CC BY
8УДК 579.25
О. В. Евдокимова, А. А. Муратова, А. Э. Охремчук, М. А. Сиколенко, Л. Н. Валентович
АНАЛИЗ ГЕНОМОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ПЕРСПЕКТИВНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СИСТЕМ ЭКСПРЕССИИ
ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ
Государственное научное учреждение «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220084, г. Минск, ул. Акад. Купревича, 2 e-mail: [email protected]
Выполнено секвенирование и сборка de novo геномов бактерий Lacticaseibacillus rhamnosus БИМ B-189, Lactococcus lactis БИМ В-1834 и Lactococcus cremoris NZ3900 — потенциальных реципиентов векторов для экспрессии гетерологичных генов. Анализ геномов in silico подтвердил безопасность штаммов: показал отсутствие генов токсинов, факторов вирулентности и детерминант, ассоциированных с переносом устойчивости к антибиотикам. Для всех штаммов предсказаны кластеры синтеза вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов. Анализ мобильных генетических элементов выявил нестабильность генома бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189. У бактерий L. lactis БИМ В-1834 обнаружены три низкокопийные плазмиды, одна из которых содержит детерминанты конъюгативного переноса. Обсуждается возможность использования штаммов для создания систем экспрессии гетерологичных генов.
Ключевые слова: Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Lacticaseibacillus rhamnosus, полногеномное секвенирование, аннотация генома.
Для цитирования: Анализ геномов молочнокислых бактерий, перспективных для создания систем экспрессии гетерологичных генов / О. В. Евдокимова, А. А. Муратова, А. Э. Охремчук [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Ин-т генетики и цитологии НАН Беларуси; редкол.: А. В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2024. - Т. 37. - С. 82-94.
Введение
Молочнокислые бактерии (МКБ) — это обширная несистематическая группа, объединяющая представителей родов Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc и др., которые имеют статус безопасных микроорганизмов (GRAS — generally recognized as safe), подтвержденный длительным использованием для получения кисломолочных, ферментированных растительных и мясных продуктов [1]. Статус безопасности определяет перспективность применения МКБ для производства и доставки биоактивных молекул в организм человека или животных. Одним из успешно реализуемых направлений использования МКБ является применение отдельных штаммов в качестве пробиоти-ков — живых микроорганизмов, которые при приеме в достаточном количестве приносят пользу здоровью хозяина [2]. В альтернатив-
ном подходе используются МКБ для синтеза и/или доставки гетерологичных биоактивных молекул [3-5], что связано с созданием генно-инженерных штаммов. Благодаря развитию и внедрению методов модификации генома, биоинженерные МКБ, и особенно пробиотиче-ские штаммы, могут стать терапевтическими системами следующего поколения [6].
Для любого микроорганизма, планируемого для применения в биотехнологической промышленности, важным критерием отбора является безопасность. До недавнего времени основными методами оценки безопасности штамма являлись эмпирические тесты на основе фенотипического проявления признаков и исследование токсикологических воздействий на животных. Развитие методов полногеномного секвенирования и использование биоинформатического анализа позволяет выявлять наличие в геноме потенциальных генов,
кодирующих устойчивость к антибиотикам, патогенность и другие угрожающие здоровью факторы [7]. Анализ полного генома дает возможность выявить гены определенных метаболических путей, присутствие генетических детерминант устойчивости к стрессовым факторам и на основе этих данных предсказывать ферментативные возможности штамма и его пробиотический потенциал [8]. По наличию в пределах генома активных мобильных генетических элементов, таких как транспозоны, IS-элементы и профаги, можно судить о стабильности генома, а по присутствию компонентов систем рестрикции-модификации (Р-М), CRISPR-Cas и других специализированных «антифаговых» систем — о защите от чужеродной ДНК [9]. Большинство систем экспрессии гетерологичных генов реализовано на основе коммерческих штаммов Lactococcus lactis и ограниченное количество — на основе Lactobacillus spp. Поэтому актуальным является поиск новых штаммов для разработки и усовершенствования систем экспрессии в МКБ [10, 11].
