой ДНК с мутацией на 5 и более циклов. Такой метод анализа мутаций позволяет детектировать мутации в генах KRAS и BRAF с чувствительностью 1-5 %. Подтверждение результатов ПЦР проводили с помощью секвенирования по Сэнгеру. В данной работе для увеличения чувствительности метода был использован набор реагентов «KRAS-HiSenSeq», который позволяет проводить амплификацию участка гена KRAS с обогащением мутантным аллелем, что увеличивает чувствительность метода до 5 %.
Среди исследованных 80 образцов РТПК содержание опухолевых клеток после макродиссекции составляло 5-80 %. В 5 (6 %) случаях опухолевых клеток в образцах было менее 20 %. Возможно, эти образцы не могут быть корректно генотипированы даже после макродиссекции при использовании традиционных методов секвенирования, однако генотипирование таких образцов вполне возможно с использованием в работе методов повышенной чувствительности.
В данной работе все 80 образцов ДНК РТПК были протестированы на мутации в 12 и 13 кодонах гена KRAS с помощью ас-рв ПЦР. Для всех образцов получены данные секвенирования участка гена с 12 и 13 кодонами KRAS для подтверждения результатов ПЦР. В итоге активирующие мутации KRAS обнаружены в 37 (46 %) случаях РТПК (таблица). Из 5 образцов с низким содержанием опухолевых клеток мутация была обнаружена в 2 случаях. При анализе таких образцов традиционным секвенированием по Сэнгеру могли быть получены ложноотрицательные результаты.
Наиболее часто встречающимися мутациями являются О13Б (15 %) и О12Б (13 %), что согласуется с исследованиями частот мутаций KRAS в других странах [5, 9, 20]. В исследованной выборке не было обнаружено случаев с мутацией KRASG12R. По данным исследований в других странах, частота этой мутации составляет 1-2 % [9, 20]. Образец ДНК из РТПК № 62, полученный из замороженного опухолевого материала, содер-
43 (54 %) 37 (46 %)
10 (13 %) 5 (6 %) 4 (5 %) 3 (4 %) 2 (3 %) 12 (15 %) 1 (1 %) 80 (100 %)
таблица
результаты анализа образцов ртпк на мутации в гене KRAS
Аллель KRAS Количество образцов
жал одновременно две мутации: G12V и G13D. Возможно, наличие одновременно двух мутаций связано с гетерогенностью опухоли вследствие поликлональности, где присутствует несколько клеточных популяций с разным генетическим профилем [6]. Образец ДНК N° 39 содержал мутацию KRASG13R, которая была выявлена с помощью секвенирования по Сэнгеру, но не была определена методом ас-рв ПЦР, так как в наборе реактивов «KRAS-7M» не предусмотрена соответствующая аллель-специфическая реакция для детекции этой мутации. Поэтому для обнаружения всех редких вариантов мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS может быть рекомендовано секвенирование ДНК по Сэнгеру с обогащением мутантным аллелем.
В более ранних исследованиях показано, что около 10 % образцов могут иметь расхождения в результатах анализа при тестировании обычным секвенированием по Сэнгеру и более чувствительными методами [10]. В нашем исследовании не было расхождений результатов анализа мутаций в гене KRAS для выборки из 80 образцов благодаря использованию высокочувствительных методов анализа.
Все 80 образцов ДНК из РТПК были протестированы на наличие мутации BRAFV600E методом ас-рв ПЦР. Частота мутации составила 3,8 % (3/80), что согласуется с недавним исследованием в российской популяции, где частота составила 2,7 % (5/195) [21], однако несколько ниже
ЛИТЕРАТУРА
1. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М., 2013. С. 1-15.
2. Кит О.И., Водолажский Д.И., Двадненко К.В., Гудуева Е.Н., Кутилин Д.С., ГеворкянЮ.А., ВладимироваЛ.Ю. Частота мутаций в гене KRAS в различных клинических группах пациентов юга России с колоректальным раком // Медицинская генетика. 2014. Т. 13, № 12 (150). С. 35-41.
