CC BY
481 ЕЗ^ДЯД ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Анализ микробиома слизистой оболочки носоглотки у детей с хроническим аденоидитом и экссудативным средним отитом
Е.П. Карпова^1'2, А.В. Гуров34, К.Ю. Бурлакова1'2
1ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва, Россия;
2ГБУЗ «Детская городская клиническая больница им. З.А. Башляевой», Москва, Россия;
3ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия;
4ГБУЗ «Научно-исследовательский клинический институт оториноларингологии им. Л.И. Свержевского» Департамента здравоохранения г. Москвы, Москва, Россия
Аннотация
Роль патологии глоточной миндалины в развитии экссудативного среднего отита (ЭСО) в настоящее время обсуждается. ЭСО - это заболевание среднего уха, для которого характерно скопление экссудата за барабанной перепонкой при отсутствии перфорации в течение 3 мес или дольше, приводящее к снижению слуха, что увеличивает риск задержки формирования правильной речи у ребенка и поведенческих проблем. Вопрос о развитии ЭСО ввиду наличия инфекционного очага в глоточной миндалине и дальнейшего распространения на слуховую трубу неоднозначен. В некоторых работах рассматриваются возможное распространение воспалительного процесса на евстахиеву трубу при длительном сохранении в структуре лим-фоидной ткани патогенных микроорганизмов, что характерно для персистирующих вирусных инфекций, и дальнейшее развитие ЭСО. Слизистую оболочку носоглотки заселяет множество микроорганизмов: представителей индигенной микробиоты, условно-патогенной и патогенной. Цель. Изучить структуру микробиома слизистой оболочки носоглотки у детей с хроническим аденоидитом (ХА) и ЭСО.
Материалы и методы. В исследование включены 174 ребенка с ХА и ЭСО (114 мальчиков и 60 девочек) в возрасте от 3 до 14 лет (6,9±0,5 года). Всем детям проведен сбор анамнеза заболевания, жалоб ребенка (или его родителей), стандартный ЛОР-осмотр, включающий эндоскопию полости носа и носоглотки, тимпанометрию и полногеномное секвенирование NGS мазков из носоглотки. Оценку клинической эффективности проводили согласно полученным объективным данным и данным визуально-аналоговой шкалы по 5-балльной системе, которую заполняли дети и их родители, где 0 баллов - отсутствие симптома, 1 балл - слабо выраженный симптом или непостоянный, 2 балла - умеренно выраженный симптом, 3 балла - выраженный симптом, 4 балла - сильно выраженный симптом или постоянный, и микробиологических данных: на 10-е сутки, через 1 мес, через 3 мес. Результаты. Описаны основные микроорганизмы слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО разных возрастных групп, а также изменения структуры микробиоты в зависимости от вида консервативной терапии.
Заключение. При лечении детей с ХА и ЭСО необходимо учитывать особенности нормальной микробиоты слизистой оболочки носоглотки; важно понимать, что, воздействуя на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, необходимо помнить о создании благоприятных условий для стимуляции роста и развития представителей индигенной микробиоты, что, в свою очередь, будет способствовать скорейшему выздоровлению пациента и отсутствию рецидивов в дальнейшем.
Ключевые слова: экссудативный средний отит, хронический аденоидит, микробиом, микробиота, полногеномное секвенирование, микроорганизмы Для цитирования: Карпова Е.П., Гуров А.В., Бурлакова К.Ю. Анализ микробиома слизистой оболочки носоглотки у детей с хроническим аденоидитом и экссудативным средним отитом. Педиатрия. Consilium Medicum. 2021; 1: 39-45. DOI: 10.26442/26586630.2021.1.200737
ORIGINAL ARTICLE
Analysis of the mucous microbiome of the nasopharynx in children with chronic adenoiditis and otitis media of effusion
Elena P. Karpova^12, Aleksandr V. Gurov34, Kseniia Yu. Burlakova12 'Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Moscow, Russia; 2Bashlyaeva Children's City Clinical Hospital, Moscow, Russia; 3Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia; 4Sverzhevsky Research Clinical Institute of Otorhinolaryngology, Moscow, Russia
Abstract
The role of pathology of the adenoid in the development of otitis media of effusion (OME) is currently being discussed. OME is a disease of the middle ear, which is characterized by the accumulation of exudate behind the tympanic membrane in the absence of perforation for three months or longer, leading to hearing loss, increasing the risk of delayed formation of correct speech in the child and behavioral problems. The question of the development of OME, in view of the presence of an infectious focus in the adenoid and further spread to the auditory tube, is ambiguous. In some works, the possible spread of the inflam-
Информация об авторах / Information about the authors
нКарпова Елена Петровна - д-р мед. наук, проф., каф. детской оториноларингологии ФГБОУ ДПО РМАНПО, ГБУЗ «ДГКБ им. З.А. Башляевой». E-mail: edoctor@mail.ru; ORCID: 0000-0002-8292-9635
Гуров Александр Владимирович - д-р мед. наук, проф. каф. оториноларингологии им. акад. Б.С. Преображенского лечебного фак-та, каф. микробиологии и вирусологии педиатрического фак-та ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова», ГБУЗ НИКИО им. Л.И. Свержевского. E-mail: Alex9999@inbox.ru
Бурлакова Ксения Юрьевна - аспирант каф. детской оториноларингологии ФГБОУ ДПО РМАНПО, ГБУЗ «ДГКБ им. З.А. Башляевой». E-mail: ks386@yandex.ru; ORCID: 0000-0002-9079-3985
MElena P. Karpova - D. Sci. (Med.), Prof., Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Bashlyaeva Children's City Clinical Hospital. E-mail: edoctor@mail.ru; ORCID: 0000-0002-8292-9635
Aleksandr V. Gurov - D. Sci. (Med.), Prof., Pirogov Russian National Research Medical University, Sverzhevsky Research Clinical Institute of Otorhinolaryngology. E-mail: Alex9999@inbox.ru
Kseniia Yu. Burlakova - Graduate Student, Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Bashlyaeva Children's City Clinical Hospital. E-mail: ks386@yandex.ru; ORCID: 0000-0002-9079-3985
matory process to the Eustachian tube with long-term preservation of pathogenic microorganisms in the structure of the lymphoid tissue, which is characteristic of persistent viral infections, and the further development of OME are considered. The mucous membrane of the nasopharynx is inhabited by many microorganisms: representatives of an indigenous microbiota, opportunistic and pathogenic.