Ранее нами были отобраны коллекционные штаммы МКБ L. lactis БИМ В-1834 и Lacticaseibacillus rhamnosus БИМ B-189 как перспективные микроорганизмы для экспрессии гетерологичных генов, наряду с коммерческим штаммом L. lactis NZ3900, на основании ряда параметров: способности к трансформации, чувствительности к антибиотикам, гены устойчивости к которым используются в качестве селективных маркеров в векторных конструкциях, и отсутствию природных плазмид (данные в печати). Бактерии L. lactis БИМ В-1834 были выделены в 2022 г. из закваски для приготовления кисломолочных продуктов сотрудниками ГНУ «Институт микробиологии НАН Беларуси». Видовая принадлежность была установлена на основании сходства последовательностей генов 16S рРНК, секвенирование других локусов генома не осуществлялось. Штамм Lc. rhamnosus БИМ B-189, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов (VKM B-574), является типовым штаммом вида и находится во многих коллекциях микроорганизмов под номерами DSM 20021, NBRC 3425, NRRL B-442, NCTC 13764 и др. На момент секвенирования в базе данных GenBank было
депонировано четыре последовательности генома данного штамма (под номерами соответствующих коллекций), собранные до контигов или скаффолда. В публикациях представлено только короткое сообщение, анонсирующее секвенирование генома штамма Lc. rhamnosus NRRL B-442 [12], детального анализа генома этого штамма не удалось найти. В предшествующей работе по подбору штаммов нам не удалось выделить плазмидную ДНК из бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189, выросших после трансформации плазмидой pLF14, при этом введение ее в клетки подтверждалось методом ПЦР (данные в печати). Поэтому для полногеномного секвенирования использовали трансформантов бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189, чтобы дополнительно установить копийность плазмиды pLF14 в клетках данных бактерий. Штамм L. lactis NZ3900 является компонентом коммерческой системы экспрессии генов под контролем низина (NICE®) [13]. В базе данных GenBank имеется последовательность генома Lactococcus cremoris MG1363 — предшественника всех генно-инженерных штаммов, сконструированных для системы NICE®, последовательность штамма NZ3900 отсутствует.
Целью настоящей работы являлось сек-венирование и анализ геномов бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189, L. lactis NZ3900 и L. lactis БИМ В-1В34 и последующая оценка перспективности их использования в качестве штаммов для эффективной экспрессии гетеро-логичных генов.
Материалы и методы
Бактерии рода Lactococcus выращивали в жидкой или на агаризованной среде М17 (Himedia, M1029) с добавлением глюкозы 0,5% при температуре 30 °С, бактерии Lc. rhamnosus БИМ B-189 — в жидкой или на агаризованной среде MRS (Himedia, GM641) при 37 °С в условиях анаэробиоза или микроаэробиоза.
Тотальную ДНК для полногеномного секвенирования выделяли из одной изолированной колонии с помощью набора «Bacteria DNA Preparation - Solution Kit» (Jena Bioscience, PP-206). Секвенирование на платформе MiSeq (Illumina, США) проводили с использованием комплекта реактивов
«MiSeq Reagent Kit v3» (Illumina, MS-102-3003, США); приготовление библиотек фрагментов ДНК осуществляли с использованием набора «NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit for Illumina» (New England Biolabs, E7805, США) согласно инструкции производителя. Секвенирование на платформе MinION (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания) проводили с использованием ячейки R9.4.1 или R10.4.1 (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания, FLO-MIN106 или FLO-MIN114); приготовление библиотек фрагментов ДНК осуществляли с использованием набора «Ligation Sequencing Kit» (Oxford Nanopore Technologies, Великобритания, SQK-LSK109 или SQK-LSK114).
Для упрощения сборки нанопоровых прочтений их предварительно сортировали по таксономическим и качественным признакам с помощью набора программ Barapost [14]. Обработанные прочтения использовали для de novo сборки геномов при помощи программ Flye v.2.9.3 и Canu v.2.2. Для исправления ошибок, характерных для нанопоровых данных, использовались прочтения, полученные на приборе MiSeq, в которых с помощью утилиты Trimmomatic v.0.39 были удалены низкокачественные (Q <18) и адаптерные последовательности.
