CC BY
50
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 177-181
УДК: 611.81+616-091.8+577
АНАЛИЗ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СТРУКТУР ГОЛОВНОГО МОЗГА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ ПРОТОНАМИ В ОТДАЛЕННЫЙ ПЕРИОД
И.А. КОЛЕСНИКОВА*,**, Н.Н. БУДЕННАЯ*,**, Ю.С. СЕВЕРЮХИН*,**, К.Н.ЛЯХОВА*,**, Д.М. УТИНА*,**
*Объединенный институт ядерных исследований, ул. Жолио-Кюри, д. 6, Дубна, Московская область, 161980, Россия "Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Московской области
«Университет «Дубна», ул. Университетская, д. 19, Дубна, Московская область, 141982, Россия,
e-mail: innakolesnikova@jinr.ru
Аннотация. Изучение биологических эффектов воздействия ионизирующих излучений на организм в различные периоды после облучения является важным направлением для решения задач космической биологии. Кроме того, рост популярности применения протонной терапии для лечения онкологических заболеваний в различных отделах мозга делает актуальным анализ и прогнозирование постлучевых поражений центральной нервной системы. В данной работе проведен анализ морфологических изменений в различных структурах головного мозга крыс, оценены возможные нарушения поведенческих реакций после облучения протонами. Эксперимент был проведен на самцах крыс линии Sprague Dawley, возраста 6,5-7,5 недель. Животные были подвергнуты облучению протонами в кранио-каудальном направлении в дозе 1Гр с энергией 171МэВ на выведенном протонном пучке Фазотрона ОИЯИ. Изучение поведенческих реакций было выполнено на установке «Открытое поле» (ООО «НПК Открытая наука»). Декапитация животных и извлечение биологического материала для морфологического исследования центральной нервной системы проводились на 30 и 90 сутки после облучения. Был проведен количественный анализ разреженности клеток Пуркинье в мозжечке, а также морфологических изменений нейронов гиппокампа. В работе была выявлена динамика развития структурных изменений нейронов после облучения протонами в различные сроки после воздействия. По результатам морфологического анализа было выявлено статистически значимое снижение плотности клеток Пуркинье на 30 стуки у облученных животных. Количество нейронов гиппо-кампа с морфофункциональными изменениями у облученных животных статистически значимо превышало число клеток с теми же изменениями у контрольной группы как на 30, так и на 90 сутки после облучения. Количество клеток без видимых морфологических изменений в контроле больше, чем у облученных крыс.
Ключевые слова: протоны, ионизирующее излучение, нейроны, гиппокамп, мозжечок, крысы.
Введение. Среди факторов, представляющих высокую опасность при осуществлении пилотируемых полётов в дальний космос, является космическая радиация. При анализе радиобиологических эффектов космической радиации следует иметь в виду наличие в составе солнечных космических лучей (СКЛ) протонов различных энергий. При увеличении солнечной активности и появлении «солнечных вспышек», а так же при проведении членами экипажа космического корабля работ в открытом космосе радиационная нагрузка на космонавтов может существенно увеличиваться. Это обстоятельство может привести к появлению синдромов, принципиально отличных от тех, которые наблюдаются при действии редкоио-низирующих излучений. Прежде всего, необходимо иметь в виду возможное формирование нарушений со стороны центральной нервной системы (ЦНС), которые могут вызвать нару-
шения операторской деятельности экипажа непосредственно во время полета, что в свою очередь ставит под угрозу выполнение всей космической миссии. С учетом этого, при решении задач, стоящих перед космической радиобиологией, необходимы модельные исследования морфо-функциональных нарушений в различных отделах ЦНС экспериментальных животных при действии излучений разного качества.
