CC BY
17
АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ НЕИРИТОГЕНЕЗА И АНГИОГЕНЕЗА В ТКАНЯХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПОСЛЕ РАЗМЕЩЕНИЯ ДЕНТАЛЬНЫХ ТИТАНОВЫХ ИМПЛАНТАТОВ
Головко Александр Иванович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры ортопедической стоматологии Белорусского государственного медицинского университета, Минск
Новаковская С.А.1, Кузнецова Т.Е.1, Рыжковская Е.Л.1, Пашкевич С.Г.1, Семеник И.А.1, Лемеш Р.Г.1
'Лаборатория Центра электронной и световой микроскопии, Государственное научное учреждение «Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси», Минск
Alexander Golovko, PhD, Associate Professor at the Department of Prosthetic Dentistry of the Belarusian State Medical University, Minsk S. Novakovskaya1, T. Kuznetsova1, E. Ryzhkovskaya1, S. Pashkevich1, T. Semenik1, R. Lemesh1 'Laboratory Center for Electron and Light Microscopy, State Scientific Institution «Institute of Physiology
of the National Academy of Sciences of Belarus», Minsk Analysis of the mechanisms of neuritogenesis and angiogenesis in mammalian tissues after placement of dental titanium implants
Цель. Изучить особенности формирования элементов соединительной, нервной ткани и кровеносных сосудов, заполняющих полости дентальных имплантатов через 2 месяца после размещения у млекопитающих.
Материалы и методы. Рассмотрены механизмы нейритогенеза и ангиогенеза после размещения дентальных титановых имплантатов. Для исследования образцов ткани использовали гистологический и гистохимический методы исследования. Метод окрашивания с применением азур 2 - эозина позволяет выявить тучные клетки (идентификация воспалительного экссудата) в тканях. Энзимогистохи-мические методики позволяют определить метаболическое состояние клеток и тканей при помощи выявления активности ферментов углеводно-энергетического обмена. Нейрогистохимические методы исследования используются для определения медиаторной природы нервов в тканях и органах.
Заключение. В эксперименте на животных через 2 месяца заметен прогресс в заполнении пористой структуры имплантатов. То есть спустя 2 месяца после операционных процедур процессы репарации завершаются. Мелкодисперные компоненты удаляются. Результаты исследования позволяют заключить, что на уровне контакта покрытия имплантата и поверхности десны происходит формирование тканей, проникающих и закрепляющихся в полости покрытия. При заполнении имплантатов соединительной тканью процессов отторжения не наблюдается.
Ключевые слова: дентальный титановый имплантат, механизмы нейритогенеза, ангиогенеза.
Современная стоматология. — 2019. — №4. — С. 48-52. Objective. To study the features of the formation of elements of the connective, nervous tissue and blood vessels filling the cavities of dental implants 2 months after placement in animals.
Materials and methods. The mechanisms of neuritogenesis and angiogenesis after the placement of dental titanium implants are considered. For the study of tissue samples, histological and histochemical research methods were used. The staining method using azure 2 - eosin also reveals mast cells (identification of inflammatory exudate) in tissues. Enzymohistochemical methods make it possible to determine the metabolic state of cells and tissues by detecting the activity of carbohydrate-energy metaboiism enzymes. Neurohistochemical research methods are used to determine the mediator nature of nerves in tissues and organs.
Conclusion. In an experiment on animals after 2 months, progress in filling the porous structure of the implants is noticeable. That is, 2 months after surgical procedures, the repair processes are completed. Fine components are removed. The results of the study allow us to conclude that at the level of contact between the implant coating and the gingival surface, tissues are formed that penetrate and become fixed in the coating cavity. When filling the implants with connective tissue, rejection processes are not observed. Keywords: dental titanium implant, mechanisms of neuritogenesis, angiogenesis. Sovremennaya stomatologiya. — 2019. — N4. — P. 48-52.
При лечении частичной адентии применяют съемные и несъемные (мостовидные) виды протезов. Они имеют как преимущества, так и ряд ограничений по использованию. В процессе установки мостовидных протезов требуется значительно сошлифовывать или депульпи-ровать опорные зубы, не показано их применение при дефектах зубных рядов большой протяженности и т.п. Съемные протезы также имеют недостатки: не всегда обеспе-
чивается хорошая фиксация, жевательная эффективность низкая, прогрессирование атрофических процессов костной ткани челюстей приводит к развитию неблагоприятных клинических условий в полости рта. Ортопедическая реабилитация путем применения дентальных имплантатов - выход из ситуации для пациентов с частичной адентией.