3. Мазуренко Н.Н., Гагарин И.М., Цыганова И.В., Мочальнико-ва В.В., Бредер В.В., Горбунова В.А. Частота и спектр мутаций KRAS в метастатическом колоректальном раке // Вопросы онкологии. 2013. Т. 59, № 6. С. 751-755.
4. ШубинВ.П., ПоспеховаН.И., Цуканов А.С., РыбаковЕ.Г., Панина М.В., Сушков О.И., Ачкасов С.И., Жданкина С.Н., Кашников В.Н., Фролов С.А., Шелыгин Ю.А. Частота и спектр мутаций в гене KRAS при роке толстой кишки разной локализации и раке анального канала // Медицинская генетика. 2014. Т.13, № 5 (143). С. 31-35.
5. Arcila M., Lau C., Nafa K., Ladanyi M. Detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal carcinoma roles for high-sensitivity locked nucleic acid-PCR sequencing and broad-spectrum mass spectrometry genotyping // J. Mol. Diagn. 2011. Vol. 13 (1). P. 64-73. doi: 10.1016/j. jmoldx.2010.11.005.
6. Blanco-Calvo M., Concha A., Figueroa A., Garrido F., Valladares-Ayerbes M. Colorectal Cancer Classification and Cell Heterogeneity: A Systems Oncology Approach // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16 (6). P. 13610-13632. doi: 10.3390/ijms160613610.
7. DeRoock W., ClaesB., BernasconiD., De Schutter J., BiesmansB., FountzilasG., KalogerasK.T., Kotoula V., PapamichaelD., Laurent-PuigP., Penault-Llorca F., Rougier P., Vincenzi B., Santini D., Tonini G., Cap-puzzo F., Frattini M., Molinari F., Saletti P., De Dosso S., Martini M., Bardelli A., Siena S., Sartore-Bianchi A., Tabernero J., Macarulla T., Di Fiore F., Gangloff A.O., Ciardiello F., Pfeiffer P., Qvortrup C., Hansen T.P., Van Cutsem E., Piessevaux H., Lambrechts D., Delorenzi M., Tejpar S. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory meta-static colorectal cancer: a retrospective consortium analysis // Lancet Oncol. 2010. Vol. 11 (8). P. 753-762. doi: 10.1016/S1470-2045(10)70130-3.
частоты мутации BRAFV600E, обнаруженной в других странах [7, 8, 12, 17]. Образец РТПК № 10 при тестировании оказался положительным на мутацию KRASG13D и BRAFV600E. В других исследованиях таких случаев обнаружено не было, и поэтому предполагалось, что мутации KRAS и BRAF являются взаимоисключающими [3]. Возможно, это связано с низкой частотой мутаций BRAF при РТПК и поэтому невысокой вероятностью появления опухоли одновременно с двумя мутациями KRAS и BRAF. Кроме того, нельзя исключать и ложноотрицательные результаты, полученные из-за недостаточной чувствительности используемых методов анализа.
Заключение
Проведен анализ 80 образцов РТПК на мутации 12 и 13 кодонов гена KRAS и мутацию BRAFV600E с помощью высокочувствительных методов ас-рв ПЦР и секвенирования по Сэнгеру с обогащением мутантным аллелем. Данные тестирования образцов двумя высокочувствительными методами совпали в 100 % случаев для 7 наиболее частых мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS. Частота мутаций для мутаций в гене KRAS составила 46 %, для BRAF - 3,8 %. Полученные данные согласуются с исследованиями в других странах. В исследовании впервые обнаружен образец, одновременно содержащий мутации KRASG13D и BRAFV600E.
8. Di Nicolantonio F., Martini M., Molinari F., Sartore-Bianchi A., Arena S., Saletti P., De Dosso S., Mazzucchelli L., Frattini M., Siena S., Bardelli A. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer // J. Clin. Oncol. 2008. Vol. 26 (35). P. 5705-5712. doi: 10.1200/jc0.2008.18.0786.
9. Jakovljevic K., Malisic E., Cavic M., Krivokuca A., Dobricic J., JankovicR. KRAS and BRAF mutations in Serbian patients with colorectal cancer // J. BUON. 2012. Vol. 17 (3). P. 575-580.