Копийность плазмид рассчитывали по соотношению степени покрытия прочтениями плазмиды и последовательности хромосомы. Аннотацию нуклеотидных последовательностей проводили с помощью конвейера аннотации прокариотических геномов (PGAP) [15]. Поиск детерминант антибиотикорезистент-ности, точечных мутаций, связанных с резистентностью, и некоторых других классов генов осуществляли с использованием программных продуктов ResFinderFG-2.0 [16], AMRFinderPlus [17] и CARD [18]. Поиск генов патогенности и вирулентности выполняли с использованием программ VirulenceFinder v.2.0.5 и PathogenFinder, представленных на сайте Центра геномной эпидемиологии и ресурса VFDB (Virulence Factor Database) [19]. Для обнаружения генетических детерминант, ответственных за продукцию вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов, применяли программы BAGEL4 [16], PRISM v4.4.5 [20] и AntiSMASH 7.0 [21]. Поиск
профаговых последовательностей в анализируемых геномах осуществляли с помощью веб-сервера PHASTEST [21]; систем CRISPR-Cas с помощью — CRISPRCasFinder, информацию о системах рестрикции-модификации брали в базе данных REBASE [22].
Результаты и обсуждение
Полученные в результате полногеномного секвенирования и последующей de novo сборки нуклеотидные последовательности хромосом изучаемых бактерий сравнивали с типовыми геномами прокариот из Банка данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) с помощью сервиса «DFAST Quality Control» для уточнения таксономического статуса исследуемых штаммов. Результаты сходства видов на основании расчета средней нуклеотидной идентичности (СНИ) представлены в таблице 1. Таксономический статус штамма L. lactis NZ3900 следует заменить на Lactococcus cremoris, поскольку бактерии, ранее классифицированные как L. lactis subsp. cremoris, в 2021 г. выделены в отдельный вид L. cremoris [23]. Наибольшая степень сходства штамма NZ3900 выявлена с типовым штаммом вида L. cremoris (номера в коллекциях ATCC 19257 и LMG 6897). Как видно из таблицы 1, СНИ секвенированного нами генома Lc. rhamnosus БИМ B-189 и депонированных последовательностей данного штамма другими исследователями близка к 100%. Дополнительно решалась задача установить копийность плазмиды pLF14, введенной в клетки данных бактерий. На основании данных секвенирования, плазмида pLF14 независимо реплицируется в клетках бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189, среднее число копий на клетку равно 29.
Таксономический статус бактерий L. lactis БИМ В-1834 был подтвержден, хромосомная последовательность имеет наибольшую степень сходства с последовательностями типового штамма Lactococcus lactis subsp. lactis, депонированными в GenBank под номерами соответствующих коллекций ATCC 19435, DSM 20481 и др. При сборке генома L. lactis БИМ В-1834 было выявлено, что помимо хромосомы, бактерии содержат три плазмиды — 38 149 п. н., 35 023 п. н. и 25 060 п. н., им присвоены обозначения
Таблица 1
Результаты сравнения нуклеотидной последовательности хромосом исследуемых бактерий с
типовыми геномами прокариот
Исследуемый штамм Ближайшие родственные штаммы из баз данных NCBI (код доступа в базе данных Assembly NCBI) СНИ, % (выровнено, %)
Lactococcus cremoris ATCC 19257 (GCA_002441765.1) 98,16 (75,99)
L. lactis NZ3900 Lactococcus cremoris subsp. tructae DSM 21502 (GCA_002441825.1) 98,06 (79,18)
Lactococcus cremoris LMG 6897 (GCA_001622295.1) 98,01 (76,44)
Lacticaseibacillus rhamnosus DSM 20021 (GCA_001435405.1) 100,00 (98,56)
Lc. rhamnosus Lacticaseibacillus rhamnosus NCTC 13764 (GCA_900636965.1) 99,99 (99,84)
БИМ B-189 Lacticaseibacillus rhamnosus NRRL B-442 (GCA_002849515.1) 99,99 (98,44)
Lacticaseibacillus rhamnosus NBRC 3425 (GCA_007990855.1) 99,98 (96,98)
Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 (GCA_001456385.1) 98,79 (85,49)
