CC BY
23Труды ВНИРО 2015 г. Том 157
Промысловые виды и их биология
УДК 597-143.4:576
Анализ люминесцирующей микрофлоры кишечника рыб студёных морей: Белого, Берингова и Охотского
М.Н. Коноплёва1, С.А. Хрульнова2, М.С. Осетрова1,2, Д.И. Дёгтеви, И.В. Манухови, Г.Б. Завильгельский2
1 Московский физико-технический институт (государственный университет) (МФТИ, г. Долгопрудный)
2 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика», г. Москва)
Е-mail: [email protected]
Настоящее исследование посвящено изучению видового состава светящихся бактерий, обитающих в кишечном тракте рыб акваторий студёных морей в летний и зимний период. В ходе экспедиций в зимний период 2010 г. и летний период 2014 г. с целью изучения возможного сезонного изменения состава кишечной микрофлоры рыб, обитающих в акваториях студёных морей, а также с целью проведения поиска люминесцентных симбионтов и паразитов, в том числе возможных патогенов, были собраны образцы как свободноживущей пелагиальной микрофлоры, так и микрофлоры кишечников рыб в районах Белого, Берингова и Охотского морей. Результатом проведённых экспедиций стало выделение 21 штамма светящихся бактерий в зимний период и 25 штаммов в летний период. Показано видовое замещение бактерий, заселяющих кишечник рыб — обитателей Берингова и Охотского морей, связанное с сезонными колебаниями температур морских поверхностных вод: в летний период бактерии вида P. phosphoreum замещают другие бактерии A. logei, преобладающие в зимний сезон низких температур. Примечательното, что оба вида относятся к психрофильным бактериям. В составе кишечной микрофлоры рыб, обитающих в акваториях студёных морей, психрофильные светящиеся бактерии являются часто встречающимися, порой доминирующими. Анализ последовательности «house-keeping»-генов двух штаммов, определённых как A. logei по биохимическим параметрам, показал близость данных штаммов к виду A. salmonicida. Расхождение данных биохимического и филогенетического анализа для ряда биолюминесцирующих штаммов свидетельствует о необходимости видовой реклассификации. Показана высокая вариабельность некодирующей области между консервативными генами luxR1 и luxC, содержащейся в структуре lux-оперона A. logei. По-видимому, вариабельность этого участка связана со сравнительно недавней утратой способности к экспрессии гена luxl, остатки которого находятся в luxR1-luxC-области ^-оперона.
Ключевые слова: Aliivibrio logei, Photobacterium phosphoreum, биолюминесценция, lux-оперон, психрофильные бактерии, биолюминесценция, видовой состав, Белое море, Охотское море, Берингово море, сезонные изменения микрофлоры.
Введение
Подавляющее большинство биолюминесцентных бактерий, обитающих в морях и океанах, принадлежит семейству Vibrionaceae,
которое включает в себя роды Vibrio, Photo-bacterium, Aliivibrio. Четыре вида бактерий A. fischeri, A. logei, A. salmonicida, A. wodanis ранее входили в состав рода Vibrio, в настоящее
время формируют самостоятельный род Ali-ivibrio внутри семейства Vibrionaceae [Bang et al., 1978; Urbanczyket al., 2007; Beaz-Hidalgo et al., 2010]. В геноме люминесцирующих бактерий содержатся гены lux-оперона, которые определяют способность бактерий к свечению (люминесценции). Структуры lux-оперонов подробно изучены и описаны [Engebrecht, Silverman, 1984; Swartzman, Kapoor, 1990; Stevens, Greenberg, 1997; Manukhov et al., 2011]. Есть сообщения о том, что наличие lux-оперо-на необходимо для успешной колонизации лю-минесцирующими бактериями животных-хозяев [Ruby et al., 1999]. Светящиеся морские бактерии представлены как психрофилами, так и мезофилами, которые отличаются между собой способностью к росту при низких или высоких температурах соответственно. Психро-фильные бактерии нормально существуют и размножаются при температуре близкой к 0 °С и не способны к этому при температуре свыше 30 °С, в отличие от мезофильных бактерий, которые не растут уже при плюс 4 °С, но обладают способностью к росту при 30 °С и выше. Оптимальная температура роста для психрофиль-ных бактерий плюс 10—15 °С, которая является минимально возможной для роста мезофилов.