Известно, что через 3 месяца после облучения изменения ЦНС проявляются в выраженных нарушениях пространственной ориентации, угнетении когнитивных функций [6]. Авторы связывают эти нарушения не только с гибелью нейронов (прежде всего, в гиппокам-пе, как наиболее уязвимой в этом случае структуры ЦНС) [Rabin et al., 2004; Britten et al., 2012]. Действие ионизирующего излучения на ЦНС вызывает комплекс сложных биохимических и
морфофизиологических реакций. Среди структур старой коры головного мозга особый интерес представляет гиппокамп. Это полимодальная структура, то есть выполняющая множество различных функций. Он отвечает за процесс обучения, формирования кратковременной и долговременной памяти, а при взаимодействии с другими отделами отвечает за формирование эмоций. Гиппокамп выделяет и удерживает в потоке внешних стимулов важную информацию, то есть выполняет ту же функцию, что оперативная память компьютера.
Возможные морфологические и функциональные нарушения в нейронах гиппокампа в ходе космического полета ставят под угрозу вероятность успешного выполнения миссии.
Не менее важной структурой, является мозжечок, участвующий в реализации процессов координации и регуляции произвольных и непроизвольных движений, вегетативных и поведенческих функций [10]. Основным структурным элементом коры мозжечка являются крупные эфферентные нейроны ганглионарно-го слоя - клетки Пуркинье. На них проецируются практически все виды сенсорных раздражений: кожные, зрительные, слуховые, вестибулярные и др. [4].
Цель исследования - изучение влияния ионизирующего излучения - протонов 171МэВ в дозе 1Гр на поведенческие реакции экспериментальных животных и выявление морфологических изменений в гиппокампе и мозжечке в разные сроки после воздействия.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проведен на 39 самцах аутбредных крыс Sprague Dawley линии, возраста 6,5-7,5 недель. Животные были разделены на 2 группы: интактный контроль и группа, облученная на фазотроне ОИЯИ протонами в дозе 1 Гр.
Все исследования над животными проводили с соблюдением всех требований и правил биоэтики содержания лабораторных животных в условиях вивария, установленных в ГНЦ РФ ИМБП РАН.
Животные были протестированы на установке «Открытое поле» [13,14] на 30 и 90 сутки после облучения. Каждое животное тестировалось 6 минут. В ходе эксперимента были посчитаны показатели (в первые три минуты и последующие три минуты) эмоционального статуса (ЭС). Для определения ЭС животных учитывали сумму параметров: груминг, замирания и движения на месте. Для оценки ориентировочно-исследовательской поведенческой реакции (ОИР) у крыс использовали сумму па-
раметров: сектора, центр, норки (заглядывание в круглое отверстие пола камеры), стойки с упором и без упора. Статистическая обработка проведена в программе Microsoft Excel, статистическая значимость рассчитывали по критерию Стьюдента. Результаты считали статистически значимыми при р^0,05.
Декапитация животных была проведена на 30 и 90 сутки после облучения. Обработка биологического материала и приготовление препаратов проходила в соответствии со стандартной гистологической техникой [2]. Гистологические срезы окрашивались крезил-виолетом по методу Ниссля.
Для оценки степени тяжести структурных нарушений в нейронах гиппокампа крыс использована количественная методика оценки морфологических изменений клеток [7]. В препарате от каждого животного анализировали все клетки гиппокампа полей CA1, CA2, CA3. В зависимости от степени структурных нарушений выделяли группы клеток: неизмененные и измененные нейроны (легкоизмененные и дистрофические) [12]. В мозжечке был посчитан показатель разреженности клеток Пуркинье, для этого в препаратах от каждого животного в 50 полях зрения посчитано полное количество клеток Пуркинье. Полученные материалы статистически обработали в программе Past3. Статистическую значимость рассчитывали с помощью критерия Манна-Уитни. Результаты считали статистически значимыми при р^0,05.
Результаты и их обсуждение. При облучении протонами произошли значительные изменения поведения у облученных крыс. Важно учитывать, что поведение животных в первые 3 минуты тестирования связано с такими эмоцио-генными факторами, как внезапность, необычность и новизна. В дальнейшем оно переходит в поведение патрулирования, которое внешне не отличается от первоначального, но имеет иные нейрохимические механизмы [3].