L. lactis БИМ В-1834 Lactococcus lactis subsp. lactis JCM 5805 (GCA_000835975.1) 98,67 (86,51)
Lactococcus lactis DSM 20481 (GCA_029023865.1) 98,66 (88,05)
рКЬ1834-38, рКЬ1834-35 и pLL1834-25 соответственно. Низкая копийность плазмид и размер, соответствующий размеру фрагмен-тированной хромосомной ДНК, не позволили идентифицировать присутствие природных плазмид с помощью электрофореза в агароз-ном геле на этапе отбора штаммов (данные в печати). Плазмида рКЬ1834-38 содержится в клетках в одиночной копии и почти идентична (более 99% при покрытии 99%) депонированным в GenBank плазмидам Ь. lactis р1ВВ417_Ргёа_2 (СР087701.1) и безымянной плазмиде штамма FDAARGOS_867 (СР084188.1) Плазмида pLL1834-25 имеет наибольшую степень сходства (99,06%) с последовательностью pNCDO557A (РР589826.1), а рКЬ1834-35 — 99,69% идентичность с плаз-мидой pUCCL620B (РР556492.1) с покрытием 51 и 78% соответственно, клетки содержат 1-2 копии обеих плазмид. Для штаммов, выделенных из молочных продуктов, замечена тенденция к сокращению размера хромосомы параллельно с приобретением новых призна-
ков, кодируемых плазмидами, что, как считается, сыграло важную роль в их адаптации к богатой питательными веществами молочной среде [24]. Плазмида рКЬ1834-25 содержит гены структурных белков пилей и сортаз, участвующих в их сборке. В последовательностях рКЬ1834-35 и pLL1834-38 аннотированы детерминанты, кодирующие факторы устойчивости к тяжелым металлам, компоненты системы рестрикции-модификации. Плазмида рКЬ1834-38 содержит кластер генов синтеза бактериоцина (предположительно лактокок-цина) и гены синтеза белков, ответственных за мобилизацию. Плазмиды, являющиеся мобильными элементами, являются нежелательными компонентами геномов штаммов, используемых для генно-инженерного конструирования. Однако генетические детерминанты, кодируемые плазмидами, могут иметь важное значение для ферментативной, адаптационной и пробиотической активности штамма Ь. 1асШ БИМ В-1834.
Собранные последовательности геномов ис-
следуемых штаммов были депонированы в ну-клеотидную базу данных NCBI, коды доступа и общие характеристики аннотированных геномов представлены в таблице 2. С учетом депонированных нами последовательностей, на 11.09.2024 г. в базе данных GenBank находится 724 секвенированные последовательности геномов L. lactis, из которых 81 является полностью собранными; 204 последовательности L. cremoris, из которых 31 является полностью собранными; 663 генома бактерий Lc. rhamnosus, из которых 75 являются полностью собранными.
При оценке бактерий, рассматриваемых в качестве кандидатов в продуценты гомологичных или гетерологичных белков, важным критерием является потенциальная стабильность генома. Для этого необходимо выявить наличие в пределах нуклеотидной последовательности мобильных генетических элементов, таких как инсерционные последовательности (18-элементы), транспозоны, профаги и иные фрагменты чужеродной ДНК, которые, перемещаясь в пределах генома, могут инакти-вировать гены или регуляторные элементы, влияющие на продукцию целевого белка.
В геноме Lb. rhamnosus БИМ В-189 найдено 10 генов транспозаз семейства ISLrh2, 15 — семейства 1830, 1 — семейства 18607
и 3 — семейства 18200/18605 (один из которых дефектный), 1 — семейства 185/181182 (также дефектный) и 1 дефектный ген неустановленного семейства. После сборки данного генома и выравнивания прочтений на полученную последовательность репликона было замечено, что крупный локус (с 2 316 741 по 2 362 729 п. н.), ограниченный с обеих сторон последовательностью транспозаз семейства 18200/18605, имеет два варианта направления (около 60% — как в депонированной последовательности и около 40% — в инверсированном направлении), что может свидетельствовать о перестройках этой части бактериальной хромосомы.