Глубина и градиент температуры воды играют определяющую роль в заселении светящимися бактериями морей и океанов [Deming et al., 2002; D'Amico et al., 2006]. В верхних слоях тёплых морей преобладают мезофилы, большей частью представленные видом V. har-veyi [Nealson, Hastings, 2006]. С увеличением толщи воды и снижением температуры происходит видовое замещение бактерий. На глубине от 200 м, где температура опускается ниже плюс 15 °С, доминируют психрофилы, в основном P. phosphoreum. Оптимальной средой обитания для психрофильных бактерий также являются верхние слои студёных морей Арктики и Антарктики.
Однако, сезонные колебания температуры поверхностного слоя морских вод, прогреваемого солнечными лучами, оказываются значительными. В летний период температура вод поверхностного слоя и прибрежной зоны Белого, Берингова и Охотского может достигать плюс 17 °С. Существенные сезонные колебания температуры верхнего слоя морских вод на-
водит на предположение о возможном видовом замещении люминесцирующей микрофлоры кишечника рыб Охотского и Берингова морей с мезофильных бактерий на психрофильные в ходе смены сезонов в течение года.
Настоящее исследование посвящено изучению видового состава светящихся бактерий, обитающих в кишечном тракте рыб акваторий студёных морей: Белого, Берингова и Охотского в летний и зимний период. Проведён филогенетический анализ изолированных штаммов на основе последовательности генов 1их-оперона и 16S рРНК.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. Объектом исследований являются новые штаммы психро-фильных морских люминесцирующих бактерий, изолированные в разных сезонах года.
В зимний период 2010 г. выделены штаммы морских светящихся бактерий из кишечника рыб, пойманных в Охотском море у мыса Левашова: NML — навага; КСМ, ВМЬ1-ВМЬ6, BML8 — бычок; КАМ1-КАМ4 — камбала; в слабосолёном оз. Калагирь, соединяющемся с Беринговым морем: КСМ—К^3, К^5 — К^8 — корюшка; в Белом море: ВМ1, ВМ2 — керчак.
В летний период 2014 г. изолированы штаммы морских светящихся бактерий из кишечника рыб, пойманных в Охотском море у мыса Левашова: 148, 1430 — горбуша; 149, 1430, 1432.1, 1432.2, 1437, 1439 — навага; 1417 — кета; 1445 — камбала; 1448 — керчак; в Беринговом море: 1440 — керчак; 1457, 14100 — горбуша; в Чёрном море: SChm1, SChm2, SChm3, SChm4 — ставрида; К^т1 — керчак; в Южно-Китайском море у о. Хайнань: СЫп2, СЫп5.
Ряд штаммов депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП «ГосНИИгенетика» (табл. 1).
В работе использовали референсные штаммы светящихся бактерий:
морские бактерии АйшгЬпо ^^вп
АТСС29985т, А. Ывп М1-1, А. Ывп
МГУ-6 (получены на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ от А.П. Зарубиной);
Таблица 1. Штаммы, выделенные в 2010 г., депонированные в ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика»
Обозначение Номер ВКПМ Источник (где найден, откуда выделен)
1. A. logei NML B-11098 Мыс Левашова, эстуарий реки Большая, впадающей в Охотское море. Кишечник дальневосточной наваги Eleginus gracilis