Aim. To study the microbiome of the mucous membrane of the nasopharynx and middle ear in children with chronic adenoiditis (CA) and OME. Materials and methods. The study included 174 children with OME and CA (114 boys and 60 girls) aged 3 to 14 years (6.9±0.5 years). We have developed a staged diagnostic algorithm, including the collection of a life history, illness and complaints of the child (or his parents), as well as ENT examination, endoscopy of the nasopharynx, otoendoscopy, audiological examination, microbiological examination by real time PCR, whole genome sequencing NGS. Results. The main microorganisms of the nasopharyngeal mucosa in children with CA and OME of different age groups are described.
Conclusion. In the treatment of children with CA and OME, it is necessary to take into account the features of the normal microbiota of the nasopharynx; it is important to understand that by acting on opportunistic and pathogenic microorganisms, it is necessary to remember to create favorable conditions for stimulating the growth and development of representatives of the indigenic microbiota, which in turn will contribute to the patient's speedy recovery and absence of relapses in the future.
Keywords: otitis media effusion, chronic adenoiditis, microbiome, microbiota, genome sequencing, microorganisms
For citation: Karpova EP, Gurov AV, Burlakova KYu. Analysis of the mucous microbiome of the nasopharynx in children with chronic adenoiditis and otitis media of effusion. Pediatrics. Consilium Medicum. 2021; 1: 39-45. DOI: 10.26442/26586630.2021.1.200737
Введение
Слизистую оболочку носоглотки заселяет множество микроорганизмов: представители индигенной микробиоты, транзиторные условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Микробиотой называют совокупность всех живых микроорганизмов, которые представлены в определенной анатомической области. Постоянство состава мик-робиоты слизистой оболочки носоглотки с превалирующим количеством индигенных микроорганизмов, характерных для данного биотопа, обусловливает колонизационную резистентность слизистой оболочки и формирует устойчивость к инфекционным агентам, попадающим на ее поверхность извне. Количественные и качественные изменения, развивающиеся в составе микробиоты, приводят к нарушению баланса микроорганизмов и влекут за собой воспалительный процесс. Термином «микробиом» в современной микробиологии принято обозначать совокупность всех генов микроорганизмов, колонизирующих структуру определенного биотопа. Доказано, что микробиом формируется внутриутробно, и первые микробные сообщества, приобретенные при родах, в последующем определяют становление структуры бактериальных ассоциаций в нормальных биопленках и их постоянства [1].
В 2012 г. изучен и описан полный состав и разнообразие микробиомов пяти анатомических ниш человеческого организма (кишечник, кожа, носовая полость, полость рта, влагалище; Human Microbiome Project Consortium, 2012). В настоящее время существует наибольшее количество научных публикаций, посвященных кишечному микробиому. Согласно обзору литературных данных, на развитие мик-робиома влияют следующие факторы: способ родоразре-шения, вид вскармливания, сроки введения прикорма [1].
Одной из первых формируется микробиота носоглотки, сразу после рождения ребенка. При воздействии неблагоприятных факторов - развитие острых респираторных вирусных инфекций или применение антибактериальных препаратов - структура микробиома меняется. Количество индигенных микроорганизмов прогрессивно уменьшается, а условно-патогенных и патогенных микроорганизмов -возрастает [2]. Постоянство количественного и качественного состава микроорганизмов оказывает влияние на состояние слизистой оболочки носоглотки и способствует поддержанию адекватного иммунного ответа [3, 4]. Важнейшую роль в этом процессе играет глоточная миндалина [5].
