CC BY
119
Fundamental studies -------------------
Шифр специальности: 03.03.04 УДК 61:57.086
ANALYSIS IHC MARKERS OF BREAST CARCINOMA CELLS WITH PROTEIN EXPRESSION LEVELS OF TOPOISOMERASE IIa
Arutjunjan E.V., Novikova E.A.
1 Ural State Medical University, Ekaterinburg
Department of Histology, Cytology and Embryology
Onufriyeva division commander, 20a, Ekaterinburg, Russia, 620149
In breast cancer the expression level of topoisomerase IIa (TOP2a) can have independent predictive value to anthracycline antibiotic. The aim of our research is to determine the presence of protein expression patterns between topoisomerase IIa and the expression of Ki-67, HER-2/neu, ER PR in breast carcinoma using the algorithm CART. The expression of TOP2a, Ki-67, Her2-neu, ER, PR were studied by immunohistochemistry in 532 cases of infiltrating breast carcinoma Expression of topoisomerase IIa was evaluated on a scale by L. Usha (overexpression of > 35%)._All cases were divided into two groups which depending on the value of topoisomerase IIa. In cases of group 1 with the value entered TPI > 35% (n = 80, 15%) in group 2 cases with TPI < 35% (n = 452, 85%)._Overexpression of topoisomerase IIa was most pronounced in the breast carcinoma with the level of Ki-67 more than 35%. The level expression of topoisomerase IIa dependence on expression of Her-2/neu, ER, PR is not detected.
Keywords: overexpression, amplification, immunohistochemistry (IHC), topoisomerase IIa (Top IIa), epidermal growth factor (HER-2/neu), Ki-67, ER, PR.
АНАЛИЗ ИГХ МАРКЕРОВ КЛЕТОК КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С УРОВНЕМ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ТОПОИЗОМЕРАЗЫ 11а
Арутюнян Е.В., Новикова Е.А.
Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург Кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии ул. Онуфриева начдива, 20а, Екатеринбург, Россия
При раке молочной железы уровень экспрессии топоизомеразы 11а (ТОР2а) может иметь самостоятельное предиктивное значение к антибиотикам группы антрациклинов. Цель работы — определить наличие закономерностей между экспрессией белка топоизомеразы 11а и экспрессией Ю-67, HER-2/neu, ER PR в клетках карциномы молочной железы с помощью алгоритма CART. Исследованы 532 случая инфильтративной карциномы молочной железы на экспрессию ТОР2а, Кь67, Нег2-пеи, ER, PR иммуногистохимическим методом. Экспрессия топоизомеразы 11а оценивалась по шкале, предложенной Ь. Ushа (гиперэкспрессия > 35%). Все случаи были разделены на две группы в зависимости от значения топоизомеразы 11а. В группу 1 вошли случаи со значением ТР1 > 35% (п = 80; 15%), в группу 2 случаи с ТР1 < 35% (п = 452; 85%). Г иперэкспрессия по топоизомеразе 11а наиболее выражена в клетках карциномы молочной железы с уровнем К>67 более 35%. Зависимость уровня экспрессии топоизомеразы 11а от экспрессии Нег-2/пеи, ER, PR не обнаружена.
Ключевые слова: гиперэкспрессия, амплификация, иммуногистохимия (ИГХ), топоизомераза 11а (Тор 11а), эпидермальный фактора роста (HER-2/neu), Кь67, ER, PR.
Актуальность. Достижения последних лет в области молекулярной биологии позволили выявить многие особенности фенотипа, механизмы канцерогенеза карциномы молочной железы: индукцию опухолью сигналов роста, высокий уровень репликационного потенциала, резистентность к рост-ингибиторным сигналам, уклонение от апо-
птоза, ангиогенез, тканевую инвазию и метастази-рование. Описано более ста факторов прогноза, дающих представление о биологическом поведении опухоли [1].
В прогностическом плане среди известных маркеров опухолевых клеток значимое место занимает определение уровня пролиферативной
—---------- —
~ 3 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 ISSN 2226-7425
The journal of scientific articles “Health & education millennium”, 2014, volume 16, no. 3
----------------------------------
активности. Повышение уровня пролиферации свидетельствует о худшем прогнозе у пациенток, не получавших ранее лечения [3].