2. A. logei BM1 B-10407 Белое море, Ругозерская губа. Кишечник керчака
3. A. logei BM2 B-11095 Белое море, Великая Салма. Кишечник керчака
4. A. logei KCh1 B-10409 Охотское море, мыс Левашова. Кишечник бычка Cottida spр.
5. A. logei KCh2 B-10410 Оз. Калагирь (восточное побережье Камчатки). Кишечник корюшки Hypomesus olidus
6. A. logei KCh3 B-11096
7. A. logei KCh5 B-11097
8. A. logei KCh6 B-11099
9. A. logei KCh7 B-11102
10. A. logei KCh8 B-11101
11. A. logei BML1 B-12137 Охотское море, мыс Левашова, выделен из кишечника бычка Cottida sp.
12. P. phosphoreum BML2 B-12138
13. A. logei BML3 B-12139
14. P. phosphoreum BML4 B-12140
15. P. phosphoreum BML5 B-12141
16. A. logei BML6 B-12142
17. A. logei BML8 B-12143
18. P. phosphoreum КАМ1 В-12145 Охотское море, мыс Левашова Кишечник камбалы Pleuronectes spр.
19. A. logei КАМ2 В-12146
20. A. logei КАМ3 В-12147
21. P. phosphoreum КАМ4 В-12148
22. A. salmonicida B-11103 NCIMB2262TJ Romalde (Испания)
наземные бактерии, обитатели кишечника нематод, паразитирующих на насекомых Photorhabdus luminescens ZM1 (МГУ, от А.П. Зарубиной);
A. salmonicida NCIMB2262T (получен от Jesus Romalde) [Beaz-Hidalgo et al., 2010].
Выделение ДНК. Хромосомальную ДНК штаммов выделяли из клеток поздней логарифмической фазы роста при помощи лизиса лизо-цимом и SDS с последующей обработкой фенолом и переосаждением в этаноле.
Электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили методом электроэлюции.
Реактивы и среды. Среда для культивирования морских люминесцирующих бактерий SWTсодержит: 0,5% триптона, 0,25% дрожжевого экстракта, 1,5% морской соли и 0,3%
глицерина. Для получения агаризованной среды к 1 л SWT-среды добавляли 15 г агара.
SWT-среду и SWT-агар автоклавировать при 0,8 атм. 1 час.
Культивирование. Морские бактерии растили на среде SWTm при температуре в интервале от плюс 10 °С до плюс 37 °С.
Измерение биолюминесценции. Интенсивность биолюминесценции клеток определяли в пробах объёмом по 200 мкл в люминоме-тре через определённые интервалы времени.
Инкубация проб проводилась при комнатной температуре. Единицы измерения интенсивности биолюминесценции пропорциональны микровольтам на обкладках фотоэлектронного умножителя. Измерение люминесценции проводилось на следующих приборах: высокочувствительном люминометре «Биотокс-7» и ми-
кропланшетном люминометре LM-01T (Immunotech).
Определение нуклеотидной последовательности. Для анализа последовательности регуляторной области luxR1-luxC использовались праймеры:
SV1dir5' - TCACACCGCCGATGATAATTGGAA - 3'; SV3rev 5' - GCGCCATTTTTGTGGGTAATTATCT - 3'.
Для анализа последовательности 16S рРНК и «house-keeping»-генов (gapA gyrB pyrH recA и rpoA) использовались следующие праймеры:
lux16SD 5' - CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG - 3' lux15SR 5' - TGCAGCCCACTCCCATGGTGTGAC - 3' gapA:
gapAfor1 5' - AAGAGCGCAATGATATTGAAGTTG - 3' gapArev1 5' - TAGCATCGAATACTGAAGTTTGAG - 3' gyrB:
22fVf 5' - GAAGTTATCATGACGGTACTTC - 3' 1240rVf 5' - AGCGTACGAATGTGAGAACC - 3' gyrB 557f 5' - CAACGHGATGGTGGTACNCACTTAG - 3'
gyrB 670r5' - CCTTCACGNGCATCATCACCAGASG - 3' pyrH:
pyrH-04-Fw5' - ATGASNACBAAYCCWAAACC - 3' PBPRB2966R 5' - GAATCGGCATTTTATGGTCACG - 3 recA:
recAforfisc 5' - TCAAATTGAAAAACAATTTGTAAAGG -3'
recArevfisc 5' - ATCTTATCACCATTGTAGCTGTACC - 3' rpoA:
rpoA-01-F 5' - ATGCAGGGTTCTGTDACAG - 3' rpoA-03-R 5' - GHGGCCARTTTTCHARRCGC - 3'
Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили с помощью дидезокси-нуклеотидтрифосфатов по Сэнгеру.
