CC BY
25
МЕДИЦИНА
А. В. КОНОНОВ Е. О. KOCÎEPMHA
Омская государственная медицинская академия
УДК 616.36-002.2
АНАЛИЗ ИММУНОфЕНОТИПА
ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО
ИНФИЛЬТРАТА
И КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ
ГЕПАТОЦИТОВ
ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ
ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ ВИС
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ГЕПАТОБИОПТАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ ВИС ПОЗВОЛЯЕТ УСТАНОВИТЬ, ЧТО КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ИНФИЛЬТРАТА И ПАРАМЕТРЫ СТРУКТУРНОГО ОБНОВЛЕНИЯ ПАРЕНХИМЫ ДОСТОВЕРНО ОТЛИЧАЮТСЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТИОЛОГИИ И ФАЗЫ (РЕПЛИКАЦИЯ И ИНТЕГРАЦИЯ) ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.
Персистирующая антигенная стимуляция при вирусных гепатитах определяет достаточно широкий спектр вариантов иммунного ответа от адекватной реакции до развития иммунопатологического компонента в их морфогенезе [2]. Изменения характера клеточного обновления паренхимы, вызываемые воздействиями гепатотропных вирусов, могут приводить и к нарушению эпителиально-стро-мальных отношений, следствием которых может быть формирование цирроза печени, и развитию гиперпластических процессов и гепатоцеллюлярной карциномы.
Целью настоящего исследования явилась морфологическая оценка изменений клеточных форм паренхимы и стромального воспалительного инфильтрата печени в разные фазы хронических гепатитов В и С.
Задачи: в сравнительном исследовании методом поперечного среза определить характер альтеративных изменений и параметры клеточного обновления гепатоцитов, идентифицировать иммунофенотип клеток воспалительного инфильтрата в фазах репликации и интеграции вируса при хроническом гепатите типа В и С.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили пункцион-ные биоптаты печени от больных хроническим вирусным гепатитом В (39 наблюдений), и гепатитом С (28 наблюдений). В качестве этиологических маркеров использовали анти-ИСУ и анти-НВ\/ к рекомбинантным вирусным ан-
тигенам в сыворотке крови пациентов, а также полиме-разную цепную реакцию с определением ДНК-HBV и РНК-HCV в сыворотке крови и биоптате.
Биоптаты фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином для оценки общей морфологической картины поражения печени и определения гистологического индекса степени активности гепатита, и пикрофуксином по Ван-Гизону для оценки гистологического индекса степени хронизации (фиброза) процесса.
Для иммуногистохимического исследования депарафи-низированные срезы инкубировали с моноклональными антителами фирмы "Dako" (Дания), определяя экспрессии рецепторов: CD3 - общий маркер Т-лимфоцитов, CD4 - Т-хел-перы, CD8 - цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ), CD20 - В-лим-фоциты, CD25 - рецепторы к интерлейкину 2 (ИЛ 2). Исследование параметров клеточного обновления проводилось тестами: детекция апоптоза методом TUNEL (TACS TdT DAB in situ apoptosis detection Kit), определение экспрессии белков p53 и bcl-2, а также PCNA (proliferating cell nuclear antigen). Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод ("Dako", LSAB 2 Kit, Дания). Количество клеток, экспрессирующих CD-рецепторы, подсчитывали на 1мм2 гепатобиоптата, для чего окулярмикрометром определяли площадь зрения микроскопа и накапливали результат в стольких полях
Количественная характеристика различных субпопуляций лимфоцитов в воспалительном инфильтрате (перипортальном и интралобуллярном) у пациентов с НО/, и НВУ-инфекцией (на 1 мм* ткани), М±а
Субпопуляции лимфоцитов Хронический гепатит В Хронический гепатит С
Фаза репликации Фаза интеграции Фаза репликации Фаза интеграции
CD4 218,3±11,4 114,4±9,2 169,6±14,8 110,6±21,Э
CD8 190,4±4,8 58,7±5,3 124,Э±24,3 56,4+12,8
CD4/CD8 1,31 1,97 1,36 1,96
CD3 295,5±7,3 185,9±6,9 263,4±34,8 166,2±29,3
С 020 В7,3±6,9 54,9±6,7 98,7±13,3 74,8±11,4
CD25 154,3±12,8 91,5±9,8 189,7±11,4 102,3+6,7
зрения, сумма площадей которых равнялась 1мм2. Индекс пролиферации (ИП) PCNA и индекс метки (ИМ) р53 и bcl-2, а также индекс апоптоза (ИА) при TUNEL исследовании расчитывали как процентное отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу эпителиальных клеток в поле зрения при 400-кратном увеличении микроскопа. Результаты оценивались методами вариационной статистики: вычисление средней арифметической (М), а -стандартное отклонение средней; достоверность различий между группами определяли с помощью непараметрического U-кри-терия Уилкинсона (Манна-Уитни) для малых выборок.