Одним из маркёров пролиферации клеток карциномы молочной железы является топоизо-мераза IIa (Top IIa). Топоизомераза IIa — ядерный фермент, необходимый в процессах репликации ДНК и пролиферации клеток. С другой стороны, топоизомераза имеет отношение к репарации ДНК, что ведет к повышению выживаемости опухолевых клеток. Изучение гена и экспрессии Top IIa стало актуальным после выявления эффективности ответа опухоли на лечение антибиотиками группы антрациклинов, направленных на ингибирование данного белка.
Ген TOP IIa расположен близко к гену, кодирующему человеческий эпидермальный фактора роста (HER-2/neu) на хромосоме 17q12-21. Амплификация HER-2/neu связана с аберрацией TOP IIa
гена, что затрудняет представление о том, какой ген наиболее тесно связан с чувствительностью к антрациклинам. Предполагается, что нарушения в гене HER-2/neu вызывают амплификацию гена TOP IIa по механизму breakage-fusion-bridge. Кроме того, амплификация гена топоизомеразы TOP IIa не всегда означает его экспрессию, но амплификация гена HER-2/neu сопровождается его экспрессией практически всегда [5]. Как следствие, во многих исследованиях HER-2/neu статус учитывается при отборе пациентов для анализа амплификации TOP IIa. В настоящее время топоизоме-раза IIa исследуется при условии гиперэкспрессии или амплификации HER-2/ neu.
В ряде исследований выявлена высокая частота экспрессии TOP IIa в HER-2/neu — негативных опухолях, что ставит под сомнение общее мнение о том, что изменения TOP IIa специфично для HER-2/neu -позитивных опухолей и может считаться прогностическим и предиктивным фактором только для этой подгруппы [6]. Вопрос о наличии или отсутсвии взаимосвязи между экспрессией топоизомеразы IIa и Her2/neu до конца не решен.
Выявлено коррелятивное повышение уровня топоизомеразы при одновременной гиперэкспрессии белка Ki-67, который является прогностическим фактором при раке молочной железы [2]. Ki-67 — это ядерный белок, который связан с клеточной пролиферацией и экспрессируется в фазах мито-
тического цикла S, G1, G2, и M, но не G0. В образцах нормальной ткани молочной железы он также экспрессируется, но на низком уровне (менее 3% клеток в ER-негативных опухолях, но не в ER-позитивных) [5].
Материал и методы исследования. В качестве объекта исследования в работе использовался материал 532 случаев инфильтративной карциномы молочной железы. Весь собранный материал исследовался гистологическим, иммуногистохи-мическим, и статистическими методами. Исследования были выполнены в лаборатории патоморфологии ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий (зав. лаб. — д.м.н., проф. С.В. Сазонов) на депарафинизированных срезах с использованием автоматической системы для проведения ИГХ окрашивания Universal Staining System Autosteiner Dako (Дания) и моноклональных мышиных антител Ki-67 и топоизомераза IIa (DakoCytomation). Для ИГХ исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине не более 24 часов, затем подвергали стандартной гистологической обработке. Демаскировка антигенных детерминант проводилась в миниавтоклаве Pascal (DakoCyto-mation), условия: 10 мин. при 15 psi (121 °C) в Target Retrival Solution (Dako, S1699). Использовали систему визуализации EnVision+ Dual Link System — HRP (Dako, К4061). Антигенреактивные клетки контрастировали хромогенным субстратом (3,3-диаминобензидин в буферном растворе — DAB). DAB-позитивные клетки идентифицировали по коричневому окрашиванию их ядер. Проводили постановку негативного контроля на тех же срезах исследуемой группы. Оценку ИГХ реакции проводили с путем определения % клеток, ядра которых экспрессируют исследуемые антигены. Экспрессию топоизомеразы IIa оценивали по шкале L. Usha (гиперэкспрессия > 35%), анализ данных проводился с помощью программного пакета The Salford Predictive Modeler 7.0.