Биоинформационный анализ. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов проводили с гомологичными последовательностями стандартных (референсных) штаммов A. lo-gei ATCC29985T, A. fischeri ATCC7744T и A. salmonicida ATCC 43839T. Корректировку сиквенсовых хроматограмм и их анализ проводили в программе Vector NTI 9. Сравнение результатов секвенирования и дифференциацию до вида проводили с помощью BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Для построения филогенетических деревьев использовали программу MEGA 5.2. Филогенетические деревья строились по методу Neighbor-Joining
[Saitou et al., 1987; Tamura et al., 2007; Tamura et al., 2011], 1000 репликаций.
Биохимическое тестирование. Качественную реакцию восстановления нитратов определяли следующим образом. Культуру засевали в жидкой среде, содержащей 0,5% пептона и 0,2% нитрата калия. После суточного инкубирования при температуре 20 оС в суспензию добавляли 0,5 мл 0,8%-го раствора сульфани-ловой кислоты в 5 Н уксусной кислоте и 9,5 мл 0,6%-го раствора а-нафтиламина в 5 Н уксусной кислоте (реактив Грисса). Появление красной окраски указывает на образование нитрита.
Результаты и обсуждение
С целью изучить возможное сезонное изменение состава кишечной микрофлоры рыб, обитающих в акваториях студёных морей, а также с целью провести поиск люминесцентных симбионтов и паразитов, в том числе возможных патогенов, проведён сбор образцов как свобод-ноживущей пелагеальной микрофлоры, так и микрофлоры кишечников рыб в районах Белого, Берингова и Охотского морей в зимний период 2010 г. и летний период 2014 г.
В зимний период 2010 г. были изолированы 22 штамма морских психрофильных светящихся бактерий: два штамма (BM1, BM2) в акватории Белого моря, тринадцать штаммов (KCh1, NML, BML1-BML6, BML8, KAM1-КАМ4) в акватории Охотского моря и семь штаммов (K^2, KCh3, K^5 — KCh8) в акватории Берингова моря.
В летний период 2014 г. были собраны образцы микрофлоры кишечника у 200 рыб, выловленных из вод Охотского и Берингова морей. Собранные образцы, с целью обнаружить биолюминесцентные бактерии, высевали в чашки Петри с агаризованной средой SWT. На 99 чашках были выявлены колонии люминесци-рующих микроорганизмов. В результате нескольких пассажей пересева отобранных колоний с применением чередования жидкой и агаризованной сред SWT удалось расчистить 25 изолятов.
В качестве контроля было отобрано семь биолюминесцирующих образцов кишечной микрофлоры рыб, выловленных в акваториях тёплых морей: SChm1, SChm2, SChm3, SChm4,
КСЬт1 (Чёрное море) и СЫп2, СЫп5 (Южно-Китайское море).
Из полученных за оба временных периода люминесцирующих изолятов выделили хромо-сомальную ДНК с целью последующего моле-кулярно-генетического анализа, включающего секвенирование гена 16Б рРНК.
С целью идентифицировать полученные образцы с точностью до рода провели филогенетический анализ новых изолированных светящихся бактерий наряду с люминесцирующими психрофильными штаммами, имеющимися в распоряжении ВКПМ (рис. 1).