В носоглотке в физиологических условиях находится множество микроорганизмов. Большинство представлено бактериями (аэробы и анаэробы), в меньшем количестве -вирусы и грибы [6]. Гипертрофия лимфоидной ткани глотки и носоглотки в детском возрасте рассматривается как ответ на респираторную антигенную вирусно-бактери-альную нагрузку [7]. В настоящее время активно обсужда-
ется роль патологии глоточной миндалины в развитии экс-судативного среднего отита (ЭСО). ЭСО - это заболевание среднего уха, для которого характерно скопление экссудата за барабанной перепонкой при отсутствии перфорации в течение 3 мес или дольше [7], приводящее к снижению слуха, увеличивая риск задержки формирования правильной речи у ребенка и поведенческих проблем [8, 9]. Вопрос о развитии ЭСО ввиду наличия инфекционного очага в глоточной миндалине и дальнейшего распространения на слуховую трубу неоднозначен [8, 10-12]. В некоторых работах рассматриваются возможное распространение воспалительного процесса на евстахиеву трубу при длительном сохранении в структуре лимфоидной ткани патогенных микроорганизмов, что характерно для персисти-рующих вирусных инфекций, и дальнейшее развитие ЭСО [8, 10-13].
При бактериологическом анализе экссудата барабанной полости и микробиологическом исследовании методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме real time не обнаруживаются патогенные микроорганизмы в экссудате среднего уха. Одним из возможных объяснений данного факта является то, что микроорганизмы, принимающие участие в развитии данной патологии, склонны к формированию биопленок или к внутриклеточному персистирова-нию. Однако с появлением современных высокомолекулярных методов исследования - полногеномного секвенирова-ния - появляется возможность идентифицировать более широкий спектр микроорганизмов и анализировать целые вирусно-бактериальные сообщества («микробиом») путем анализа нуклеотидных последовательностей микроорганизмов [14]. Большая часть метагеномных исследований, в том числе и исследования микробиомов, выполняется с помощью анализа гена прокариот 16S рРНК. Длина этого гена -1500 пар нуклеотидов, он состоит из девяти вариабельных районов, чередующихся с консервативными областями. Анализ вариабельных районов гена 16S рРНК позволяет проводить филогенетическую классификацию дивергентных микробных популяций до рода и вида. Исследования по изучению микробиома слизистой оболочки носоглотки у пациентов с хроническим аденоидитом (ХА) и ЭСО и влияние изменений в микробиоме на развитие ЭСО появились недавно, но показали разные результаты [14, 15].
В исследовании I. Brook и соавт. описан состав микро-биоты слизистой оболочки носоглотки у детей с воспалительной патологией носоглотки и у здоровых, при этом выявлено, что состав микробиоты одинаков в обеих группах, однако количественное соотношение разное. Так, у здоровых детей количество транзиторных микроорганизмов достоверно ниже. Кроме того, авторами доказано присутствие в носоглотке здоровых детей таких микроорганизмов, как гемолитические и негемолитические Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Neisse-
ria, Corynebacterium, Veillonella, Bacteroides, Actinomi-ces, Mycoplasma [16]. Роль подавляющего большинства данных микроорганизмов в развитии воспалительных заболеваний носоглотки и полости среднего уха до конца не изучена и требует дальнейшего изучения [17]. При этом согласно ряду исследований состав микроорганизмов слизистой оболочки определенного биотопа у здоровых детей имеет более разнообразный родовой и видовой состав, чем у детей с воспалительной патологией слизистой оболочки [18].
Цель исследования - изучить структуру микробиома слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
• проанализировать особенности микробиома слизистой оболочки носоглотки с учетом возрастных особенностей у детей с ХА и ЭСО;
• изучить характер изменения микробиома носоглотки в зависимости от вида консервативного лечения.
Материалы и методы
В исследование включены 174 ребенка с ЭСО и ХА (114 мальчиков и 60 девочек) в возрасте от 3 до 14 лет (6,9±0,5 года). Дети распределены по группам согласно схеме возрастной периодизации.
Критерии включения: дети с диагнозом ХА и ЭСО, отсутствие обострений ХА и антибиотикотерапии в анамнезе не менее 3 мес, подписанное законным представителем ребенка информированное согласие на участие в исследовании.
Критерии исключения: дети с тяжелой сопутствующей соматической патологией; с острыми клиническими проявлениями воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей; отказ законного представителя от участия в клиническом исследовании.
Анализ возрастных особенностей ЭСО, ассоциированного с ХА, проведен по схеме возрастной периодизации: 3-6 лет (группа дошкольного возраста) - 89 (51%) детей, 7-10 (группа детей младшего школьного возраста) -53 (31%) ребенка, 11-14 лет (группа старшего школьного возраста) - 32 (18%) ребенка.
Всем детям проведен сбор анамнеза заболевания, жалоб ребенка (или его родителей), стандартный ЛОР-осмотр, включающий эндоскопию полости носа и носоглотки, тим-панометрию и полногеномное секвенирование NGS мазков из носоглотки - это единственный метод высокомолекулярной диагностики, позволяющий изучить микробиом и проанализировать дисбиотические изменения микробиоты, происходящие в наблюдаемом биотопе.
Оценку клинической эффективности проводили согласно полученным объективным данным и данным визуально-аналоговой шкалы (ВАШ) по 5-балльной системе, которую заполняли дети и их родители, где 0 баллов - отсутствие симптома, 1 балл - слабо выраженный симптом или непостоянный, 2 балла - умеренно выраженный симптом, 3 балла - выраженный симптом, 4 балла - сильно выраженный симптом или постоянный, и микробиологических данных: на 10-е сутки, через 1 мес, через 3 мес.
Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью компьютерной программы Statistica 10.0, с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Разницу считали статистически значимой при p<0,05.