Результаты исследования и обсуждение. Все случаи (n = 532) были разделены на две группы в зависимости от значения топоизомеразы IIa. В группу 1 вошли случаи со значением TPI > 35% (n = 80; 15%), классифицирующиеся как гиперэкспрессия по данному белку. В группу 2 случаи с TPI < 35% (n = 452; 85%). В каждой из групп рассчитывали распределение маркёров по важности с использованием алгоритма CART и построением классификационного дерева решений.
—---------- —
~ 4 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Fundamental studies -------------------
Преимуществом алгоритма CART является определенная гарантия того, что существующие в исследуемой совокупности детерминации будут выявлены. Результаты визуализируются в виде бинарного решающего дерева. В каждом узле дерева разделение идет только по одной переменной, на каждом шаге построения дерева алгоритм последовательно сравнивает все возможные деления для всех атрибутов и выбирает наилучший атрибут и наилучшее деление для него.
Таким образом, данный алгоритм позволяет выявить закономерности сцепления маркёров опухоли. В дальнейшем это поможет определить оптимальные показания для отбора пациентов для проведения иммуногистохимического исследования по топоизомеразе 11а.
Распределение маркёров по важности в исследуемых группах представлена в табл. 1.
Таблица 1
Распределение маркеров по важности (Variable Importance)
Переменная Значение важности переменной, %
группа 1 TPI > 35%, n = 80, цена ошибки = 0,3 группа 2 TPI < 35%, n = 452, цена ошибки = 0,25
Ю-67 100,0000 100,0000
Her-2/neu 40,7768 71,9795
Pr 35,2624 68,6833
Er 27,1729 38,3159
В группе 1 основным маркёром, связанным с топоизомеразой IIa является белок Ki-67. Важно отметить, что гиперэкспрессия по топоизомеразе IIa (группа 1) наиболее выражена в опухоли с уровнем Ki-67 более 35% (71 случай из 80). Какой-либо чёткой зависимости от уровня экспрессии Her-2/neu, рецепторов эстрогена и прогестерона в данной группе не выявлено.
В группе 2 основным маркёром, связанным с топоизомеразой IIa также является белок Ki-67. Алгоритмом CART выделено множество подгрупп Ki-67 в зависимости от уровня прогесторона и Her-2/neu. Однако, в каждой подгруппе цена ошибки более 0,3, что указывает на низкую статистическую значимость. Это может быть связанно с особенностями определения уровня гиперэкспрессии топоизомеразы IIa, так как до сих пор нет единого подхода к оценке уровня ее экспрессии и стандартизированной шкалы оценки гиперэкспрессии топоизомеразы IIa. Разные исследователи определяют уровень гиперэкспрессии как > 5% [4] так > 45% [6]. Существует подход, основанный на сравнении экспрессируемости TOP2a и Ki-67. В случае если экспрессия топоизомеразы IIa равна, либо ниже экспрессии Ki-67, уровень экспрессии топоизомеразы признается нормальным. Если экспрессия топоизомеразы превышает экспрессию
К1-67, уровень ее экспрессии признается повышенным. С одной стороны, данный метод позволяет установить взаимосвязи между экспрессией топоизомеразы 11а и экспрессией Ю-67, что важно для лучшего понимания биологического поведения опухоли. Но далеко не всегда экспрессия топоизомеразы превышает экспрессию Ю-67 и приходится делать вывод о нормальной экспрессии то-поизомеразы в ряде случаев, когда процент клеток, экспрессирующих топоизомеразу, может достигать 80. Тогда целесообразно использовать шкалу оценки. В нашей работе использована шкала, предложенная Ь. Ushа с соавт. Она позволяет реально дифференцировать экспрессию топоизоме-разы 11а.
Выводы
1. К1-67 лучше других маркеров отражает уровень экспрессии топоизомеразы 11а поэтому данный подход используется для определения гиперэкспрессии TOP2A.
2. Гиперэкспрессия по топоизомеразе 11а наиболее выражена в клетках опухоли РМЖ с уровнем К1-67 более 35%.