Наблюдения показали, что после облучения протонами в дозе 1Гр на 30-е сутки произошло значительное уменьшение ОИР с 1 по 3 минуты у облученных крыс; по отношению к группе контроля показатель ОИР выше; ЭС отличается незначительно (рис.1). На 90-е сутки у облученных животных наблюдались более высокие показатели ОИР и ЭС по отношению к контролю в первые три минуты. В следующие три минуты показатель ОИР оставался выше, чем в контрольной группе, но снизился относительно первых трех минут. Показатель ЭС у облученных животных в период с 4 по 6 минуты
Таблица 1
Результаты количественного анализа морфологических изменений нейронов, 30 сутки, %
Группы Нейроны без видимых изменений Нейроны с различными типами изменений
Контрольная группа 53,3±4,07 27,5±2,90
Облученные протонами 29,9±3,66* 39,7±4,50*
увеличился по отношению к первым трем минутам (рис. 2).
Проведенный качественный и количественный анализ морфологического состояния нейронов выявил, что на 30-е и 90-е сутки количество функционально-измененных нейронов у облученных животных превышает число таких клеток у необлученных (табл. 1, 2). В мозжечке облученных животных наблюдается разреженность клеток Пуркинье на 30-е сутки (рис. 3).
ОПР
S» -
60 -=-
4« --
U i идя 6Ш1
пртшны 171 МэВ 1 ГрЗО Котроль
cmnmto
ЭС
Рис. 1. Результаты теста «Открытое поле» на 30-е сутки
ОИР
70 <А
\ I I =
прогсчш 17] МэВ 1 Гр90 Контроль
СуПЯ н о
ЭС
V 4
I I
I Т1 МЛ 1 Гр9(1 к"ЫГ|КШ
чн''ть." а о
Рис. 2. Результаты теста «Открытое поле» на 90-е сутки
0 О П
3 i 3 t
Рис. 3. Разреженность клеток Пуркинье в мозжечке на 30-е и 90-е сутки
Примечание: * - Статистически значимые различия с группой биоконтроля (критерий Манна-Уитни, р^0,05)
Таблица 2
Результаты количественного анализа морфологических изменений нейронов, 90 сутки, %
Полученные нами результаты в проведенном эксперименте согласуются с данными из литературных источников. У облученных животных число морфологически-измененных нейронов (гипо- и умеренно-гиперхромных) и дистрофических у крыс, подвергавшихся воздействию протонов, больше, чем у интактных животных. В разные сроки после облучения у животных наблюдались отличия в поведении по сравнению с контрольной группой. Облученные животные находились в более эмоционально напряженном состоянии.
На 30 и 90 сутки облученные крысы проявляли большую исследовательскую активность и были более подвижны по отношению к контрольной группе.
Заключение. В результате исследования показано действие протонов на ЦНС: видны как изменения на поведенческом уровне (увеличение показателя ОИР как на 30, так и на 90 сутки после облучения, увеличение ЭС в долгосрочном периоде), так и нарушения на клеточном уровне: стабильное превалирование числа измененных нейронов у облученных животных в разные сроки.
Группы Нейроны без видимых изменений Нейроны с различными типами изменений
Контрольная группа 49,6±4,74 29,1±3,44
Облученные протонами 32,4±4,21* 43,6±5,30*
Примечание: * - Статистически значимые различия с группой биоконтроля (критерий Манна-Уитни, р^0,05)
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 177-181
Морфологическое исследование полей СА1, СА2, СА3 полей гиппокампа показало статистические различия соотношения нормохром-ных нейронов к числу нейронов с нарушениями разных типов как на 30, так и на 90 сутки. При подсчете показателя разреженности клеток Пуркинье мозжечка статистически значимым было снижение показателя у облученных животных на 30 сутки.
Представленные результаты нейроморфо-логических исследований разных структур центральной нервной системы подтверждают гипотезы об опасности космического излучения для мозга. По результатам полученных
данных видно, что изменения в поведенческих реакциях облученных животных сопровождаются нарушениями в морфологии нейронов. Это наблюдение позволяет предположить возможную корреляцию между структурными и поведенческими нарушениями у животных, подвергшихся облучению.