В геноме L. cremoris NZ3900 обнаружено 80 генов транспозаз, однако из них 32, вероятно, являются дефектными: содержат неполную последовательность или внутренний стоп-кодон. Среди предсказанных функционально активных генов транспозаз 7 принадлежат семейству 18712, 6 — семейству 18905, 15 — семейству 183, 14 — семейству 18981 и по одному гену — семействам ISLla2, ^1а3, 188Ш, 181675, 18818 и 181216. Мы выравнивали геномную последовательность L. cremoris NZ3900 на последовательность MG1363 (N^009004.1), чтобы сравнить положение генов транспозаз двух штаммов. Ре-
Таблица 2
Общие характеристики геномов исследуемых бактерий
Параметр Ь. егвшот NZ3900 Ь. 1осйн БИМ В-1834 Ьс rhamnosus БИМ В-189
Общее количество генов 2 599 2 573 2 775
Количество генов, кодирующих белки 2 395 2 413 2 650
Гены РНК 86 87 80
Гены рРНК (58, 168, 238) 7, 6, 6 7, 6, 6 5, 5, 5
Гены тРНК 64 64 60
Гены некодирующих РНК 3 4 3
Псевдогены 118 73 45
Процент ГЦ-пар, % 35,5 35,0 47,0
Репликоны хромосома (СР157379.1) хромосома (СР157287.1); три плазмиды (СР157288.1; СР157289.1; СР157290.1) хромосома (СР158111.2)
Размер хромосомы, п. н. 2 539 931 2 432 875 2 994 346
зультат выравнивания последовательности Ь. сгвтопя NZ3900 относительно MG1363 (ЫС_009004.1) показал, что дефектные транс-позазы присутствуют и в геноме исходного штамма. Значительное число неактивных К-элементов штамма MG1363 отмечено и в работе У. Вегмана с соавторами [25]. Дополнительно на основании выравнивания двух геномов установлены локализация и кодирующие последовательности вставок в хромосому, осуществленные на этапе создания штамма Ь. сгвтош NZ3900, в том числе регуляторные гены nisRK, участвующие в активации низи-нового промотора, и локус, содержащий ген 1асЕ с делецией [13].
В пределах генома штамма Ь. 1асШ БИМ В-1834 обнаружено 35 генов транспозаз семейств Ш0, Ш, ^1а3, К981, К6, К982 и ISS1S, имеющих как хромосомную, так и плазмидную локализацию. Помимо вышеперечисленных генов транспозаз в пределах хромосомной последовательности штамма Ь. lactis БИМ В-1834 локализовано 3 дефектных гена транспозаз семейств К3 и К-КЬ6, в пределах плазмиды рКЬ1834-35 — 3 дефектных гена транспозаз семейств ^5/^1182
и IS6, в пределах плазмиды pLL1834-38 — 5 дефектных генов транспозаз семейств IS3, IS982 и IS6.
В результате анализа с помощью веб-ресурса PHASTEST в геномах штаммов обнаружены последовательности профагов (табл. 3). У бактерий Lb. rhamnosus БИМ B-189 обнаружена одна полная и одна сомнительная профаговые области. Было замечено, что степень покрытия прочтениями области интактного фага в полтора раза выше, чем локусов, фланкирующих данную область, на основании чего было сделано предположение об активности данного фага у части клеток культуры. Следует отметить, что при культивировании бактерий данного штамма на поверхности питательной среды в течение 7-14 дней не было замечено зон лизиса. При спонтанной активации про-фагов только небольшая субпопуляция клеток начинает продуцировать бактериофаги. Этот процесс может быть вызван внешними факторами или может быть результатом внутриклеточных процессов [26, 27]. В недавних исследованиях было показано, что при анализе 1 472 геномов представителей 16 различных видов рода Lactobacillus фрагменты профагов
Таблица 3
Характеристика полных профаговых областей в геномах бактерий Lb. rhamnosus БИМ B-189, L. cremoris NZ3900 и L. lactis БИМ B-1834
Номер региона Координаты в хромосоме Длина региона, п. н. Количество КБП в регионе ГЦ, % Ближайший известный фаг
Lb. rhamnosus БИМ B-189
1 839 901-885 408 45 508 58 43,96 Lactob_BH1 (NC_048737)
L. cremoris NZ3900
1 26 448-61 197 34 750 32 35,18 Lactoc_bIL310 (NC_002669)
2 802 363-845 421 43 059 63 35,05 Lactoc_PLgT_1 (NC_031016)
3 2 072 031-2 118 494 46 464 68 35,88 Lactoc_bIL286 (NC_002667)
L. lactis БИМ B-1834
1 473 854-495 119 21 266 33 33,47 Lactoc_bIL312 (NC_002671)
2 1 025 268-1 069 331 44 064 50 35,12 Lactoc_bIL285 (NC_002666)
3 1 597 799-1 640 400 42 602 61 35,73 Strept_phi3396 (NC_009018)
4 1 773 775-1 801 392 27 618 20 33,65 Lactoc_bIL311 (NC_002670)
5 1 948 508-2 007 433 58 926 68 35,67 Lactoc_ul36 (NC_004066)
6 2 213 579-2 255 495 41 917 52 36,19 Lactoc_28201 (NC_031013)
были идентифицированы почти у всех лакто-бацилл (99,8%), при этом у 64,1% штаммов предсказаны последовательности интактных профагов [28]. Большинство умеренных фагов не приводят непосредственно к лизису или ингибированию роста микроорганизмов, более того, наличие фаговых последовательностей в геномах бактерий увеличивает их генетическое разнообразие, что может способствовать более легкой колонизации новых экологических ниш [26]. Тем не менее, для используемых в биотехнологических процессах бактерий крайне нежелательно наличие интактных профагов, способных к переходу к литическому циклу.