Взятие мазка проводили сухим стерильным тупфером Transwab с тонким удлиненным тампоном 2-Swab®, извлеченным из индивидуальной упаковки. Тупфер вводили по общему носовому ходу вдоль нижнего края нижней носовой раковины до носоглотки, что позволило избежать кон-
Рис. 1. Электрофорез амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК некоторых образцов мазков и носоглотки. Fig. 1. Electrophoresis of amplified fragments of 16S rRNA genes of some samples of smears and nasopharynx.
Рис. 2. Электрофорез индексированных для NGS фрагментов генов 16S рРНК некоторых образцов мазков и носоглотки. Fig. 2. Electrophoresis of NGS-indexed fragments of 16S rRNA genes of some samples of smears and nasopharynx.
Рис. 3. Степень гипертрофии глоточной миндалины по результатам эндоскопического исследования носоглотки у детей с ХА и ЭСО (n=174).
Fig. 3. The degree of hypertrophy of the pharyngeal tonsil according to the results of endoscopic examination of the nasopharynx in children with chronic adenoiditis and exudative otitis media (n=174).
3-я группа (11-14 лет)
2-я группа (7-11 лет)
1-я группа (3-6 лет)
□ 1-я степень
□ 2-я степень
□ 3-я степень
—I—
20
—I—
40
—I—
60
—I—
80
таминации микроорганизмами, вегетирующих на слизистой оболочке полости носа. Взятый материал помещали в стерильную 2 мл пробирку, которую помещали в стерильный индивидуальный zip-пакет. Образцы хранили при -80°С и доставляли в лабораторию.
I этап - выделение ДНК из образцов мазков носоглотки и эксудатов из среднего уха производили с помощью DNeasy-Blood&Tissue Kit (Qiagen) согласно протоколу из описания к набору. Выделения проводились группами от 2 до 10 образцов. После выделения концентрацию ДНК измеряли с помощью Qubit dsDNA HS assay на приборе Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific).
II этап - ПЦР. ПЦР для наработки фрагментов генов 16S рРНК ставили со следующими типами праймеров:
16S-IL460 for TCg-TCg-gCA-gCg-TCA-gAT-gTg-TAT-AAg-AgA-CAg-CCT-ACg-gg(A/C/G/T)-ggC-(A/T)gC-Ag
16S-IL460 rev gTC-TCg-Tgg-gCT-Cgg-AgA-TgT-gTA- TAA-gAg-ACA-gAC-TAC- (A/C/T)(A/C/G)g-ggT-ATC-TAA-TCC
0
100
Среднее значение количества микроорганизмов в мазке со слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА, ассоциированным с ЭСО (n=174) The average value of the number of microorganisms in a smear from the nasopharyngeal mucosa in children with chronic adenoiditis associated with exudative otitis media (n=174)
Микроорганизмы 1-я группа (3-6 лет) 2-я группа (7-11 лет) 3-я группа (>11 лет)
Lactobacillus 984±31 3118±55 483±22
Bacillus 0 32±5 26±5
Flavobacterium 1058±32 1132±33 785±28
Corynebacterium 759±27 638±25 437±20
Bifidobacterium 64±8 0 <5
Selenomona <1 <1 56±7
Eubacterium 14±3 0 37±6
Stenotrophomonas 87±9 79±9 69±8
Streptococcus ssp. 317±17 532±23 108±10
Dolosigranulum 74±8 39±6 <5
Actinobacillus 92±9 35±6 0
Neisseri 19±4 53±7 <5
Prevotella 16±4 14±3 8±2
Moraxella 357±18 561±23 75±8
Haemophilus 273±16 164±12 58±7
Fusobacterium 36±6 42±6 17±4
Pseudomonas 3±1 4±2 0
Staphylococcus 293±17 315±17 54±7
Streptococcus spp. 135±11 118±10 97±9
Bacteroides 0 <1 <1
Clostridium 162±24 0 0
Actinomyces 132±11 0 15±3
Escherichia-Shigella 24±4 17±4 0
Rhodoluna 0 0 <1
Enterococcus <1 319±17 364±19
Ruminococcus 185±13 167±13 159±12
Candida 53±7 251±15 62±7
Propionobacterium 75±8 <1 26±5
Peptostreptococcus 883±29 917±30 947±30
Всего 6122 8547 3883
Каждый цикл амплификации (Eppendorf Nexus X2® Master Cycle) включал: 95°C - 14 с; 57°C - 25 с; 72°C -30 c. Максимальное число циклов для исследуемых образцов - 36, для отрицательных контролей - 40. Оценку результатов проводили методом электрофореза (рис. 1).
Индексирование образцов ПЦР (введение последовательностей, необходимых для секвенирования с помощью NGS) проводили с помощью ре-ПЦР с индексными прай-мерами после предварительного разведения ампликона в 500 раз (рис. 2).
Каждый цикл амплификации (Eppendorf Nexus X2® Master Cycle) включал: 95°C - 14 с; 57°C - 25 с; 72°C -30 c. Максимальное количество циклов - 16.
В случае разницы между исследуемым образцом и отрицательным контролем менее 3 циклов (по сумме двух ПЦР) достоверность результатов снижается и требуются тщательное сопоставление и анализ данных секвенирования исследуемого образца и отрицательного контроля. В данной работе это 1 образец.