10. Jancik S., Drabek J., Berkovcova J., Xu Y.Z., Stankova M., Klein J., Kolek V., Skarda J., Tichy T., Grygarkova I., Radzioch D., HajduchM. A comparison of Direct sequencing, Pyrosequencing, High resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras StripAssay for detecting KRAS mutations in non small cell lung carcinomas // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2012. Vol. 31. P. 79. doi: 10.1186/1756-9966-31-79.
11. Jean G.W., Shah S.R. Epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies for the treatment of metastatic colorectal cancer // Pharmacotherapy. 2008. Vol. 28 (6). P. 742-754. doi: 10.1592/phco.28.6.742.
12. Laurent-Puig P., Cayre A., Manceau G., Buc E., Bachet J.B., Lecomte T., Rougier P., Lievre A., Landi B., Boige V., DucreuxM., Ychou M., Bibeau F., Bouché O., Reid J., Stone S., Penault-Llorca F. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer // J. Clin. Oncol. 2009. Vol. 27 (35). P. 5924-5930. doi: 10.1200/JC0.2008.21.6796.
13. Lièvre A., Bachet J.B., Le Corre D., Boige V., Landi B., Emile J.F., Côté J.F., Tomasic G., Penna C., Ducreux M., Rougier P., Penault-Llorca F., Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer // Cancer Res. 2006. Vol. 66 (8). P. 3992-3995.
14. Milbury C.A., Li J., Makrigiorgos G.M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations // Clin. Chem. 2009. Vol. 55 (4). P. 632-640. doi: 10.1373/clinchem.2008.113035.
15. Pisareva E., Gutkina N., Kovalenko S., Kuehnapfel S., Hartmann A., Heinzerling L., Schneider-Stock R., Lyubchenko L., Shamanin V.A. Sensitive allele-specific real-time PCR test for mutations in BRAF codon V600 in skin melanoma // Melanoma Res. 2014. Vol. 24 (4). P. 322-331. doi: 10.1097/CMR.0000000000000090.
16. Porebska I., Harlozinska A., Bojarowski T. Expression of the tyrosine kinase activity growth factor receptors (EGFR., ERB B2., ERB
B3) in colorectal adenocarcinomas and adenomas // Tumour Biol. 2000. Vol. 21 (2). P. 105-115.
17. Samowitz W.S., Sweeney C., Herrick J., Albertsen H., Levin T.R., Murtaugh M.A., Wolff R.K., Slattery M.L. Poor Survival Associated with the BRAF V600E Mutation in Microsatellite-Stable Colon Cancers // Cancer Res. 2005. Vol. 65 (14). P. 6063-6069.
18. TsiatisA.C., Norris-KirbyA., RichR.G., HafezM.J., Gocke C.D., Eshleman J.R., Murphy K.M. Comparison of Sanger sequencing., pyrose-quencing., and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12 (4). P. 425-432. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090188.
19. van Krieken J.H., Jung A., Kirchner T., Carneiro F., Seruca R., Bosman F.T., Quirke P., Fléjou J.F., Plato Hansen T., de Hertogh G., Jares P., Langner C., Hoefler G., Ligtenberg M., Tiniakos D., Tejpar S., Bevilacqua G., Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response
to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program // Virchows Arch. 2008. Vol. 453 (5). P. 417-431. doi: 10.1007/s00428-008-0665-y.
20. WangD, Liang W, DuanX., Liu L, ShenH, Peng Y, Li B. Detection of KRAS gene mutations in colorectal carcinoma: a study of 6 364 patients // Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 2014. Vol. 43 (9). P. 583-587.
21. Y anus GA, Belyaeva A,V, Ivantsov AO,, Kuligina E,Sh, Suspit-sinEN,, MitiushkinaN, V',, Aleksakhina SN,, IyevlevaAG, Zaitseva OA, Yatsuk O,S, Gorodnova TV, Strelkova TN, Efremova SA, LepenchukAY, Ochir-Garyaev AN, PaneyahMB, MatskoD,E, Togo A, V, ImyanitovEN, Pattern of clinically relevant mutations in consecutive series of Russian colorectal cancer patients // Med. Oncol. 2013. Vol. 30 (3). P. 686. doi: 10.1007/s12032-013-0686-5.