В пределах нуклеотидной последовательности штамма L. cremoris NZ3900 выявлено три полные, одна сомнительная и две неполные профаговые последовательности, а в пределах генома штамма L. lactis БИМ В-1834 обнаружено шесть полных и одна неполная профа-говые последовательности. Степень покрытия прочтениями фаговых областей не отличалась от среднего покрытия хромосомы, локализация фаговых последовательностей L. cremoris NZ3900 соответствует их расположению в геноме MG1363.
В геномах исследуемых штаммов были обнаружены гены, относящиеся к системе рестрикции-модификации: у Lb. rhamnosus БИМ В-189 компоненты системы Р-М типа I, II и IV. В геноме штамма L. cremoris NZ3900 локализованы компоненты системы Р-М типа I. В нуклеотидной последовательности штамма L. lactis БИМ В-1834 компоненты систем Р-М имеют как хромосомную, так и плазмидную локализацию. В частности, в пределах хромосомы локализованы гены системы Р-М типа I; в пределах плазмиды рКЬ1834-35 — также гены системы Р-М типа I, но в кодирующей белок последовательности (КБП) эндонуклеазы рестрикции содержится внутренний стоп-ко-дон; в пределах плазмиды рКЬ1834-25 — гены системы Р-М типа II.
Систем CRI8PR-Cas в исследуемых последовательностях геномов обнаружено не было.
Несмотря на то, что МКБ признаны безопасными, распространение генов устойчивости к антибиотикам и факторов вирулентности среди бактерий обуславливает необходимость детального анализа генома на наличие
соответствующих генетических детерминант. Сравнение нуклеотидных последовательностей штаммов L. lactis БИМ В-1834, L. cremoris NZ3900 и Lc. rhamnosus БИМ B-189 с курируемыми базами данных эталонных генов антибиотикорезистентности, генов кислото-, биоцидо-, металло- и термоустойчивости с помощью сервиса AMRFinderPlus не выявило в геномах исследуемых штаммов перечисленных детерминант устойчивости, а инструмент CARD в геноме лактококков обнаружил сходство с референсной последовательностью VanY (риск устойчивости к ван-комицину), однако степень сходства низкая (32,74% у штамма NZ3900 и 32,34% у штамма 1834 при покрытии около 89% в обоих случаях). Специализированные базы данных содержат последовательности генов клинически значимых патогенов и не включают детерминанты устойчивости непатогенных и некультивируемых бактерий. ResFinderFG v2.0 включает базу данных генов антибио-тикорезистентности, выявленных методом функциональной метагеномики, и позволяет обнаружить гены устойчивости, которые не были обнаружены с помощью других баз данных [16]. Анализ с помощью данного инструмента предсказал возможную устойчивость штамма L. lactis БИМ В-1834 к триметопри-му, а штамма L. cremoris NZ3900 — к D-ци-клосерину. В обоих случаях детерминантой устойчивости определен фермент-мишень соответствующего антимикробного средства: дигидрофолатредуктаза и D-аланин-О-алани-новая лигаза. Согласно сведениям, представленным в литературных источниках, штаммы L. lactis обладают устойчивостью к тримето-приму [29], резистентность к которому обычно связана с наличием нечувствительной диги-дрофолатредуктазы [30], сведений об устойчивости лактококков к циклосерину не удалось найти. С помощью биоинформатических ресурсов не было обнаружено детерминант резистентности у штамма Lc. rhamnosus БИМ B-189, однако ранее нами с помощью феноти-пических тестов была выявлена устойчивость к канамицину и гентамицину в концентрации 20 мкг/мл (данные в печати), устойчивость лактобацилл к аминогликозидам продемонстрирована в работе И. Кампеделли с соавторами [31]. Резистентность к аминогликозидам
связана с несколькими механизмами, одним из которых является инактивация препарата модифицирующими ферментами (ацетил-трансферазами и фосфотрансферазами), характеризующимися большим разнообразием структуры, что затрудняет их идентификацию [32].