Оказалось, что образцы, собранные в зимний период, представлены большей частью видом Л. \ogei (ЫМЬ, ЫМЬ2, ВМЬ1, вмьз, ВМЬ6, ВМЬ8, КАМ2, КСЫ-КСЬЗ, КСЬ5-КСЬ8, ВМ1, ВМ2), в то время как исследуемые штаммы, собранные в летний промежуток времени (148, 1417, 1432.2, 1437, 1439,1445,1448,1449,14100), принадлежат
к виду Р. phosphoreum. Принадлежность бактерий к указанным видам достоверно подтвердили данные мультигенного секвенирования, а также люминесцентные характеристики, ключевые биохимические параметры, интервалы температур, определяющие границы роста исследуемых бактерий.
Стоит отметить, что виды Л. logei и Л. sal-monicida достаточно близки фенотипически. Основными биохимическими отличиями являются: свечение (Л. salmonicida — криптически-люминесцирующие бактерии, т.е. светящиеся только при добавлении субстрата люцеферазы п-деканаля); наличие жёлтого пигмента (у Л. 1о-gei он присутствует, у Л. salmonicida — нет); способность восстанавливать нитрат; ферментация D-галактозы и мальтозы (бактерии у Л. logei способны, Л. salmonicida — нет). Штаммы КСЬ1-КСЬ3, КСЬ5-КСЬ8, ВМ1, ВМ2, ЫМЬ, ВМЬ1, ВМЬ3, ВМЬ6, ВМЬ8, КАМ2, КАМ3 по биохимическом параметрам относятся к Л. logei. Однако, при филогенетическом анализе на основе 5 «house-keeping»-генов штаммы ЫМЬиВМ2не кластеризуются с типовым штаммом Л. logei. По результатам мультигенного анализа они ближе к виду Л. salmonicida, чем Л. logei (рис. 2).
Анализ последовательности «house-kee-р^»-генов показал отсутствие кластеризации
л
■ Р. phosphoreum АТСС 11040Т 14100 » 1448 0 1445 0 1439 0 1437 » 1432.2 О КАМ1 *
IKAM1 = IКАМ4=
4Z
BML2 *
_i BML4 *
LBML5*
- 1417
¡i Р. iliopiscaríum АТСС 51760Т J 1457
- Р. angustum АТСС 25915Т SChml 0 SChm3 О Chin 2 О Chin 5 0 SChm20
Р. leiognathi 25521Т ^^ - A. fisherifiJCC 7744Т ^
-A. wodanis АТСС 15382Т
, Kch1 * A Kch3 *
- A. salmonicida NCMB 2262T
Род Рко^ЬаМепшп
NML * 149 0 1440 0 ВМ1 * ВМ2 * Kch5 * КАМ2 * Kch8 * КАМ5 * BML1 * BML3 * Kch6 * Kch7 * BML6 * BML8 * V. atypicus HHS02T
harveyi ATCC 14126T : jasicida LMG 25398T V. parahaemolyticus АТСС 17802T KChml 0
V. aquamarinus VN B-15T V. aquamarinus VNB-16 SChm4 0
- V. cholerae АТСС 14035T i- 1430 0
Род АИтЬпо
v Род Vibrio
99 ,Sh. marinintestina IK-1T
t»^««^ I р0д Shewanella ¡t
Sh. sairae SM2-■ Sh. gelidimarina ACAM456 Sh. pealeanaANG-SQ1 T Sh. halifaxensis HAW-EB4 T 1432.1 0
Рис. 1. Филогенетический анализ новых изолированных биолюминесцентных штаммов и
референсных штаммов, построен на основе нуклеотидной последовательности 16Б гИ^А. В зимний период 2010 г. выделены штаммы морских светящихся бактерий из кишечника рыб, пойманных в Охотском море у мыса Левашова: NML — навага; КШ, BML1—BML6, BML8 — бычок; КАМ1-4 — камбала; оз. Калагирь (восточное побережье Камчатки): К^2, KCh3, KСh5—KCh8 —
корюшка; в Белом море BM1, ВМ2 — керчак. В летний период 2014 г. изолированы штаммы морских светящихся бактерий из кишечника рыб, пойманных
в Охотском море у мыса Левашова: 148, 1430 — горбуша; 149, 1432.1, 1432.2, 1437, 1439 — навага;
1417 — кета; 1445 — камбала; 1448 — керчак; в Беринговом море: 1440 — керчак; 1457, 14100 — горбуша; в Чёрном море: Б^т2, Б^т3,
— ставрида; К^т1 — керчак; в ЮжноКитайском море у о. Хайнань: СЫп2, СЫп5, 1430 и 1432.1 — не люминесцируют. * — штаммы, изолированные в зимний период; 0 — штаммы, изолированные в летний период.