Проведенное в данной работе исследование дает важную информацию о влиянии излучения на ЦНС в разные сроки после облучения, что является одной из основных задач космической биологии и медицины в связи с планированием пилотируемых полётов за пределами околоземной орбиты.
ANALYSIS OF MORPHOFUNCTIONAL STATE OF EXPERIMENTAL ANIMALS BRAIN FIELDS UNDER
PROTON IRRADIATION OVER THE LONG PERIOD
I.A. KOLESNIKOVA*", N.N. BUDENNAY*", YU.S. SEVERIUKHIN"*, K.N. LYAKHOVA*", D.M. UTINA"*
* Joint Institute for Nuclear Research, Joliot-Curie Str., 6, Dubna, Moscow oblast, 161980, Russia ** State Budgetary Educational Institution of Higher Education of Moscow region "University "Dubna", 19 Universitetskaya Str., Dubna, Moscow region, 141982, Russia, e-mail: innakolesnikova@jinr.ru
Abstract. A study of the biological effects of ionizing radiation on the body at different time periods after irradiation is a topical theme for solving the problems of space biology as the flight to Mars is under preparation now. Furthermore, the growing popularity of the use of proton therapy for cancer/oncology treatment in different parts of the brain makes it relevant to analyze and predict post-radial lesions of the central nervous system (CNS). This research is devoted to the analysis of CNS functional disorders in rat brains, possible violations of behavioral reactions after proton irradiation were evaluated. The experiment is carried out with Sprague Dawley male rats at the age of 6.5-7.5 weeks and the experimental animals are irradiated by protons with 1Gr with the energy of 171MeV by proton beam of the JINR Phasotron. The animals are tested by special behavioral tests which are called Open field. The decapitation of experimental animals is performed and the biological material for morphological study was taken 30 and 90 days after the irradiation. The quantitative analysis of rarefied cells of the Purkinje in cerebellum was performed; furthermore the hippocampus is investigated for finding the neurons with damage. As a result of morphofunctuonal analysis the statistically significant decrease in the density of Purkinje cells on the 30th day was investigated. The number of hippocampal neurons with morphofunctional changes in irradiated animals statistically significantly exceeded the number of cells with the same changes in the control group on both the 30th and 90th days after irradiation. The number of normochromic neurons in the control group of animals is higher than in the irradiated group.
Key words: protons, ionizing radiation, neurons, hippocampus, cerebellum, rats.
Литература
1. Афанасьев Р.В., Гундарова О.П., Ильичева В.Н., Маслов Н.В. Отдаленные структурно-функциональные эффекты в головном мозге после воздействия ионизирующего излучения в малых дозах // Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. Т. 23, № 3. С. 116117.
2. Буденная Н.Н., Федоренко Б.С., Петров В.М. Методика определения цитоморфологических изменений в нейронах головного мозга и внутренних органов лабораторных животных, 1992. -
References
1. Afanas'ev RV, Gundarova OP, Il'icheva VN, Mas-lov NV. Otdalennye strukturno-funkcional'nye ehf-fekty v golovnom mozge posle vozdejstviya ionizi-ruyushchego izlucheniya v malyh dozah [Distant structural and functional effects in the brain after exposure to ionizing radiation in small doses]. Vest-nik Rossijskoj voenno-medicinskoj akademii. 2008;23(3):116-7. Russian.
2. Budennaya NN, Fedorenko BS, Petrov VM. Meto-dika opredeleniya citomorfologicheskih izmenenij v nejronah golovnogo mozga i vnutrennih organov la-bo-ratornyh zhivotnyh; 1992. - №I - I04 - 7 - 92.
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2018 - V. 25, № 3 - P. 177-181
№1 - 104 - 7 - 92. С. 1-9.
3. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. Высш. шк, 1991. 400 с.
4. Давыдова И. Секреты мозга. Эксмо, 2010. 320 с.
5. Ильичева В.Н., Ушаков Б.Н. Анализ морфо-функциональных состояния различных отделов коры головного мозга при действии ионизирую -щего излучения // Вестник новых медицинских технологий. 2012. №2. С. 338.