Результаты и обсуждение
Две основные группы пациентов были сформированы по диагностированным в клинике формам хронического вирусного гепатита (В или С), которые устанавливались на основании серологической исследования и полимеразной цепной реакции. В зависимости от фазы процесса в каждой фуппе выделено 2 подгруппы: больные в фазе репликации и фазе интеграции вируса.
При HBV-инфекции в фазу репликации в сыворотке крови больных обнаруживали HBsAg, HBeAg, ДИК-HBV и аьгти-HBcortgG. В фазе интеграции выявлялся HBsAg, иногда в сочетании с анти-НВе и анти-НBeorígG. HBsAg - скринин-говый маркер инфицирования вирусом гепатита В. Определение flHK-HBV в сыворотке крови методом полимеразной цепной реакции мы считали наиболее надежным признаком репликации вируса гепатита В.
При изучёнии биоптатов печени обнаружены некоторые различия в микроскопической характеристике хронической HBV- и HCV- инфекций. Прежде всего, это касалось характера дистрофии гепатоцитов. При хроническом гепатите С почти всегда наблюдались в разном соотношении и степени выраженности гидропическая и жировая дистрофия, причем последняя чаще была доминирующей. Поданным Г И. Сто-рожакова и И.Г. Никитина (2000) [6], именно внутрипече-ночная вирусная нагрузка HCV при хроническом гепатите С является независимым предиктором развития жировой дистрофии гепатоцитов. При этом ведущую роль играет соге-протеин HCV. В наших наблюдениях более высокая степень жировой дистрофии гепатоцитов у пациентов с хроническим гепатитом С ассоциировалась с достоверно большим индексом гистологической активности гепатита, что в свою очередь предполагает возможность включения жировой дистрофии гепатоцитов в шкалу градации гистологической активности гепатита у данной категории пациентов.
Известно, что воспалительная инфильтрация стромы различной степени выраженности (перипортальная и/или внутридольковая) является обязательным компонентом морфологической картины хронической HBV- и HCV- инфекций. При этом в составе мононуклеарного инфильтрата
всегда присутствует большое количество лимфоцитов. И такая массивная лимфоцитарная инфильтрация) относится к проявлениям иммунного ответа организма хозяина на внедрение патогена (вируса) и обусловлена цитокинами (интерлейкин-1 р и фактор некроза опухоли а), продуцируемыми антигенпреэентирующими клетками при воспалении [3].
При иммуногистохимическом исследовании клеток воспалительного инфильтрата было установлено, что в подгруппах с фазой репликации вирусов при HBV- и HCV-ин-фекциях с умеренной степенью активности процесса достоверно увеличивается количество лимфоцитов всех исследованных субпопуляций: зрелых Т-лимфоцитов, Т-хел-перов, цитотоксических лимфоцитов, В-лимфоцитов (таблица 1). Полагаем, что в качестве критерия активности и прогноза хронического гепатита следует учитывать не абсолютное количество лимфоцитов на 1 мм2 гепатобиоп-тата, а отношение количества лимфоцитов-хелперов к количеству цитотоксических лимфоцитов. Ввиду того, что разные исследователи при иммуногистохимическом анализе использовали методику выявления субпопуляции лимфоцитов с наиболее удобной для них коррекцией реакции. Например, PichlerW.J. (1997) [14] при поведении иммуно-гистохимического исследования не ингибировали эндогенную пероксидазу и получали при этом разные абсолютные показатели исследуемых популяций лимфоцитов с сохранением их соотношения. Разные результаты при исследовании срезов с предварительной обработкой в микроволновой печи и без нее получали и мы, однако, отношение CD4/ CD8 в наших наблюдениях было примерно одинаковым.