Рис. 2. Филогенетическое дерево, основанное на нуклеотидной последовательности пяти «house-keepeng»-генов (gapA, gyrB, pyrH, recA, rpoA) штаммов KCh1, KCh2, BM1, BM2, NML, A. logei ATCC 29985T, A. salmonicida ATCC 43839T, A. fischeri ATCC 7744Т. P. phosphoreum ATCC 11040T взят для построения филогенетического дерева как представитель out-группы
для ряда штаммов, определённых по биохимическим параметрам как A. logei, с видом A. logei и близость их к виду A. salmonicida. Эти данные, по-видимому, указывают на необходимость проведения более углублённого анализа и реклассификации данных видов.
Выявленные виды бактерий — A. logei и P. phosphoreum — относятся к психрофилам. Мезофильные бактерии не обнаружены. Следует отметить, что для психрофильных бактерий A. logei характерна регуляция экспрессии генов системой «quorum-sensing» (QS) первого типа в зависимости от плотности популяции бактериальных клеток. В психрофильных бактериях P. phosphoreum такая система отсутствует. Можно предположить, что преимущественное преобладание микроорганизмов вида A. logei над P. phosphoreum в условиях более низких зимних температур обусловлено именно наличием системы QS, регулирующей экспрессию lux-оперона. Наличие lux-оперона вносит свой вклад при успешном заселении лю-минесцирующими бактериями животных-хозяев [Ruby, 1999]. Благодаря QS-регуляции бактерии имеют возможность скоординировано отвечать на изменения во внешней среде в зависимости от собственной плотности. Следует отметить особенности существования изолированных психрофильных микроорганизмов: так P. phosphoreum являются свободноживущими бактериями или консументами кишечника рыб, в то время как A. logei представляют собой симбионтов для ряда животных-хозяев [Ruby,
1999].
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что имеет место видовое замещение бактерий в связи со сменой сезонной температуры поверхностных вод акваторий Берингова и Охотского морей: с повышением температуры летом бактерии P. phosphoreum вытесняют представителей A. logei, преобладающих в зимний период низких температур. Примечательно то, что оба вида бактерий принадлежат к психрофилам.
То, что из 200 отобранных образцов кишечной микрофлоры рыб из Охотского и Берингова морей каждый второй образец оказался био-люминесцирующим, демонстрирует факт, что светящиеся бактерии являются часто встречающимися типовыми обитателями микрофлоры рыб, причём нередко доминирующими в кишечнике.
Ранее была определена последовательность lux-оперона A. logei [Manukhov et al., 2011]. Структура lux-оперона содержит некодирую-щую область между генами luxR1 и luxC (рис. 3,а). Данная область была использована для проведения филогенетического анализа близкородственных штаммов A. logei из Белого, Берингова и Охотского морей. С этой целью были подобраны праймеры (SVldir и SV3rev) на основе регуляторного региона luxR1—luxC. Оказалось, что данный регион
pL] pri а pL2 Pr2
< ——| luxC luxD luxA ЫхВ luxE luxG X iutiV^Tluxl )-
i—► <—i
SVldir SVJrev
б
A. logei BML6 A. logei KCh2 A. logei KCh8 A. logei NML I— A. salmonicida NCMB 2262T
■ A. logei 149
99 \A. logei BML1 A. logei BM2 . A. logei KCM A. logei BM1 -A. logei 1442 — A. logei KCh5 A. logei KCh3 A. logei KCU7
-A. fischeriMJ-V
Рис. 3. Структура 1их-оперона A. logвi (а). Показано расположение 1ихЮ1 и luxR2 генов, Рг1 и Рг2 промоторов, а также праймеров БУЫ^ и SV3rev, с которых проводилось секвенирование luxR1—luxC-области. Филогенетический анализ исследуемых штаммов на основе нуклеотидных последовательностей регуляторной области 1ихЮ1—1ихС (б)
lux-оперона, несмотря на то что фланкирован консервативными генами luxRl и luxC, является вариабельным даже для близкородственных штаммов.