III этап - секвенирование и анализ данных. Из полученных ПЦР продуктов формировались эквимолярные пулы, которые секвенировали на приборах Illumina MiSeq и HiSeq 1500.
Анализ данных высокопроизводительного секвенирова-ния проводили путем картирования прочтений (ридов) сек-венатора на базу данных 16S РНК SILVA (версия 132, обновление - апрель 2018, https://www.arb-silva.de/) с помо-
щью программы bowtie2 (версия 2.3.4.3) и последующего анализа распределения прочтений по организмам с помощью пакета программ samtools (версия 1.6) и специально разработанного программного обеспечения (скриптов). Определение микроорганизмов проводили до вида, а при невозможности такого определения (вследствие недостаточной глубины покрытия или отсутствия соответствующего вида в базе данных) - до рода. Выходные данные представлены в формате текстовых файлов.
Результаты
Согласно данным эндоскопии носоглотки установлено, что наиболее часто диагностируется 2-я степень гипертрофии аденоидов в группе 3-6 и 7-11 лет (рис. 3).
Следующим этапом проанализирован состав микро-биоты слизистой оболочки носоглотки всем детям, включенным в исследование. Идентифицированы основные микроорганизмы, вегетирующие на слизистой оболочке носоглотки у детей с ХА и ЭСО разных возрастных групп.
При помощи метагеномного секвенирования проведен анализ микробиоты слизистой оболочки носоглотки детей с ХА и ЭСО. По результатам данного исследования получены данные о наличии взаимосвязи качественно-количественного состава микробиоты в зависимости от возраста.
При анализе средних значений в младшей возрастной группе (3-6 лет) выявлены небольшое разнообразие видов
микроорганизмов слизистой оболочки носоглотки и средняя общая численность микроорганизмов. При этом выявлены представители как индигенной, так и транзиторной микробиоты.
Среди представителей индигенной микробиоты: Lactobacillus, Corynebacterium, Bifidobacterium, Flavobac-terium, Eubacterium, Selenomona, Dolosigranulum, Streptococcus sрp.
Среди транзиторных микроорганизмов: Actinobacillus, Neisseri, Prevotella, Moraxella, Haemophilus, Fusobac-terium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus sрp., Clostridium, Actinomyces, Escherichia-Shigella, Enterococ-cus, Ruminococcus, Candida, Propionobacterium, Peptostrep-tococcus, Stenotrophomonas.
Наибольшее разнообразие микроорганизмов слизистой оболочки носоглотки выявлено у детей 2-й группы (7-11 лет), что обусловлено определенным возрастным этапом становления иммунных механизмов и наибольшей антигенной стимуляцией структур лимфатического глоточного кольца. Так, у детей 1-й возрастной группы идентифицирована схожая структура микробиоты, с превалирующей численностью большинства представителей инди-генных микроорганизмов (Lactobacillus, Flavobacterium, Bacillus).
В 3-й группе детей установлено относительно высокое разнообразие микроорганизмов при наименьшей их общей численности. Выявлены представители индигенной микро-биоты: Lactobacillus, Corynebacterium, Bifidobacterium, Bacillus, Flavobacterium, Eubacterium, Selenomona, Dolosi-granulum, Streptococcus ssp, Stenotrophomonas; и транзи-торные микроорганизмов: Neisseri, Prevotella, Moraxella, Haemophilus, Fusobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus p, Bacteroides, Rhodoluna, Actinomyces, Ente-rococcus, Ruminococcus, Candida, Propionobacterium, Pep-tostreptococcus, Stenotrophomonas.
Такое разнообразие индигенных микроорганизмов на поверхности слизистой оболочки носоглотки у детей всех возрастных групп обусловлено выполнением ими важных физиологических функций. Слизистая оболочка носоглотки, находясь на ретроназальном пути носового секрета, подвергается постоянному антигенному воздействию, и индигенные микроорганизмы, колонизирующие носоглотку, обусловливают общую колонизационную резистентность.
Дети с ХА и ЭСО, которым проводили консервативное лечение (81 из 174 человек), разделены методом адаптивной рандомизации на 2 группы:
• 1-я группа (основная) - 41 пациент, получавший традиционное консервативное лечение в соответствии с клиническими рекомендациями (клинические рекомендации «Отит средний у детей» Минздрава России, Национальная медицинская ассоциация оториноларингологов, 2016) с включением в схему лечения препарата Лизобакт® (АО «Босналек», Босния и Герцеговина) в возрастной дозировке (детям 3-7 лет по 1 таблетке 3 раза в сутки; детям 7-12 лет по 1 таблетке 4 раза в сутки; детям старше 12 лет по 2 таблетки 3 раза в сутки) курсом 9 дней;
• 2-я группа (контрольная) - 40 пациентов, которые получали традиционное консервативное лечение в соответствии с клиническими рекомендациями (ирригационно-элиминационная терапия, топическая антибактериальная терапия, продувание слуховых труб по Политцеру, пнев-момассаж барабанных перепонок).