Сравнение геномов L. lactis БИМ В-1834, L. cremoris NZ3900 и Lc. rhamnosus БИМ B-189 с записями из специализированных баз данных с помощью сервиса VirulenceFinder v.2.0.5 не обнаружило известных генов вирулентности патогенных бактерий Listeria, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus; по результатам анализа последовательностей с по-
мощью инструмента PathogenFinder для всех трех штаммов установлена низкая вероятность патогенности (0,097-0,128). При анализе геномов с помощью инструмента VFanalyser базы данных VFDB (Virulence Factor Database) в геномах всех исследуемых бактерий были выявлены генетические детерминанты, продукты которых у патогенных бактерий участвуют в патогенезе, в том числе енолаза, фиброне-ктин-связывающий белок, белки биосинтеза экзополисахаридов (ЭПС), сортаза, адгезины и др. (табл. 4). Однако для пробиотическо-го штамма данные детерминанты являются предпочтительными, поскольку способствуют агрегации клеток и адгезии и играют важную
Функция Фактор вирулентности Референсный ген Lc. rhamnosus БИМ B-189 L. cremoris NZ3900 L. lactis БИМ В-1834
Адгезия Фибронектин-связывающие белки fbp54 pavA + fbp54) + (pavA) + (pavA)
Сортаза А srtA - + +
Стрептококковая липопротеиновая ротамаза А slrA - + +
Стрептококковый рецептор плазмина/GAPDH plr/gapA + + +
Белок адгезии листерий lap + + +
Ферменты Митогенный фактор 2 mf2 - + +
Стрептококковая энолаза eno + + +
Защита от иммунитета Белки биосинтеза капсулы 5 генов 13 генов 11 генов
Белки синтеза полисахаридной капсулы epsE, galE1 +, + +, + +, +
Поглощение марганца Пневмококковый поверхностный антиген A/Металлсвязывающий белок SloC psaA + + +
Протеазы Триггерный фактор tig/ropA + + +
Токсины Гемолизин + + +
Защита от фагоцитоза Гены биосинтеза капсулы 2 гена 4 гена 2 гена
Нуклеозиддифосфат-киназа микобактерии ndk + - -
Регуляция LisR/LisK, VirR/VirS (Listeria) lisR virR + + + +
Системы секреции Т6СС-11 * + + +
Таблица 4
Результаты анализа геномов с помощью сервиса VFDB
Окончание таблицы 4
Функция Фактор вирулентности Референсный ген Lc. rhamnosus БИМ B-189 L. cremoris NZ3900 L. lactis БИМ В-1834
Закрепление поверхностных белков Диацилглицерил-транс фераза (Listeria) lgt + - -
Устойчивость к антигенам сыворотки LPS rfb локус (Klebsiella) * - + +
Примечание. * — программа не приводит название референсного гена
роль на этапе колонизации кишечника хозяина [33].
Результаты поиска генов, связанных с синтезом вторичных метаболитов, представлены в таблице 5. Присутствие кластеров синтеза бактериоцинов в геномах штаммов определили все три использованных инструмента: AntiSMASH, PRISM и BAGEL4. Так, в геноме Lc. rhamnosus БИМ B-189 предсказан кластер синтезируемого на рибосоме и посттранс-ляционно модифицируемого пептида (класс «RiPP-like» в AntiSMASH), по расположению и составу кодирующих последовательностей соответствующий идентифицированному PRISM v4.4.5 «вероятному бактериоцину класса II/III», который ресурсом BAGEL4 аннотирован как «Карноцин_CP52» на основании сходства аминокислотной последовательности (73,56%) с бактериоцином из соответствующей базы данных.
В геноме штамма L. cremoris NZ3900 все три используемых веб-ресурса показали наличие локусов синтеза двух бактериоцинов (табл. 5), аннотированных BAGEL4 как лактококцин А и «сактипептид S» (в AntiSMASH «пептид,
модифицируемый ферментами, катализирующими радикальные реакции с участием особой молекулы S аденозилметионина», класс «RaS-RiPP») [34]. Третий возможный кластер синтеза бактериоцина у бактерий L. cremoris NZ3900 предсказан только BAGEL4, наибольшее сходство кодируемого пептида определено с гарвиацином Q [35].
