Анализ механизмов неклассического пути секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.112.94.017.1.083

А. В. Зяблицин, Э. А. Алекперов, A. A. Бойко, А. В. Клинкова, Н. И. Троянова,

A. M. Сапожников

анализ механизмов неклассического пути секреции БтШ70 в популяциях лимфоидных клеток

УРАН Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10)

В ряде недавних работ продемонстрировано, что в механизм секреции БТШ70 клетками некоторых типов вовлечены липидные рафты плазматических мембран и эндолизосомы. С целью изучения механизмов экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками проведено исследование вовлеченности этих структур в формирование внеклеточного пула БТШ70 в культуре клеток мышиной лимфомы EL-4. Полученные данные свидетельствовали о независимости интенсивности продукции внеклеточных БТШ70 в нашей модели от рафтов и эндолизосом.

Ключевые слова: лимфоидные клетки, БТШ70, экзоцитоз

Zyablitsin A.V., Alekperov E.A., Boiko A.A., Klinkova A.V., Troyanov N.I., Sapozhnikov A.M.

THE ANALYSIS oF MECHANISMS oF THE NoN-CLASSICAL PATHwAY of HSP-70 SECRETIoN

in lymphoid cell populations

A number of recent studies have demonstrated the involvement of plasma membrane lipid rafts and endolysosomes in the mechanism of HSP-70 secretion by several cell types. The present work was carried out to study the possible involvement of these cell structures in exocytosis of HSP-70 in the populations of murine lymphoma EL-4 cells cultured in vitro. The data obtained indicate that the formation of the extracellular pool of HSP-70 in our model did not depend on the lipid rafts and endolysosomes.

Key words: lymphoid cells, HSP-70, exocytosis

Белки теплового шока (БТШ) - большое семейство стрес-синдуцируемых протеинов. Одной из основных функций данных молекул является защита внутриклеточных протеинов от повреждающих воздействий стрессирующих факторов различной природы [5]. Указанные функции БТШ реализуются во внутриклеточном пространстве, однако в ряде случаев эти протеины обнаруживают также на клеточной поверхности и во внеклеточной среде. Такая необычная локализация наиболее характерна для БТШ70, являющихся одними из основных представителей семейства БТШ. В частности, продемонстрирован также феномен секреции БТШ70 в культурах клеток разных тканей [1, 6, 7]. На возможность экзоцитоза БТШ70 in vivo указывают данные о присутствии БТШ70 в сыворотке крови [9]. Причины и механизмы секреции БТШ70 находятся на начальном этапе изучения, однако показано, что пул этих протеинов обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами. Так, продемонстрировано, что внеклеточные БТШ70 усиливают продукцию цитокинов и ускоряют созревание антигенпредставляющих дендритных клеток [8]. Совокупность перечисленных данных свидетельствует о существенной, однако малоизученной роли внеклеточных БТШ70 в функционировании иммунной системы.

В работах, посвященных изучению механизмов секреции БТШ70, продемонстрировано, что продукция внеклеточных БТШ70 осуществляется неклассическим, аппарат Гольджи независимым путем. В частности, было показано, что в секрецию БТШ70 мононуклеарами, выделенными из периферической крови человека, вовлечены экзосомы [3]. В наших

Сапожников Александр Михайлович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб., тел. 8(495)330-40-11, e-mail: amsap@mx.ibch.ru

экспериментах также обнаружено, что лимфоидные клетки мыши продуцируют экзосомы, содержащие БТШ70. Однако этот путь экзоцитоза БТШ70 нельзя рассматривать как единственный. Например, ранее мы продемонстрировали, что формирование внеклеточного пула этих протеинов в культуре лимфоидных клеток может быть связано со сбрасыванием в окружающую среду поверхностных БТШ70 [7]. В данном исследовании нами продолжено изучение механизмов неклассического пути секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток.

В I серии экспериментов мы проанализировали возможную вовлеченность липидных рафтов в механизмы неклассического пути экзоцитоза БТШ70. Предположение об участии рафтов в транслокации БТШ70 на клеточную поверхность с последующим сбрасыванием этих молекул во внеклеточное пространство появилось в связи с нашими предыдущими результатами, упомянутыми выше [7]. Для проведения этого исследования использовали модель разрушения рафтов вымыванием из их состава холестерина с помощью метил-Р-циклодекстрина [2]. В указанных экспериментах проведен вестерн-блот-анализ влияния этого ингибитора на содержание внеклеточных БТШ70 в супернатанте культуры клеток лимфомы EL-4. Метил-р-циклодекстрин вносился в клеточную культуру на стадии замены полной питательной среды ее бессывороточным аналогом. Супернатант для исследования отбирали через 24 ч инкубации клеток. Как показал цитометрический анализ апоптоза в данных культурах, использованные дозы метил-р-циклодекстрина (10 мМ) не приводили за этот срок к усилению гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты вестерн-блот-анализа образцов супернатанта свидетельствовали, что происходит незначительное, но достоверное увеличение уровня БТШ70 в культуральной сре-