При первичном осмотре по данным ВАШ пациенты 1 и 2-й группы исследования не имели статистически достоверного различия между основными симптомами заболевания (p>0,05). На 9-10-й день от начала лечения по данным
ВАШ выраженность нарушения функции носового дыхания оказалась наименьшей у пациентов 1-й группы исследования и составила 1,24±0,4 балла, а во 2-й -1,61±0,4 балла. Выраженность ринореи у пациентов 1-й группы - 0,9±0,3 балла, что имело достоверное различие (p<0,05) по сравнению с пациентами 2-й группы, где данный показатель составил 1,51 ±0,5 балла. Выраженность снижения слуха на 10-й день от начала лечения у пациентов 2-й группы составила 2,75±0,5 балла, во 1-й группе - 1,65±0,5 балла (p<0,05). При анализе показателей ВАШ через 4 нед от начала лечения выраженность затруднения функции носового дыхания составила 0,97±0,4 и 1,48±0,5 (p>0,05). Выраженность выделений из носа оказалась наименьшей у пациентов 1-й группы - 0,6±0,1 балла, у пациентов 2-й группы - 0,95±0,5 балла (p<0,05). Выраженность снижения слуха у пациентов групп исследования: во 2-й группе - 1,8±0,6 балла, в 1-й - 1,36±0,4 балла (p<0,05). При анализе показателей ВАШ через 12 нед от первичного визита выраженность затруднения носового дыхания составила 0,73±0,8; 1,05±0,5 в 1, 2-й группе (p>0,05). Выраженность выделений из носа составила 0,29±0,4 и 0,62±0,4 (p<0,05). Выраженность снижения слуха у пациентов групп исследования: во 2-й группе этот показатель составил 1,15±0,5 балла; в 1-й - 0,61±0,4 балла (p<0,05).
Согласно данным тимпанометрии у всех пациентов, завершивших исследование, при первичном осмотре диагностирован одно- или двусторонний ЭСО. При осмотре на 10-й день от начала лечения полная двусторонняя нормализация функции слуховой трубы и состояния полости среднего уха (тимпанограмма тип А) отмечалась у 6 (15%) пациентов 2-й группы, 23 (56%) пациентов в 1-й группе (p<0,05). При контрольном осмотре через 12 нед наилучшие показатели полного разрешения тубарной дисфункции также отмечали у детей 1-й группы исследования, где двусторонний тип А на тимпанометрии получен в 17 (42,5%) случаев, а у пациентов 2-й группы - 10 (24%) человек (p<0,05).
Таким образом, после проведенного лечения показания к хирургическому лечению составляли в 1-й группе у 23 (57,5%) детей, в то время как во 2-й группе -у 31 (75%), что подтверждает более высокую клиническую эффективность консервативной терапии в 1-й группе пациентов с назначением лизоцимсодержа-щего препарата и снижение необходимости хирургического лечения. При опросе родителей пациентов на завершающем визите удовлетворение состоянием ребенка выразили в 31 (77,5%) случае в 1-й группе, в 19 (46,3%) - во 2-й группе (p<0,05).
Не выявлено ни одного случая нежелательных побочных эффектов, связанных с применением препарата Лизобакт.
Следующим этапом установлены средние значения частот основных доминирующих микроорганизмов слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО до и после консервативного лечения. Так, установлено, что основными доминирующими условно-патогенными (транзитор-ными) микроорганизмами в 1 и 2-й группе явились: Moraxella (83,32%/76,59%), Veillonella (42,31%/30,04%), Prevotella (28,42%/43,64%), Staphylococcus
(68,47%/73,84%), Haemophilus (68,36%/73,42%), Streptococcus (69,87%/67,27%), Neisseria (13,18%/11,24%), Pseudomonas (12,85%/14,21%), Alloicoccus (3,19%/5,12%), Fusobacterium (6,89%/0). Основными доминирующими ин-дигенными микроорганизмов в 1 и 2-й группе явились бактерии родов: Flavobacterium (3,25%/0), Corynebacterium (6,83%/4,64%), Bifidobacteria (1,76%/2,05%), Streptococcus salivarius (4,34%/6,64%), Bacillus (1,47%/2,36%).
При этом установлено, что до начала лечения значения частоты основных доминирующих микроорганизмов в наблюдаемом биотопе у пациентов обеих групп сопоставимы, статистически значимых отличий не выявлено (p>0,05).
По окончании терапии оценка параметров наглядности изменений показала:
• В 1-й группе (основная) после проведенной терапии применительно к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам отмечали уменьшение колонизации слизистой оболочки родами Moraxella - на 83,3%; Veillonella -на 42,31%; Prevotella - на 28,42%; Staphylococcus -на 50,19%; Haemophilus - на 68,36%; Neisseria -на 13,06%; Pseudomonas - на 12,74%; Alloicoccus -на 3,19%; Fusobacterium на 6,29%; а также Streptococcus pneumoniaе на 68,81%.
Среди индигенных микроорганизмов отмечали увеличение колонизации родов Flavobacterium на 20,08%; Corynebacterium - увеличение вида на 40,08%; Lactococcus - на 26,34%; Bifidobacterium - на 23,42%; Lac-tobacillus - на 12,95%; Dolosigranulum - на 3,09%; а также вида S. salivarius на 62,3%.