В нашей работе выявились некоторые различия в сравниваемых подгруппах пациентов и по признаку экспрессии рецепторов CD25 (рецепторы интерлейкина-2). В частности, количество С025+-клеток было выше в подгруппах с фазой репликации вирусов, при этом у пациентов с хроническим гепатитом С несколько выше, чем при гепатите В, и составило 189,7±11,4 и 154,3±12,8 клеток на 1 мм2 соответственно. Такой результат можно оценить как преобладание Thl-ответа. Взаимоотношение между Th1- и ТИ2-ответом интенсивно изучаются, поскольку установлено, что вирусы и облигатные внутриклеточные паразиты инициируют Th1-ответ, а антигены гельминтов - Т112-ответ [11,14]. Возникшее при этом нарушение сложного каскада взаимодействий цитокинов и рецепторов может приводить к изменению соотношения Th1/Th2, что обычно обусловливает повышение чувствительности организма к патогену или развитие иммунопатологической реакции. Поэтому учетС025-пози-тивных лимфоцитов в сочетании с другими признаками является возможным, хотя и не облигатным критерием активности процесса [1,4].
Как известно, экспрессия воспалительного процесса коррелирует с пролиферативной активностью эпителиальных клеток. При гистологическом исследовании в
Таблица 2
Показатели пролиферативной активности и апоптоэа гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах
Хронические вирусные гепатиты Индекс пролиферации (ИП) Индекс мечения (ИМ) Индекс апоптоэа (ИА)
РСМ, % Р53, % Вс1-2, % ТиМЕ1-,%
НВУ Фаза репликации 67,2±4,в 5,4±2,6 28,313,2 11,2±3,4
Фаза интеграции 61,5±3.4 8,8±4,6 32,1 ±4,1 17,4±6.5
НСЛ/ Фаза репликации 79,4±2,8 5,8±3.6 29,4±3,7 13,5±6.7
Фаза интеграции 70,3±3,2 7.4±4,1 31,2±3,3 19,4±3,4
отдельных биоптатах в подгруппе с репликацией вируса при вирусном гепатите С мы определяли признаки, косвенно свидетельствующие об усилении регенерации гепатоцитов: клетки варьировали по размерам, состоянию ядер. Встречались как крупные одноядерные клетки с нормо-хромными ядрами, хорошо структурированными ядрышками, так и гепатоциты с очень крупными ядрами, и даже двуядерные клетки. При проведении иммуногистохими-ческого исследования с целью оценки пролиферативной активности гепатоцитов нами установлено, что индекс пролиферации РСЫА при гепатите В и гепатите С был выше в фазе репликации вирусов по сравнению с интеграцией, а у пациентов с хронической НВ\/-инфекцией несколько ниже, чем с НС\/-инфекцией (таблица 2).
Установлено, что межклеточные кооперации при хронических гепатитах, способны индуцировать апогттоз печеночных клеток [12,16]. А в инфицированных НВУ- и НС\А ге-патоцитах вирусные пептиды связываются с экспрессиро-ванными на клеточной поверхности эпителиоцитов антигенами главного комплекса гистосовместимости I класса и через посредство последнего узнаются С08-лимфоцитами. Данная популяция лимфоцитов в соответствии со своей биологической функцией должна обеспечить элиминацию вирусосодержащих клеток путем апоптоза последних [5,15].
Для оценки регуляции апоптоза гепатоцитов применяли иммуногистохимическую реакцию с определением экспрессии белка гена Ьс1-2, блокирующего апоптоз и белка гена р53, инициирующего апоптоз.
Важно отметить, что р53 не антагонист Ьс1-2, а ген, управляющий экспрессией генов семейства Ьс1-2 [8,19]. Высокое содержание Ьс1-2 в клетке способствует ее выживанию, предохраняя от апоптоэа, в то же время высокая концентрация р53 приводит к повышению концентрации в клетке Вах (ген-активатор клеточной смерти) и уменьшению концентрации Ьс1-2, что по образному выражению КегпоЬап N. и Сох Ь. (1996) [9] «... сдвигает рукоятку реостата жизни в сторону смерти путем апоптоза». Таким образом, существует тонкая система равновесия между пролиферацией и апоптозом (жизнью и управляемой смертью), которая контролируется двумя семействами генов [7,13].