6. Исследованиям V. VII съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) Москва, 21-24 октября 2014 года. Москва, 2014. Т. 21. С. 11.
7. Ташкэ К. Введение в количественную цито-гистологическую морфологию, издательство академии социалистической республики Румынии, 1980. С. 191
8. Установка «Открытое Поле» [Электронный ресурс] / ОрепБйепсе: современное оборудование для работы с животными. 2004. Режим доступа: http://www.openscience.ru/index. php?page=ts&item=001, дата обращения: 10.05.18.
9. Федоренко Б.С. Радиобиологические эффекты корпускулярных излучений. Москва: Наука, 2006. С. 6-17, 25-38.
10. Хомутов А.Е., Кульба С.Н. Анатомия Центральной Нервной Системы. М.: Феникс, 2010. 308 с.
11. Ярмоненко С.П., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных / Под ред. СП Ярмоненко, 2004. 549 с.
12. Garman R.H. Histology of the central nervous system // Toxicologic pathology. 2011. T. 39, № 1. P. 22-35.
Russian.
3. Buresh YA. Metodiki i osnovnye ehksperimenty po izucheniyu mozga i povedeniya [Methods and basic experiments in the study of brain and behavior]. Vyssh. SHk; 1991. Russian.
4. Davydova I. Sekrety mozga [The secrets of the brain]. EHksmo; 2010. Russian.
5. Il'icheva VN, Ushakov BN. Analiz morfofunk-cional'nyh sostoyaniya razlichnyh otdelov kory go-lovnogo mozga pri dejstvii ioniziruyushchego izlu-cheniya [Analysis of morphofunctional state of various parts of the cerebral cortex under the action of ionizing radiation]. Vestnik novyh medicinskih tekh-nologij. 2012;2:338. Russian.
6. Issledovaniyam V. VII s"ezd po radiacionnym issledovaniyam (radiobiologiya, radioehkologiya, ra-diacionnaya bezopasnost') Moskva, 21-24 oktyabrya 2014 goda [Research V. VII Congress on radiation-onnym research (radiobiology, RA-Geoekologiya, radiation safety), Moscow, 21-24 October 2014]. Moscow; 2014. Vol. 21. Russian.
7. Tashkeh K. Vvedenie v kolichestvennuyu cito-gistologicheskuyu morfologiyu, izdatel'stvo akademii socialisticheskoj respubliki Rumynii [Introduction to quantitative CITO-histological morphology, publishing house of the Academy of the socialist Republic of Romania]; 1980. Russian.
8. Installation "open Field" [Electronic resource] / OpenScience: modern equipment for working with animals. 2004. Mode of access: http://www.openscience.ru/index. php?page=ts&item=001 date of access: 10.05.18.
9. Fedorenko BS. Radiobiologicheskie ehffekty kor-puskulyarnyh izluchenij [Radiobiological effects of corpuscular radiation]. Moscow: Nauka; 2006. Russian.
10. Homutov AE, Kul'ba SN. Anatomiya Central'noj Nervnoj Sistemy [Anatomy Of The Central Nervous System]. Moscow: Feniks; 2010. Russian.
11. YArmonenko SP, Vajnson AA. Radiobiologiya cheloveka i zhivotnyh. Pod red. SP YArmonenko [Radiobiology of humans and animals. Under the ed. JV Yarmonenko]; 2004. Russian.
12. Garman RH. Histology of the central nervous system. Toxicologic pathology. 2011;39(1):22-35.
13. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. I. Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality // Journal of Comparative Psychology. 1934. T. 18, № 3. P. 385.
14. Hall C.S. Emotional behavior in the rat. III. The relationship between emotionality and ambulatory activity // Journal of Comparative Psychology. 1936. T. 22, № 3. P. 345.
13. Hall CS. Emotional behavior in the rat. I. Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality. Journal of Comparative Psychology. 1934;18(3):385.
14. Hall CS. Emotional behavior in the rat. III. The relationship between emotionality and ambulatory activity. Journal of Comparative Psychology. 1936;22(3):345.