• Во 2-й группе (контрольная) после проведенной терапии среди условно-патогенных и патогенных микроорганизмов отмечали уменьшение колонизации родами Moraxella - на 40%; Veillonella - на 10%; Prevotella -на 19,96%; Staphylococcus - на 41,02%; Haemophilus -на 17,59%; Neisseria - на 8,06%; Pseudomonas - на 12,8%; Alloicoccus - на 0,5%; Fusobacterium - на 0,6%, уменьшение вида S. pneumoniaе - на 55,42%.
Среди индигенных микроорганизмов отмечали уменьшение представителей рода Corynebacterium на 12,06%; Bifidobacterium - на 1,02%; Lactobacillus на 2,36%; а также вида S. salivarius на 4%.
Обсуждение
Благодаря использованию данного метода высокомолекулярной диагностики нам удалось оценить структуру микробиома и сделать вывод о том, что микробиота слизистой оболочки носоглотки у детей с ХА и ЭСО имеет определенные особенности качественно-количественного состава в зависимости от возраста. Так, отсутствие у детей младшего возраста (3-6 лет) существенного разнообразия родового и видового состава микроорганизмов, вегетирую-щих на поверхности слизистой оболочки носоглотки, и относительно невысокое общее количественное присутствие как индигенных, так и транзиторных бактерий не позволяют исключать влияния данных факторов на формировании ЭСО.
Применение полногеномного секвенирования NGS позволяет достоверно отслеживать все изменения, происходящие в наблюдаемом биотопе, на основании чего можно предполагать наличие определенной взаимосвязи между спецификой родового и видового состава микробиоты и развитием ХА и ЭСО у детей. Так, отсутствие разнообразия в родовом и видовом составе микроорганизмов и высокий удельный вес Haemophilus, Moraxella, Staphylococcus и Pseudomonas в носоглотке могут создавать благоприятные условия для развития патологии среднего уха. Данные микроорганизмы имеют особое значение в формировании хронических изменений в структуре слизистой оболочки, которые закладываются в возрасте 3-6 лет, в то время как более высокие уровни содержания Corynebacterium, Lacto-coccus, Flavobacterium наблюдали у детей более старшего возраста, у которых данная патология наблюдается реже, что согласуется с данными других исследований [18, 19].
Анализируя полученные результаты исследований, нельзя исключать, что условно-патогенные микроорга-
низмы (S. pneumoniae, Haemophilus influenzaе и др.) могут выступать в роли эндогенных патобионтов, которые в определенных условиях (увеличение их количественного состава, действие факторов окружающей среды, состояние макроорганизма и др.) могут вызывать различные формы инфекционных процессов на слизистой оболочке. При этом прямое или опосредованное цитопатическое действие респираторных вирусов является фактором, который обусловливает дальнейшее стойкое бактериальное суперинфицирование штаммами перечисленных выше бактерий [12, 14, 15], Биологические свойства данных микроорганизмов (токсические субстанции, ферменты патоген-ности и др.) принимают непосредственное участие в разрушении эпителиального барьера респираторного тракта [8, 17], снижают мукоцилиарный клиренс. Появление вязкого полисахаридного слизистого секрета является, в свою очередь, предрасполагающим фактором для формирования структуры патологической биопленки [14, 15].
Возникающие дисбиотические изменения, выражающиеся в изменении количественно-качественного состава нормальной микробиоты носоглотки, выражающиеся в увеличении количества транзиторных микроорганизмов, могут увеличивать риск их транслокации через слуховую трубу в полость среднего уха и последующим развитием ЭСО. Тем не менее результаты настоящего исследования не позволяют пока убедительно говорить о безусловной роли данных микроорганизмов в генезе ЭСО. Для этого требуются дополнительные исследования экссудата полости среднего уха с использованием метода полногеномного секвенирования.
В ходе данного исследования установлено, что после проведенного консервативного лечения динамика клинической картины отмечена в обеих группах, однако более выраженная клиническая эффективность и восстановление нормальной микробиоты слизистой оболочки носоглотки отмечены только в основной группе. Вероятно, дисбиоз слизистой оболочки носоглотки с увеличением количества условно-патогенных микроорганизмов у детей с ХА и ЭСО способствует более длительному сохранению воспаления с последующей хронизацией процесса.
Таким образом, восстановление микробиоты верхних дыхательных путей способствует регрессу клинической симптоматики и наступлению выздоровления, снижает риски осложнений ЭСО, а также помогает сократить число пациентов, которым требуется хирургическое лечение. Применение препарата, содержащего лизоцим, является одним из перспективных направлений лечения ХА и ЭСО. По результатам проведенного исследования установлено, что комплексное консервативное лечение с включением в схему препарата лизоцима позволяет повысить клиническую эффективность лечения детей с ХА и ЭСО, сократить необходимость хирургического вмешательства и снизить количество осложнений ЭСО.
Заключение
При лечении детей с ХА и ЭСО необходимо учитывать особенности нормальной микробиоты слизистой оболочки носоглотки; важно понимать, что, воздействуя на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, необходимо помнить о создании благоприятных условий для стимуляции роста и развития представителей индигенной микробиоты, что, в свою очередь, будет способствовать скорейшему выздоровлению пациента и отсутствию рецидивов в дальнейшем.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.
Литература/References
1. Ивашкин В.Т., Ивашкин К.В. Микробиом человека в приложении к клинической практике. Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2017; 27 (6): 4-13 [Ivashkin VT, Ivashkin KV. Mikrobiom cheloveka v prilozhenii k klinicheskoi praktike. Ros. zhurn. gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2017; 27 (6): 4-13 (in Russian)].