- 49 -

ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012

де, т. е. метил-в-циклодекстрин не только не препятствовал экзоцитозу БТШ70 клетками EL-4, но незначительно стимулировал этот процесс. Следовательно, в нашей модели разрушение липидных рафтов не ингибировало уровень секреции БТШ70. Вызванное метил-в-циклодекстрином увеличение внеклеточного пула БТШ70 можно объяснить стрессирую-щим эффектом данного воздействия, приводящего к усилению уровня экспрессии этих протеинов. На основании полученных результатов можно заключить, что выход БТШ70 во внеклеточное пространство в культуре клеток линии EL-4 идет без участия липидных рафтов или же эти структуры не вносят значительный вклад в секрецию БТШ70.

Следующая серия экспериментов была посвящена проверке участия в процессе экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками неклассического эндолизосомального пути секреции протеинов. Такая возможность была продемонстрирована ранее в опытах с культурой клеток карциномы простаты [4]. Ингибитором данного пути секреции протеинов является 4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulphonic acid (DIDS). Его действие основано на блокировании активности транспортного белка ABCA-1, участвующего в переносе протеинов из цитозоля в эндолизосомы. С помощью вестерн-блот-анализа была осуществлена проверка влияния этого ингибитора на содержание внеклеточных БТШ70 в супернатанте культуры клеток лимфомы EL-4. Ингибитор вносили в клеточную культуру на стадии замены полной питательной среды ее бессывороточным аналогом; супернатант для анализа отбирали через 24 ч инкубации клеток. Как показал цитометрический анализ апоптоза в данных культурах, рабочая доза DIDS (50 мкМ) не приводила за этот срок к усилению гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты проведенных экспериментов свидетельствовали об отсутствии вызванных DIDS достоверных изменений уровня секреции БТШ70 в этой модели, т. е. в культуре клеток линии EL-4 экзоцитоз БТШ70 осуществляется в обход эндолизосомального пути.

Таким образом, данные нашего исследования механизмов неклассических путей секреции БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток отличаются от результатов, полученных другими авторами, в опытах с культурами клеток нелимфо-

идного происхождения. Это указывает, с одной стороны, на разнообразие механизмов экзоцитоза БТШ70 и, с другой стороны, на важную физиологическую роль данного процесса, протекающего в клетках разных тканей. Очевидно, что для более полного понимания физиологических функций внеклеточных БТШ70 необходимы дальнейшие исследования процесса секреции этих протеинов. Такие исследования являются особенно актуальными для изучения механизмов вовлеченности БТШ70 в иммунологические процессы, поскольку в настоящее время накоплено много свидетельств о выраженных иммуномодулирующих эффектах внеклеточного пула этих протеинов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 10-04-01095-а) и программы “Молекулярная и клеточная биология” президиума РАН.

ЛИТЕРАТУРА

1. Hunter-Lavina C. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004. - Vol. 324. - P. 511-517.

2. Korade Z., Kenworthy A. K. // Neuropharmacology. - 2008. -Vol. 55. - P. 1265-1273.

3. Lancaster G. I., Febbraio М. А. // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 23 349-23 355.

4. Mambula S. S., Calderwood S. K. // J. Immunol. - 2006. - Vol. 177. - P. 7849-7857.

5. Parsell D. A., Lindquist S. // Annu. Rev. Genet. - 1993. - Vol. 27. - P. 437-496.

6. Pockley A. G. // Expert Rev. Mol. Med. - 2001. - Vol. 21. - P. 1-21.

7. Sapozhnikov A. M. et al. Cell Proliferat. - 2002. - Vol. 35. - P. 193-206.

8. Srivastava P. // Nature Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 2. - P. 185194.

9. Tsan M., Gao B. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2004. - Vol. 286. - P. C739-C744.

Поступила 30.09.11

ОБЗОРЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.25-002.5-092:612.017.1]-078.33

O. B. Воронкова, E. A. Юрьева, О. И. Уразова, В. В. Новицкий, Е. В. Некрасов, И.

О. Наследникова, И. В. Мальцева, Е. А. Пелеганчук, Н. П. Пирогова

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ ОРГАНИЗМА ПРИ

туберкулезном экссудативном плеврите

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России (634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2)

Представлен анализ данных литературы и собственных исследований, касающихся особенностей иммунологических параметров периферической крови и плеврального экссудата (цитокиновый профиль, CD-субпопуляционный состав лимфоцитов) при различных вариантах экссудативного плеврита. Обсуждается возможность использования некоторых иммунобиологических показателей крови и плевральных выпотов в качестве критериев для дифференциальной диагностики туберкулезных плевритов.

Ключевые слова: туберкулезный плеврит, иммунитет, лимфоциты, цитокины

- 50 -