Анализ литературных данных свидетельствует, что потеря имплантатов
составляет в сроки до восьми лет от 4 до 15% (Иванов С.Ю., 2013, Олесова В.Н., 2009, Шевела Т.Л., 2017). Следовательно, необходимо четко понимать процессы, происходящие не только на границе «дентальный имплантат - кость», то есть процессы остеоинтеграции, но и на границе «дентальный имплантат -десневые ткани». Это позволит минимизировать частоту постимплантационных осложнений, существенно сократить
Рис. 1. Взаимодействие тканей десны с пористым политетрафторэтиленом: 1 - политетрафторэтилен; 2 - волокна соединительной ткани; 3 - просветы микрососудов; 4 - клетки соединительной ткани. Микрофото. Метод ЛДГ. Ув. х10 (А), Ув. х40 (Б, В, Г).
Рис. 2. Строение десны. Многослойный плоский неороговевающий эпителй (А). Соединительная ткань слизистой оболочки (Б). Микрофото. Окраска азур 2 - эозином. Ув. х10.
Рис. 3. Взаимодействие неоформленной волокнистой соединительной ткани десны с пористым политетрафторэтиленом: 1 - политетрафторэтилен; 2 - неоформленная волокнистая соединительная ткань. Микрофото. Окраска азур 2 - эозином. Ув. х10.
сроки стоматологической реабилитации пациентов.
Цель исследования - изучить особенности формирования элементов соединительной, нервной ткани и кровеносных сосудов, заполняющих полости дентальных имплантатов через 2 месяца после размещения у млекопитающих.
Материалы и методы
Особенности формирования элементов ткани, заполняющих полости дентальных имплантатов
Для исследования образцов ткани применялись гистологический и гистохимический методы исследования.
Гистологические методы исследования применяли для изучения строения и функции клеток и тканей. Срезы толщиной 10 мкм для гистологического исследования приготавливали с помощью криостата и окрашивали азур 2 -эозином. Эта окраска позволила выявить клеточные элементы соединительной ткани. При этом цитоплазма клеток окрашена в различные оттенки синего цвета, ядра клеток темно-синие, зернистость цитоплазмы красится по-разному: оксифильные зерна - светло-красные, базофильные зерна - темно-синие. Метод окрашивания с применением азур 2 - эозина позволяет выявить и тучные клетки (идентификация воспалительного экссудата) в тканях.
Гистохимические методы исследования. Энзимогистохимические методики позволяют определить метаболическое состояние клеток и тканей при помощи выявления активности ферментов углеводно-энергетического обмена. Это метод морфологической диагностики, в основе которого лежит визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов действия ферментов на специфические субстраты в присутствии веществ, с которыми один из продуктов ферментативной реакции образует нерастворимый осадок. Нейрогистохимические методы исследования используются для определения медиаторной природы нервов в тканях и органах.
В эксперименте использовали гистохимический метод выявления цитоплазмати-
Рис. 4. Взаимодействие тканей десны с пористым политетрафторэтиленом: 1 - политетрафторэтилен; 2 - неоформленная волокнистая соединительная ткань; 3 - клетки соединительной ткани. Микрофото. Окраска азур 2 - эозином. Ув. х40.
Рис. 5. Строение десны: 1 - эпителиальный слой; 2 - соединительная ткань слизистой оболочки. Микрофото. Метод АХЭ. Ув. х10.
Рис. 6. Взаимодействие тканей десны с пористым политетрафторэтиленом: 1 - политетрафторэтилен; 2 - неоформленная волокнистая соединительная ткань; 3 - просветы микрососудов; 4 - холинергическое нервное волокно. Микрофото. Метод АХЭ. Ув. х40.
ческого фермента - лактатдегидрогеназы (ЛДГ), маркера анаэробного окисления глюкозы. Активность ЛДГ в криостатных срезах толщиной 15 мкм определяли по методике Лойда, в основе которой лежит применение унифицированного основного раствора, к которому добавляются
растворы соответствующего субстрата и кофермента.