2. Плоскирева А.А. У каждого штамма свой эффект, или Предназначение пробиотиков. Участковый педиатр. 2018; 2: 16-7 [Ploskireva AA. U kazhdogo shtamma svoi effekt, ili Prednaznachenie probiotikov. Uchastkovyi pediatr. 2018; 2: 16-7 (in Russian)].
3. Булатова Е.М., Богданова Н.М. Значение кишечной микробиоты и пробиотиков для формирования иммунного ответа и здоровья ребенка. Вопр. соврем. педиатрии. 2010; 6: 37-44 [Bulatova EM, Bogdanova NM. The value of the intestinal microbiota and probiotics to generate an immune response and child health. Voprosy sovremennoj pediatrii. 2010; 6: 37-44 (in Russian)].
4. Бондаренко В.П. Микрофлора человека: норма и патология. Наука в России. 2007; 1: 28-35 [Bondarenko V.P The microflora of the human: health and disease. Nauka v Rossii. 2007; 1: 28-35 (in Russian)].
5. Быкова В.П. Новые аргументы в поддержку органосохраняющего направления при лечении аденоидов у детей. Дет. оториноларингология. 2013; 2: 18-22 [Bykova VP New arguments in support of organpreserving directions in the treatment of adenoids in children. Det. otorinolaringologija. 2013; 2: 18-22 (in Russian)].
6. Извин А.И., Катаева Л.В. Микробный пейзаж слизистой оболочки верхних дыхательных путей в норме и патологии. Вестн. оториноларингологии. 2009; 2: 65-8 [Izvin AI, Kataeva LV. Microbial landscape of the mucous membrane of the upper respiratory tract in health and disease. Vestn. otorinolaringologii. 2009; 2: 65-8 (in Russian)].
7. Рощектаева Ю.А. Клинико-эпидемиологические характеристики экссудативного среднего отита у детей. Вестн. оториноларингологии. 2014; 6: 43-6 [Roshchektaeva IA. The clinical and epidemiological characteristics of exudative otitis media in the child population. Vestn. otorinolaringologii. 2014; 6: 43-6 (in Russian)]. DOI: 10.17116/otorino2014643-46
8. Buzatto GP Tamashiro E, Saturno TH, Prates MC. The pathogens profile in children with otitis media with effusion and adenoid hypertrophy. PLoS One 2017; 12 (2). DOI: 10.1371/journal.pone.0171049
9. De Miguel Martinez I, Ramos Maclas A, et al. Bacterial implication in otitis media with effusion in childhood. Acta Otorrinolaringol Esp 2007; 58 (9): 408-12.
10. Ragland SA, Criss AK. From bacterial killing to immune modulation: Recent insights into the function of lysozyme. PloS Pathog 2017; 13 (9). DOI: 10.1371/journal.ppat.1006512
11. Ngo CC, Massa HM, Thornton RB, Cripps AW. Predominant bacteria detected from the middle ear fluid of children experiencing otitis media: a systematic review. PLoS One 2016; 11: e0150949. pmid: 26953891
12. Карпова Е.П., Тулупов Д.А. О роли различных этиологических факторов в развитии хронической патологии носоглотки у детей. Лечащий врач. 2013; 1: 12-4 [Karpova EP, Tulu-pov DA. On the role of various etiological factors in the development of chronic nasopharyngeal pathology in children. Lechachiy vrach. 2013; 1: 12-4 (in Russian)].
13. Stol K, Verhaegh SJ, Graamans K, et al. Microbial profiling does not differentiate between childhood recurrent acute otitis media and chronic otitis media with effusion. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2013; 77 (4): 488-93.
14. Liu CM, Cosetti MK, Aziz M, et al. The otologic microbiome: a study of the bacterial micro-biota in a pediatric patient with chronic serous otitis media using 16SrRNA gene-based py-rosequencing. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2011; 137: 664-8.
15. Jervis-Bardy J, Rogers GB, Morris PS, et al. The microbiome of otitis media with effusion in Indigenous Australian children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2015; 79: 1548-55.
16. Brook I, Shah K, Jackson W. Microbiology of healthy and diseased adenoids. Laryngoscope 2000; 110 (6): 994-9. DOI: 10.1097/00005537-200006000-00021
17. Marsh RL, Aho C, Beissbarth J, et al. Panel 4: Recent advances in understanding the natural history of the otitis media microbiome and its response to environmental pressures. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2020; 130: 109836. DOI: 10.1016/j.ijporl.2019.109836
18. Kim SK, Hong SJ, Pak KH, et al. Analysis of the Microbiome in the Adenoids of Korean Children with Otitis Media with Effusion. J Int Adv Otol 2019; 15 (3): 379-85. DOI: 10.5152/iao.2019.6650
19. Xu J, Dai W, Liang Q, Ren D. The microbiomes of adenoid and middle ear in children with otitis media with effusion and hypertrophy from a tertiary hospital in China. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2020; 134: 110058. DOI: 10.1016/j.ijporl.2020.110058
Статья поступила в редакцию / The article received: 22.02.2021 Статья принята к печати / The article approved for publication: 30.03.2021
omnidoctor.ru