Поступила 23.07.15.
Принята в печать 10.12.15.
сведения об авторах
Key words: real-time pcR, sanger sequencing, colorectal cancer, mutations, KRAS, BRAF.
Писарева Екатерина Евгеньевна, младший научный сотрудник лаборатории генно-инженерных методов исследования, НИИ молекулярной биологии и биофизики (г. Новосибирск, Российская Федерация). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 7151-5842.
Любченко Людмила Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией клинической онкогене-тики НИИ клинической онкологии Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина (г. Москва, Российская Федерация). E-mail: [email protected]. AuthorlD: 140311.
Коваленко Сергей Петрович, доктор биологических наук, заведующий лабораторией генно-инженерных методов исследования НИИ молекулярной биологии и биофизики (г. Новосибирск, Российская Федерация). E-mail: [email protected]. SPIN-код: 2272-6747.
Шаманин Владимир Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории инженерных методов исследования НИИ молекулярной биологии и биофизики (г. Новосибирск, Российская Федерация). E-mail: shamanin@ niimbb.ru. SPIN-код: 5669-0201.
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки / конфликта интересов, о котором необходимо сообщить
analysis of mutations IN KRAS AND BRAF GENEs in colorectal cancer in Russian patients
E.E. pisareva1, L.N. Ljubchenko2, s.p. Kovalenko1, v.A. shamanin1
Institute of Molecular Biology and Biophysics, SB RAMS, Novosibirsk1
Russian Cancer Research Center memory of N.N. Blokhin, Moscow2
2/12, Timakova Street, 630117-Novosibirsk, Russia, e-mail: [email protected]
Mutations in KRAS and BRAF genes in 80 colorectal cancer (CRC) samples from Russian patients were tested using two methods: 1) allele-specific real-time PCR (as-rt PCR) and 2) wild-type blocking PCR with Sanger sequencing (WTBS). Material and methods. Sections of fresh frozen or formalin-fixed paraffin embedded tumor tissue from 80 patients were used in the study. Tumor tissue content was determined on H&E stained sections. Samples were first tested by as-rtPCR for common mutations of the KRAS gene (G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D) and mutations BRAFV600E. After that samples were evaluated in PCR with oligonucleotide blocking amplification of wild-type DNA for enrichment with mutant allele followed by Sanger sequencing of the PCR DNA (WTBS method). Results. In 5 (6.3 %) cases samples had low tumor tissue content (<20 %). In reconstruction experiments both methods detected 1-5 % mutant allele. Mutations of KRAS and BRAF genes were found in 37 (46 %) and 3 (3.8 %) of the clinical cases, respectively. Classification in to wild-type and mutant samples by both methods was in agreement in 79 (98.8 %) cases. A single case with rare mutation KRASG13R was detected by WTBS, but was missed by as-rtPCR since this mutation is not included in the test. Of note, KRAS mutations were detected by both tests in two cases with low tumor content. Two cases were found with multiple mutations: one with KRASG12V and G13D, and one with KRASG13D and BRAFV600E. Conclusion. The frequency of mutations in CRC was 46 % for mutations in the KRAS gene, and 3.8 % for the BRAF. We showed 98.8% agreement in KRAS mutation detection by sensitive Sanger sequencing and as-rt PCR. The data on the frequencies of mutations are in agreement with studies in other countries. This in the first study to discover CRC case with multiple mutations KRASG13D and BRAFV600E.