Определение активности ацетилхо-линэстеразы (АХЭ) позволяет судить о наличии медиатора ацетилхолина, который характерен для холинергической (парасимпатической) природы нервных
элементов. АХЭ определяли тиохолино-вым методом по методике M. Karnovsky, L. Roots в криостатных срезах толщиной 15 мкм. Об активности фермента судили по плотности конечного продукта - фер-роцианида меди.
Изучение микропрепаратов и изготовление микрофотографий проводили с помощью светового микроскопа MPV-2 («Leitz», 1ермания) с цифровой фотокамерой «Leica» с программным обеспечением и компьютером.
Оценка ультраструктуры тканей, заполняющих полости дентальных имплантатов
Методом электронной микроскопии исследовали покрытия дентальных им-плантатов. Для исследования полостей покрытий дентальных имплантатов на предмет определения в них живой ткани, отделенные от имплантатов покрытия фиксировали в растворе, состоявшем из 3-процентного глутарового альдегида и 1-процентного параформа, после чего материал измельчали и обрабатывали 2-процентным раствором четырехокиси осмия. После промывания 0,1 М фосфатным буфером материал обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заключали в аралдит по общепринятой методике (Боголепов, 1976). Затем материал измельчали ультрамикротомом фирмы LKB (Швеция) и просматривали в электронном микроскопе JEM-100 CX (Япония).
Результаты и обсуждение
В процессе окрашивания на наличие ЛДГ по результатам эксперимента можно констатировать, что полости покрытия дентальных имплантатов являются условием для врастания тканей раневой поверхности десны, прилежащей к дентальному имплантату (рис. 1).
Результаты окрашивания с использованием азур 2 - эозина представлены на рисунках 2-4. На фотографиях структуры, обладающие ферментативной активностью (ацетилхолинэстераза), окрашиваются в красновато-коричневый цвет (рис. 5, 6).
При оценке ультраструктуры тканей, заполняющих полости дентальных имплантатов, отмечено наличие электронноплот-
Рис. 7. Электронограмма среза покрытия имплантата №2 при увеличении x15000
Рис. 8. Электронограмма среза покрытия имплантата №2 при увеличении x15000
Рис. 9. МНВ - миелинизированное нервное волокно, МНО - миелинизированное нервное окончание, ОД - очаги деструкции, М - митохондрии
Рис. 11. Слизистая оболочка десны. Мф -макрофаг, М - митохондрия
пиллярам с помощью везикул. Еще один способ утилизации мелкодисперсного вещества: выведение со слущивающимися эпителиальными клетками из организма. Макроструктура покрытия имплантата при этом не нарушается. На следующем этапе исследования будут изучены процессы биодеградации и выведения наночастиц в более поздние сроки после размещения имплантатов.
Заключение
Заметен прогресс в заполнении пористой структуры имплантатов, по краю которого формируются волокна соединительной ткани, ближе к центру в порах продолжаются процессы пролиферации.
В биопсийных образцах (п=6), взятых через 2 месяца после размещения дентальных имплантатов, обнаружены клетки соединительной ткани, микрососуды, холинергические нервные волокна. С помощью гистохимических методов исследования выявлено повышение активности ацетилхолинэстеразы, что позволяет судить о наличии медиатора ацетилхолина, который характерен для холинергической (парасимпатической) природы нервных элементов и лактат-дегидрогеназы, маркера анаэробного
Рис. 10. Слизистая оболочка десны. Здесь и на рис. 11. НО - нервное окончание, МНО - миелинизированное нервное окончание, ПК - просвет капилляра, Эр - эритроцит, ОД - очаги деструкции
Рис. 12. Скопления электронноплотного вещества в цитоплазме макрофагов слизистой десны (А, Б)
ных телец, которые предположительно включают частицы титана. Визуализируются клетки и волокна соединительной ткани (рис. 7).
На рисунке 8 визуализирована аккумуляция диссоциированного полимера прилежащими волокнами и цитоплазмой клетки периодонта (1 - волокно, 2 - полимер).
Известно, что митотическая активность клеток соединительного эпителия в несколько раз выше, чем в других участках слизистой оболочки десны. Кроме того, обычно неороговевающий соединительный эпителий в определенных условиях проявляет свои способности к ороговению. Наличие нормальных клеточных структур и очагов деструкции через 2 месяца после размещения
дентальных титановых имплантатов на основе пористой поверхностно-объемной структуры из политетрафторэтилена и армирующего элемента, выполненного из титана (рис. 9-11), свидетельствует о протекании естественных процессов, характерных для здоровых тканей пе-риодонта млекопитающих.