3. Зависимость уровня экспрессии топоизомеразы 11а от экспрессии Нег-2/пеи, эстрогена, прогестерона не обнаружена.
—---------- —
~ 5 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ — головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ)
Since 1999 ISSN 2226-7425
The journal of scientific articles “Health & education millennium”, 2014, volume 16, no. 3
----------------------------------
ЛИТЕРАТУРА
1. Боженко В. К. Профиль экспрессии генов как
фактор прогноза при раке молочной железы. Обзор [Электронный ресурс] / В.К. Боженко, Н.И. Рожкова, Е.А. Кудинова и соавт. // Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии. 2011. Выпуск 11.
http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v11/papers/bozh2_v11 .htm. Статья опубликована 2 декабря 2011 г.
2. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии топоизомеразы IIa в клетках карциномы молочной железы / С.В. Сазонов, Е.А. Новикова, Е.В. Ару-тюнян // Вопросы онкологии: Материалы VIII всероссийского съезда онкологов. 2013. Т. 59. Приложение к № 3. Т. 1. С. 323—324.
3. Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В. Опухолевые маркёры при раке молочной железы // Врач. 2011. № 12. С. 2—12.
4. Bhargava R. HER-2/neu and Topoisomerase IIa Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Breast Carcinomas / Rohit Bhargava, MD, Priti Lal, and Beiyun Chen, MD, PhD // Am J Clin Pathol 2005; 123:889— 895.
5. Faratian D, Bartlett J (2008) Predictive markers in breast cancer-the future. Histopathology 52(1):91—98.
6. Zaczek A.J. Prognostic Significance of TOP2A Gene Dosage in HER-2/NEU-Negative Breast Cancer/ Anna J. Zaczek, Aleksandra Markiewicz, Barbara Seroczynska, et all // Oncologist. 2012. № 17(10). Р. 1246—55.
7. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2012. Т. 14. № 2.
8. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2013. Т. 15. № 3. URL: http://e-pubmed.org/isu15-3.html
REFERENCES
1. Bozhenko V.K., Rozhkova N.I., Kudinova E.A. Vestnik Rossiyskogo nauchnogo tsentra rentgenoradiologii, 2011, Issue 11, available at: http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/ v11/papers/bozh2_v11.htm
2. Sazonov S.V., Novikova E.A., Arutyunyan E.V. Voprosy onkologii: Materialy VIII vserossiyskogo s ’ ’ezda onkologov, 2013, volume 59, Prilozhenie k no. 3, volume. 1, pp. 323—324.
3. Semiglazov V.F., Semiglazov V.V. Vrach, 2011, no. 12, pp. 2—12.
4. Bhargava R. HER-2/neu and Topoisomerase IIa Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Breast Carcinomas / Rohit Bhargava, MD, Priti Lal, and Beiyun Chen, MD, PhD // Am J Clin Pathol 2005; 123:889— 895.
5. Faratian D, Bartlett J (2008) Predictive markers in breast cancer-the future. Histopathology 52(1):91—98.
6. Zaczek A.J. Prognostic Significance of TOP2A Gene Dosage in HER-2/NEU-Negative Breast Cancer/ Anna J. Zaczek, Aleksandra Markiewicz, Barbara Seroczynska, et all // Oncologist. 2012. № 17(10). Р. 1246—55.
7. Zhurnal nauchnykh statey. Zdorov'e i obrazovanie vXXI veke, 2012, volume 14, no. 2.
8. Elektronnyy nauchno-obrazovatel'nyy vestnik «Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke», 2013, volume 15, no. 3, available at: http://e-pubmed.org/isu15-3.html
Рецензенты:
1. С.В. Сазонов — доктор медицинских наук, профессор, зам. директора по науке ГБУЗСО «Институт медицинских клеточных технологий», зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Уральский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Екатеринбург.
2. С.М. Демидов — доктор медицинских наук профессор, заслуженный врач РФ, зав. кафедрой онкологии ГБОУ ВПО «Уральский Государственный Медицинский Университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Екатеринбург.