REFERENCES
1. Malignancies in Russia in 2011 (morbidity and mortality) / Ed. V.I. Chissov, V.V. Starinskiy, G.V. Petrov. M., 2013. P. 1-15. [ in Russian]
2. Kit O.I., Vodolazhskij D.I., Dvadnenko K.V., Gudueva E.N., Kuti-lin D.S., Gevorkjan Ju.A., Vladimirova L.Ju. The frequency of mutations in KRAS in different clinical groups of patients with colorectal cancer of the south of Russia // Medicinskaja genetika. 2014. Vol. 13, № 12 (150). P. 35-41. [in Russian]
3.MazurenkoN.N., GagarinI.M., CyganovaI.V., Mochal'nikova V.V., Breder V.V., Gorbunova V.A. The frequency and spectrum of mutations in KRAS in metastatic colorectal cancer // Voprosy onkologii. 2013. Vol. 59 (6). P. 751-755. [in Russian]
4. Shubin V.P., Pospehova N.I., Cukanov A.S., Rybakov E.G., Pani-na M.V., Sushkov O.I., Achkasov S.I., Zhdankina S.N., Kashnikov V.N., Frolov S.A., Shelygin Ju.A. The frequency and spectrum of mutations in the KRAS gene in colon cancer and cancer of different localization of the anal canal // Medicinskaja genetika. 2014. Vol. 13, № 5 (143). P. 31-35. [in Russian]
5. Arcila M., Lau C., Nafa K., Ladanyi M. Detection of KRAS and BRAF mutations in colorectal carcinoma roles for high-sensitivity locked nucleic acid-PCR sequencing and broad-spectrum mass spectrometry genotyping // J. Mol. Diagn. 2011. Vol. 13 (1). P. 64-73. doi: 10.1016/j. jmoldx.2010.11.005.
6. Blanco-Calvo M., Concha A., Figueroa A., Garrido F., Valladares-Ayerbes M. Colorectal Cancer Classification and Cell Heterogeneity: A Systems Oncology Approach // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol. 16 (6). P. 13610-13632. doi: 10.3390/ijms160613610.
7. De Roock W., Claes B., Bernasconi D., De Schutter J., Biesmans B., Fountzilas G., Kalogeras K.T., Kotoula V., Papamichael D., Laurent-Puig P., Penault-Llorca F., Rougier P., Vincenzi B., Santini D., Tonini G., Cappuzzo F., Frattini M., Molinari F., Saletti P., De Dosso S., Martini M., Bardelli A., Siena S., Sartore-Bianchi A., Tabernero J., Macarulla T., Di Fiore F., Gangloff A.O., Ciardiello F., Pfeiffer P., Qvortrup C., Hansen T.P., Van Cutsem E., Piessevaux H., Lambrechts D., Delorenzi M., Tejpar S. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory meta-static colorectal cancer: a retrospective consortium analysis // Lancet Oncol. 2010. Vol. 11 (8). P. 753-762. doi: 10.1016/S1470-2045(10)70130-3.
8. Di Nicolantonio F., Martini M., Molinari F., Sartore-Bianchi A., Arena S., Saletti P., De Dosso S., Mazzucchelli L., Frattini M., Siena S., Bardelli A. Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer // J. Clin. Oncol. 2008. Vol. 26 (35). P. 5705-5712. doi: 10.1200/Jœ.2008.18.0786.
9. Jakovljevic K., Malisic E., Cavic M., Krivokuca A., Dobricic J., JankovicR. KRAS and BRAF mutations in Serbian patients with colorectal cancer // J. BUON. 2012. Vol. 17 (3). P. 575-580.
10. JancikS., Drabek J., Berkovcova J., Xu Y.Z., StankovaM., Klein J., Kolek V., Skarda J., Tichy T., Grygarkova I., Radzioch D., Hajduch M. A comparison of Direct sequencing, Pyrosequencing, High resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras StripAssay for detecting KRAS mutations in non small cell lung carcinomas // J. Exp. Clin. Cancer Res. 2012. Vol. 31. P. 79. doi: 10.1186/1756-9966-31-79.
11. Jean G.W., Shah S.R. Epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies for the treatment of metastatic colorectal cancer // Pharmacotherapy. 2008. Vol. 28 (6). P. 742-754. doi: 10.1592/phco.28.6.742.
12. Laurent-Puig P., Cayre A., Manceau G., Buc E., Bachet J.B., Lecomte T., Rougier P., Lievre A., Landi B., Boige V., DucreuxM., Ychou M., Bibeau F., Bouché O., Reid J., Stone S., Penault-Llorca F. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer // J. Clin. Oncol. 2009. Vol. 27 (35). P. 5924-5930. doi: 10.1200/JC0.2008.21.6796.