Результат филогенетического анализа показал, что последовательности регуляторной luxR1—luxC области штаммов A. logei, изолированных из Белого и камчатских морей, не позволяют выделить отдельные кластеры, т.е. отсутствуют группы, специфичные для данных ареалов (рис. 3,6).
Заключение
Показано связанное с сезонными колебаниями температур морских поверхностных вод видовое замещение бактерий, заселяющих кишечник рыб Берингова и Охотского морей: бактерии P. phosphoreum в летний период замещают бактерии A. logei, преобладающие в зимний сезон низких температур, несмотря на то что оба вида относятся к психрофилам. Преобладание A. logei, по-видимому, обеспечено наличием QS-системы регуляции экспрессии генов lux-оперона, способствующей заселению органов животного-хозяина. Свободноживу-щие P. phosphoreum, не обладающие этой системой, в холодные сезоны года, очевидно, менее приспособлены к колонизации кишечника рыб. Следует, однако, отметить, что разница в микрофлоре может быть следствием не сезонных, а иных временных циклов, так как зимние и летние образцы собраны с разницей в несколько лет (2010 и 2014 гг.).
Психрофильные светящиеся бактерии являются часто встречающимися, порой доминирующими, в составе кишечной микрофлоры рыб, обитающих в акваториях студёных морей.
Анализ последовательности «house-keeping» -генов двух штаммов, определённых по биохимическим параметрам как A. logei, показал близость данных штаммов к виду A. salmonicida. Расхождение данных биохимического и филогенетического анализа последовательностей <Ло^е-кеер^»-генов для ряда биолюмине-сцирующих штаммов свидетельствует о необходимости видовой реклассификации.
Показана вариабельность некодирующей области между консервативными генами luxRl и luxC, содержащейся в структуре lux-оперона A. logei. По-видимому, вариабельность этого
участка связана со сравнительно недавней утратой способности к экспрессии гена luxI в данном месте lux-оперона у видов A. logei и A. salmonicida. В настоящее время мы являемся свидетелями постепенной потери бактериями A. logei и A. salmonicida данного некодирующе-го фрагмента lux-оперона в процессе эволюции.
Литература
Bang S.S., Baumann P., Nealson K.H. 1978. Phenotypic сЬага^епгайоп of Photobacterium logei (sp. nov.), a species related to P. fischeri. Curr. / / Microbiol. V. 1.
P. 285-288.
Beaz-Hidalgo R., Doce A., Balboa S., Barja J.L., Ro-malde J.L. 2010. Aliivibrio finisterrensis sp. nov., isolated from Manila clam, Ruditapes philippinarum and emended description of the genus Aliivibrio / / International Journal of Systematic and Microbiology. V. 60.
P. 223-228.
DAmico S., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. 2006. Psychrophilic microorganisms: challenges for life // EMBO Rep. V. 7. P. 385-389. Deming J.W. 2002. Psychrophiles and Polar Regions //
Curr. Opin. Microbiol. V. 5. P. 301-309. Engebrecht J., Silverman M. 1984. Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 81. P. 4154-4158.
Manukhov I.V., Khrul'nova S.A., Baranova A., Zavilgel-sky G.B. 2011. Comparative analysis of the lux-operons in Aliivibrio logei KCh1 (Kamchatka isolate) and Aliivibrio salmonicida // Journal of Bacteriol. V. 193.