Нами обнаружены некоторые различия в интенсивности апоптоза гепатоцитов в зависимости от фазы процесса (таблица 2). Так, при хроническом гепатите В в фазу интеграции вируса ИМ р53 составлял 8,8±4,6%, а в фазу репликации - 5,4±2,6. Этот факт, свидетельствует об уменьшении содержания и /или снижении активности р53 клетки-хозяина (за счет противодействия со стороны вируса гепатита В), обеспечивающего альтруистическую гибель инфицированных клеток. Показатели экспрессии р53 в группе с хроническим гепатитом С были несколько ниже по сравнению с фуппой хронического гепатита В. Индекс метки Ьс1-2 был значительно выше по сравнению с ИМ р53 в сравниваемых подгруппах. Но это, по-видимому, не исключает вероятность того, что гепатотропные вирусы «используют» белок гена Ьс!-2 (а возможно и другие гены, отличные
от Ьс1-2) для ингибиции апоптоза инфицированных печеночных клеток.
Спорным остается вопрос о том, какой вариант смерти гепатоцитов (апоптоз или некроз) является доминирующим при хронических вирусных гепатитах [2,12,18]. Патологическую гибель клетки традиционно относят к некрозу, но патофизиологические процессы в печени могут вести к повреждению клеток, и их гибель может с одинаковой вероятностью относиться и к процессу апоптоза, и к процессу некроза [5].
При использовании ТиМЕ1.-метода были получены результаты, свидетельствующие о том, что при хронических гепатитах В и С в равной степени имеют место и апоптоз, и некроз гепатоцитов. Индекс апогттоза (коричневое ядерное окрашивание) и индекс метки (коричневое окрашивание цитоплазмы) были примерно равными и составили при хроническом гепатите В в подгруппе с фазой репликации вируса 11,2±3,4%и 13,4±4,9% соответственно.
В экспериментальных моделях апоптоза гепатоцитов, например, после инъекции р-трансформирующего фактора роста, наблюдали повышение уровня аминотрансфераз [10,17]. И этот феномен объясняли тем, что количество клеток, подвергающихся апоптозу, превышает фагоцитарную возможность купферовских клеток. Апоптозные тельца, не поглощенные фагоцитами, подвергаются вторичному некрозу, следствием этого является утечка внутриклеточного содержимого, что может вызвать воспалительную реакцию. И поэтому повышение уровня аминотрансфераз (широко известный показатель повреждения печени) может отражать как повышенный апоптоз, так и некроз гепатоцитов.
Таким образом, мы считаем возможным и удобным характеризовать гибель гепатоцитов апоптозным (самонаправленный, активная гибель) и неапоптозным (случайная гибель клеток) процессами.
На основании вышеизложенного можно предположить, что в условиях длительной альтерации гепатоцитов, обусловленной непрерывным или рецидивирующим воздействием антигенов (инфектов), возникает усиление пролиферации печеночных клеток, более выраженное при хроническом гепатите С. Вследствие этого, а также в результате нарушения контактов не только между печеночными клетками, но и взаимодействия между последними и иммуно-компетентными клетками, в частности лимфоцитами, ослабляется морфогенетический контроль за процессами обновления гепатоцитов. В результате на фоне нарушения баланса анти- и проапоптозных потенций инфицированных клеток (за счет противодействия со стороны внутриклеточных паразитов - вирусов) наблюдается ускорение пролиферации печеночных клеток при с возможным замедлением дифференцировки их, что создает предпосылки для развития при хронических вирусных гепатитах гиперпластических процессов в паренхиме печени.
Выводы
1 Комплексный морфологический анализ биогттатов печени (световая микроскопия, иммуногистохимия, морфометрия)
при хронических вирусных гепатитах В и С позволяет установить, что характер альтеративных изменений гепато-цитов, клеточный состав воспалительного инфильтрата, параметры структурного обновления паренхимы достоверно отличаются в зависимости от этиологии и фазы инфекционного процесса.
2. При сравнительном гистологическом исследовании гепатобиоптатов пациентов хронической HBV- и HCV-инфекцией можно выделить диагностические признаки, среди которых наибольшей значимостью для верификации гепатита С обладают сочетание жировой дистрофии гепато-цитов с гидропической, характер поражения желчных протоков и наличие лимфоидных фолликулов как в портальных трактах, так и интралобулярно.
3. Клеточное обновление гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах В и С достоверно изменяется в зависимости от фазы процесса: для фазы репликации вируса характерны высокие показатели пролиферации печеночных клеток, а в фазе интеграции - пролиферация клеток замедляется при увеличении темпов апоптоза.