13. Lièvre A., Bachet J.B., Le Corre D., Boige V., Landi B., Emile J.F., Côté J.F., Tomasic G., Penna C., Ducreux M., Rougier P., Penault-Llorca F., Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer // Cancer Res. 2006. Vol. 66 (8). P. 3992-3995.
14. Milbury C.A., Li J., Makrigiorgos G.M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations // Clin. Chem. 2009. Vol. 55 (4). P. 632-640. doi: 10.1373/clinchem.2008.113035.
15. Pisareva E., Gutkina N., Kovalenko S., Kuehnapfel S., Hartmann A., Heinzerling L., Schneider-Stock R., Lyubchenko L., Shamanin V.A. Sensitive allele-specific real-time PCR test for mutations in BRAF codon V600 in skin melanoma // Melanoma Res. 2014. Vol. 24 (4). P. 322-331. doi: 10.1097/CMR.0000000000000090.
16. Porebska I., Harlozinska A., Bojarowski T. Expression of the tyrosine kinase activity growth factor receptors (EGFR., ERB B2., ERB B3) in colorectal adenocarcinomas and adenomas // Tumour Biol. 2000. Vol. 21 (2). P. 105-115.
17. Samowitz W.S., Sweeney C., Herrick J., Albertsen H., Levin T.R., MurtaughM.A., Wolff R.K., SlatteryM.L. Poor Survival Associated with the BRAF V600E Mutation in Microsatellite-Stable Colon Cancers // Cancer Res. 2005. Vol. 65 (14). P. 6063-6069.
18. TsiatisA.C., Norris-KirbyA., RichR.G., HafezM.J., Gocke C.D., Eshleman J.R., Murphy K.M. Comparison of Sanger sequencing., pyrosequencing., and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12 (4). P. 425-432. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090188.
19. van Krieken J.H., Jung A., Kirchner T., Carneiro F., Seruca R., Bosman F.T., Quirke P., Fléjou J.F., Plato Hansen T., de Hertogh G., Jares P., Langner C., Hoefler G., Ligtenberg M., Tiniakos D., Tejpar S., Bevilacqua G., Ensari A. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European quality assurance program // Virchows Arch. 2008. Vol. 453 (5). P. 417-431. doi: 10.1007/s00428-008-0665-y.
20. WangD., Liang W., DuanX., Liu L., Shen H., Peng Y., Li B. Detection of KRAS gene mutations in colorectal carcinoma: a study of 6 364 patients // Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 2014. Vol. 43 (9). P. 583-587.
21. Yanus G.A., Belyaeva A.V., Ivantsov A.O., Kuligina E.Sh., Suspit-sinE.N., MitiushkinaN. V., AleksakhinaS.N., IyevlevaA.G., ZaitsevaO.A., Yatsuk O.S., Gorodnova T.V., Strelkova T.N., Efremova S.A., Lepenchuk A.Y., Ochir-Garyaev A.N., PaneyahM.B., MatskoD.E., Togo A. V., ImyanitovE.N. Pattern of clinically relevant mutations in consecutive series of Russian colorectal cancer patients // Med. Oncol. 2013. Vol. 30 (3). P. 686. doi: 10.1007/s12032-013-0686-5.
Received 23.07.15. Accepted 10.12.15.
about the authors
Pisareva Ekaterina E., Junior Researcher, Genetic engineering laboratory, Institute of Molecular Biology and Biophysics (Novosibirsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 7151-5842.
Ljubchenko Ljudmila N., MD, DSc, Professor, Head of the Laboratory of clinical oncogenetics, Russian Cancer Research Center memory of N.N. Blokhin (Moscow, Russia). E-mail: [email protected]. AuthorlD: 140311.
Kovalenko Sergej P., PhD, Head of the Genetic engineering laboratory, Institute of Molecular Biology and Biophysics (Novosibirsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 2272-6747.
Shamanin Vladimir A., PhD, Senior Researcher, Genetic engineering laboratory, Institute of Molecular Biology and Biophysics (Novosibirsk, Russia). E-mail: [email protected]. SPIN-code: 5669-0201.
Authors declare lack of the possible conflicts of interests