N15. P. 3998-4001. Nealson K.H., Hastings J.W. 2006. Quorum sensing on a global scale: massive numbers of bioluminescent bacteria make milky seas / / Appl. Environ. Microbiol.
V. 72 (4). P. 2295-2297.
Ruby E.G., McFall-Ngai M.J. 1999. Oxygen-utilizing reactions and symbiotic colonization of the squid light organ by Vibrio fischeri // Trends Microbiol. V. 10.
P. 414-420.
Saitou N., Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees / /
Mol. Biol. Evol. V. 4. P. 406-425. Stevens A.M., Greenberg E.P. 1997. Quorum sensing in Vibrio fischeri: essential elements for activation of the luminescence genes // J. Bacteriol. V. 179 (2). P. 557562.
Swartzman E., Kapoor S., Graham A.F., Meighen E.A. 1990. A new Vibrio fischeri lux-gene precedes a bidirectional termination site for the lux-operon //J. Bac-
teriol. V. 172. P. 6797-6802. Tamura K., Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. V. 24. P. 1596-1599.
Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Ge-
ry Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods
// Mol. Biol. Evol. V. 28. P. 2731-2739.
Urbanczyk H., Ast J.C., Higgins M.J., Carson J., Dunlap P.V. 2007. Reclassification of Vibrio fischeri, Vibrio lo-
Поступила в редакцию 30.06.2015 г.
gei, Vibrio salmonicida and Vibrio wodanis as Aliivib-rio fischeri gen. nov., comb. nov., Aliivibrio logei comb. nov., Aliivibrio salmonicida comb. nov., and Aliivibrio wodanis comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
V. 57. P. 2823-2829.
Принята после рецензии 25.08.2015 г.
Analysis of luminescent intestinal microflora of fish in cold seas: the White, Bering and Okhotsk Seas
M.N. Konopleva1, S.A. Khrul'nova2, M.S. Osetrova1,2, D.I. Degtev1,2, I.V. Manukhov1,2, G.B. Zavilgelsky2
1 Moscow Institute of Physics and Technology (Dolgoprudny)
2 Reserch Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms (Moscow)
The present study investigates the species composition of luminescent bacteria that live in the intestinal tract of fish in cold sea waters in summer and winter. Samples were collected during two expeditions — winter 2010 and summer 2014 — in order to study the possibility of seasonal changes in the composition of intestinal microflora or free-living pelagic flora. To conduct the search of fluorescent symbionts and parasites, including potential pathogens, samples were collected from fish of the White, Bering and Okhotsk seas. The result of the expedition was the allocation of 21 winter strains of luminescent bacteria and 25 ones in summer samples. Species replacement of bacteria inhabiting the intestines of fish from the Bering and Okhotsk seas was demonstrated. It was probably associated with seasonal fluctuations in temperature of the sea surface waters: in summer P. phosphoreum bacteria species displace other bacteria and A. logei were prevailing in the winter cold. It is remarkable that both species belong to psychrophilic. Presence of psychrophilic luminescent bacteria in intestinal microflora of fish found in the waters of icy seas is frequent, sometimes dominant. Sequence analysis of «house-keeping» genes of two strains identified as A. logei by their biochemical parameters, these strains showed proximity to the species A. salmonicida. This inconsistency between data of biochemical and phylogenetic analysis for a number of bioluminescent strains demonstrates the need for reclassification of the species. The variability of non-coding region between conservative genes luxRl and luxC, contained in the structure of the lux-operon of A. logei was shown. Apparently, the variability of that area connected with the relatively recent loss of ability to express luxI gene, which residues are present in the area of luxRl-luxC lux-operon.
Key words: Aliivibrio logei, Photobacterium phosphoreum, bioluminescence, lux-operon, psychrophilic bacteria, bioluminescence, species composition, the White Sea, the Sea of Okhotsk, the Bering Sea, seasonal changes in the microflora.