4. Иммунофенотип клеток воспалительного инфильтрата в фазу интеграции вируса и при гепатите В и гепатите С характеризуется снижением количества иммуноком-петентных клеток, располагающихся как в составе перипор-тальных, так и внутридольковых воспалительных инфильтратов, а в фазу репликации - увеличением клеток, экспрес-сирующих CD3-, CD4-, CD8-, С025-рецепторы.
Литература
1. Андерсен Л., Норгаард А., Беннедсен М. Клеточный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии / Под ред. В.Т. Ивашкина, Ф. Мегро, Т.Л. Лапиной. -М.: «Триада-Х», 1999. -С. 46-53.
2. Игнатова Т.М., Серов В В. Патогенез хронического гепатита С//Арх. патол. -2001. - № 3. - С. 54-59.
3. Кононов А. В., Харенко О. А., Поморгайло Е.Г. и др. Анализ тканевых антигенов слизистой оболочки и лимфопроли-феративный ответ при хёликобактериозе // Материалы 5-й сессии Российской группы по изучению Helicobacter pylori. -Омск, 1997.-С. 16-17.
4. Кононов А.В. Местный иммунный ответ на инфекцию Helicobacter pylori // Helicobacter pylori: революция в гастроэнтерологии /Подрея В.Т. Ивашкина, Ф. Метро, Т.Л. Лапиной. -М.: «Триада-Х», 1999. -С. 29-45.
5. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая клеточная смерть // Биохимия. - 2000. -Т.65. -Вып. 8.-С. 1029-1046.
6. СтрожаковПИ., Никитин И.Г., Банин В.В. и др. Жировая дистрофия гепатоцитов и хронический HCV-гепатит // Арх. патол. - 2000. - Т.62. - № 6. - С. 27-32.
7. Dickman S. First р53 relative may be a new tumor suppressor//Science..-1997. -V. 277. - № 5332. - P. 1605-1606.
8. Jacobson M.D. Apoptosis: bcl-2 - related proteins get - connected II Curr. Biol. -1997. - Vol. 7. - P. R277-R281.
9. Kemohan N., Cox L. Regulation of apoptosis by bcl-2 and its related protein: immunochemical challenges and therapeutic implications // J. Pathol. -1996. - V. 179. - P. 1-3.
10. Livingston D.J. In vitro and in vivo studies of ICE inhibitors II J. Cell. Biochem. -1997. -V. 64. - № 1. - P. 19-26.
11. Oriss Т., McCarthy S., Morel B. et al. Crossregulation between T helper cell Th1 and Th2 proliferation by IFN-g involves interference with IL-1 //J. Immunol. -1997. - V. 158. - № 8. -P. 3666-3672.
12. PatelT., Roberts L.R., Jones B.A. et al. Dysregulation of apoptosis as a mechanism of liver disease: An overview // Semin LiverDis.-1998.-V. 18.-P. 105-114.
13. Pellegata N.S., Ranzani G.N. The significance of p53 mutations in human cancer // Eur. J. Histochem. -1996. -V. 40. - № 4. - P. 273-282.
14. PihlerW.J. Regulationderimmunantwort: dasTh1/Th2-konzept//Schweiz. Med. Wochenschr. -1997. - Bd. 127. - H. 9. -S. 341-348.
15. Sieg S., Huang Y., Kaplan D. Viral regulation of CD95 expression and apoptosis in T lymphocytes II J. Immunol. -1997. -V. 159.-№3.-P. 1192-1199.
16. Skaro-MilicA., BrajuskovicG., Hristic M. Apoptosis and malignity //Acta Biol, lugosl. C. -1997. - V. 33. - Na 1. - S. 1-31.
17. TeagueT., Morrack P., Kappler J., VellaA. IL-6 rescues resting mouse T cells from apoptosis // J. Immunol. -1997. - V. 158,-№2.-P. 5791-5796.
18. Terai S., Noma Т., KimuraT. etal. Wild-type p53 gene-induced morphological changes and growth suppression in hepatoma cells // J. Gastroenterol. -1997. - V. 32. - № 3. - P. 330-337.
19. Yonish-Rouach E. A question of life or death: the p53 tumor supressorgene // Pathol. Biol. -1997. -V. 45. - № 10. -P. 815-823.
КОНОНОВ Алексей Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, проректор по научно-исследовательской работе, заведующий кафедрой патологической анатомии. КОСТЕРИНА Екатерина Олеговна, аспирант кафедры патологической анатомии.