Исследуемая ткань в норме характеризуется повышенным количеством макрофагов. На рисунках 12-13 в цитоплазме макрофагов заметно накопление электронноплотного вещества. В процессе изготовления имплантатов неизбежно присутствие некоторого количества наночастиц титана или политетрафторэтилена. На рисунке 13 видно, что эти частицы аккумулируются в макрофагах, транспортируются к ка-
Рис. 13. Скопления электронноплотного вещества в цитоплазме макрофага (А) и около стенки капилляра в слизистой десны (Б)
окисления глюкозы. На электронограм-мах в ткани периодонта зарегистрировано наличие многочисленных миелиновых нервных волокон и микрососудов, а также макрофагов. Наличие очагов деструкции
свидетельствует о слущивании эпителия. Электронноплотные включения в этих эпителиальных клетках, а также в цитоплазме и ядре макрофагов, в везикулах у стенки капилляров свидетельствуют
о процессах выведения наночастиц титана или политетрафторэтилена, расположенных в порах полимерного покрытия имплантатов.
Таким образом, на второй месяц процессы репарации после операционных процедур завершаются. Мелкодисперные компоненты удаляются. Результаты позволяют заключить, что на уровне контакта покрытия имплан-тата и поверхности десны происходит формирование тканей, проникающих и закрепляющихся в полости покрытия. При заполнении имплантатов соединительной тканью процессов отторжения не наблюдается.
ЛИТЕРАТУРА
1. Головина Е.С., Кузнецова Е.А., Тлустенко В.П. и др. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2014. - Т.16, №6-1. - С.336-341.
2. Денисов С.Д., Морозкина Т.С. // Здравоохранение. - 2001. - №4. - С.40-42.
3. Иванов С.Ю., Мураев А.А., Фомин М.Ю., Дымников А.Б. // Стоматология. -
2013. - №3. - С.38-42.
4. Кулаков А.А., Надточий А.Г., Брайловская Т.В. и др. // Медицинский альманах. - 2015. - №3 (38). - С.178-180.
5. Муллоджанов Г.Э., Ашуров Г.Г. // Вестник последипломного образования в сфере здравоохранения. - 2016. - №1. - С.71-75.
6. Олесова В.Н., Калашников В.Н., Максюков С.Ю. // Российский стоматологический журнал. - 2009. - №6. - С.21-24.
7. Садыков М.И., Шумский А.В., Нестеров А.М., Нестеров Г.М. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №5.- С. 213.
8. Полонейчик Н.М., Мышковец Н.А. Адгезивные мостовидные протезы: Учебно-методическое пособие. - Минск: БГУ 2004. - 16 с.
9. Ушаков А.И., Елизарова Н.О., Ушакова Т.М. // Международный медицинский журнал. - 1998. - №3. - С.250-252.
10. Шевела Т.Л., Наумовец А.А., Зиновенко О.Г. // Современная стоматология. - 2019. - №3. - С.60-62.
11. Щербовских А.Е. Обоснование применения модифицированных дентальных имплантатов на основе нетканого титанового материала со сквозной пористостью (клинико-экспериментальное исследование): Автореф. дис. ... канд. мед.наук. - Самара, 2017. - 24 с.
REFERENCES
1. Golovina Ye.S., Kuznetsova Ye.A., Tlustenko VP. i dr. Rol' kompleksnogo obsledovaniya v diagnostike periimplantatnogo mukozita khronicheskogo techeniya [The role of a comprehensive examination in the diagnosis of chronic peri-implant mucositis]. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra Rossiyskoy akademii nauk,
2014, vol.16, no.6-1, pp.336-341. (in Russian)
2. Denisov S.D., Morozkina T.S. Trebovaniya k nauchnomu eksperimentu s ispol'zovaniyem zhivotnykh [Requirements for a scientific experiment using animals]. Zdravookhraneniye, 2001, vol.4, pp.40-42. (in Russian)
3. Ivanov SYU., Murayev A.A., Fomin MYU., Dymnikov A.B. Primeneniye dental'nykh implantatov v kompleksnom lechenii patsiyentov s mezial'noy okklyuziyey, oslozhnennoy chastichnoy vtorichnoy adentiyey [The use of dental implants in the complex treatment of patients with mesial occlusion complicated by partial secondary adentia]. Stomatologiya, 2013, vol.3, pp.38-42. (in Russian)
4. Kulakov A.A., Nadtochiy A.G., Braylovskaya T.V i dr. Otsenka sostoyaniya al'veolyarnoy kosti vokrug dental'nykh implantatov, ustanovlennykh posle vypolneniya kostnoplasticheskikh operatsiy, po 146 dannym rentgenologicheskogo
analiza [Assessment of the state of the alveolar bone around dental implants installed after performing osteoplastic surgery, according to 146 data of x-ray analysis]. Meditsinskiy a'manakh, 2015, vol.3, no.38, pp.178-180. (in Russian)
5. Mullodzhanov G.E., Ashurov G.G. Analiz sovremennykh vzglyadov na protsessy integratsii dental'nykh implantatov v kostnuyu tkan' [Analysis of modern views on the processes of integration of dental implants in bone tissue]. Vestnik poslediplomnogo obrazovaniya v sfere zdravookhraneniya, 2016, vol.1, pp.71-75. (in Russian)
6. Olesova Vn., Kalashnikov VN., Maksyukov SYu. Oslozhneniya i nedostatki s»yemnykh zubnykh protezov i puti optimizatsii povtornogo protezirovaniya zubov [Complications and disadvantages of removable dentures and ways to optimize repeated prosthetics]. RossyskystomatologicheskiyzhurnaJ, 2009, vol.6, pp.21-24. (in Russian)
7. Sadykov M.I., Shumskiy A.V, Nesterov A.M., Nesterov G.M. Otsenka sostoyaniya mestnogo immuniteta polosti rta u patsiyentov s polnym otsutstviyem zubov [Assessment of the state of local immunity of the oral cavity in patients with complete absence of teeth]. Sovremennyye problemy nauki i obrazovaniya, 2015, vol.5, pp.213. (in Russian)
8. Poloneychik N.M., Myshkovets N.A. Adgezivnyye mostovidnyye protezy: Uchebno-metodicheskoye posobiye [Adhesive bridges]. Minsk: BGU, 2004, 16 s. (in Russian)
9. Ushakov A.I., Yelizarova N.O., Ushakova TM. Stomatologicheskaya implantatsiya. Sovremennoye sostoyaniye problemy [Dental implantation. The current state of the problem]. Mezhdunarodnyy meditsinskiy zhurnal, 1998, vol.3, pp.250-252. (in Russian)
10. Shevela T.L., Naumovets A.A., Zinovenko O.G. Uslovno-s»yemnoye protezirovaniye na dental'nykh implantatakh v slozhnykh anatomicheskikh usloviyakh pri polnoy vtorichnoy adentii [Conditionally removable prosthetics on dental implants in difficult anatomical conditions with complete secondary adentia]. Sovremennaya stomatologiya, 2019, vol.3, pp.60-62. (in Russian)
11. Shcherbovskikh AYe. Obosnovaniye primeneniya modifitsirovannykh dentafnykh implantatov na osnove netkanogo titanovogo materiala so skvoznoy poristost'yu (kliniko-eksperimental'noye issledovaniye): avtoref. dis...kand.med.nauk [The rationale for the use of modified dental implants based on non-woven titanium material with through porosity (clinical and experimental research)]. Samara, 2017, 24 p. (in Russian)
Конфликт интересов
Согласно заявлению авторов, конфликт интересов отсутствует. Этические аспекты
Документы рассмотрены и одобрены комитетом по этике.
Поступила 27.03.2019 Принята в печать 20.09.2019
Адрес для корреспонденции
Кафедра ортопедической стоматологии
Белорусский государственный медицинский университет
г. Минск, ул. Сухая, 28
220004, Республика Беларусь
тел.: + 375 17 200-54-72
Головко Александр Иванович, e-mail: ortopedstom@bsmu.by
Address for correspondence
Department of Orthopedic Dentistry
Belarusian State Medical University
28, Sukhaya street, Minsk
220004, Republic of Belarus
phone: + 375 17 200-54-72
Alexander Golovko, e-mail: ortopedstom@bsmu.by