Результаты предсказания детерминант биосинтеза бактериоцинов в геноме L. lactis БИМ В-1834 различались: с помощью PRISM v4.4.5 идентифицирован только кластер синтеза бак-териоцина класса II/III, с помощью BAGEL4 предсказаны кластеры синтеза лактококци-на В и сактипептида S. Результат анализа в AntiSMASH подтверждает наличие обоих данных кластеров и дополнительно предсказывает присутствие еще одного кластера класса RaS-RiPP в хромосоме и в последовательности плазмиды RiPP-like. Полученные результаты подтверждают имеющиеся в публикациях сведения о синтезе ряда вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов, представителями МКБ [36], а также демонстрируют, что использование различных био-
Таблица 5
Предсказанные кластеры синтеза вторичных метаболитов в геномах МКБ
Штамм Кластеры биосинтеза (координаты в геноме)
BAGEL4 PRISM v4.4.5 AntiSMASH
Lc. rhamnosus БИМ B-189 T3PKS (1 822 328-1 863 500)
Поликетиды (2 170 152-2 174 316)
Карноцин_CP52 (2 450 820-2 476 667) Вероятный бактериоцин класса II/III (2 460 329-2 466 670) RiPP-like (2 447 068-2 458 618)
Окончание таблицы 5
Штамм Кластеры биосинтеза (координаты в геноме)
BAGEL4 PRISM v4.4.5 AntiSMASH
L. cremoris NZ3900 Беталактон (606 940-639 505)
Лактококцин А (706 865-726 973) Вероятный бактериоцин класса II/III (716 828-718 038) RiPP-like (684 721-722 032)
Гарвиацин Q (834 941-855 082)
T3PKS (901 983-943 137)
Поликетиды (1 774 220-1 777 778)
Сактипептиды (2 388 698-2 410 816) Streptide (2 397 232-2 404 510) RaS-RiPP (2 387 923-2 414 329)
L. lactis БИМ В-1834 Лактококцин B (65 222-85 291) Вероятный бактериоцин класса II/III (55 447-86 231) RiPP-like (60 399-83 280)
Беталактон (631 243-663 775)
Поликетиды (774 857-785 313)
RaS-RiPP (1 162 194-1 185 411)
T3PKS (1 549 173-1 590 327)
Сактипептиды (2 283 950-2 303 950) RaS-RiPP (2 281 055-2 304 958)
pLL1834-38 RiPP-like (5 963-16 130)
Примечание. Т3Р^ — поликетидная синтаза третьего типа; ШРР-№е — синтезируемый на рибосоме и по-сттрансляционно модифицируемый пептид; RaS-RiPP — пептид, синтезируемый на рибосоме и посттрансля-ционно модифицируемый ферментами, катализирующими радикальные реакции с участием особой молекулы S-аденозилметионина
информатических ресурсов позволяет более полно предсказать наличие кластеров биосинтеза в геноме.
В рамках данного исследования мы не ставили задачу определения пробиотического потенциала штаммов, но присутствие в анализируемых геномах факторов адгезии и бак-териоцинов позволяет предположить наличие способности адаптироваться и выживать в кишечнике хозяина.
Заключение
В исследуемых геномах не выявлены гены, которые могут вызывать опасения отно-
сительно возможной передачи устойчивости к антибиотикам патогенным бактериям, не обнаружено токсинов и суперантигенов, ассоциированных с вирулентностью. Все три штамма определены как непатогенные для человека, на основании чего можно сделать заключение о безопасности штаммов L. lactis БИМ В-1834, L. cremoris NZ3900 и Lc. rhamnosus БИМ В-189. Выявлено присутствие кластеров синтеза вторичных метаболитов, в том числе бактериоцинов, детерминант, отвечающих за агрегацию клеток и адгезию, что может обеспечивать преимущество данным бактериям на этапе колонизации кишечника хозяина.
Анализ мобилома штаммов показал наличие мобильных генетических элементов во всех геномах, однако с учетом планируемого использования штаммов отдельные элементы имеют особое значение. К таковым относятся три плазмиды pLL1834-38, pLL1834-35 и pLL1834-25 бактерий L. lactis БИМ В-1834, в пределах которых выявлены гены транспо-заз, а плазмида pLL1834-38 содержит кодирующие последовательности белков мобилизации, предполагающих возможность конъюгатив-ного переноса. Основываясь на ранее полученных результатах, данные плазмиды не препятствовали трансформации бактерий векторами с совместимыми репликонами, однако при использования штамма для экспрессии ге-терологичных генов предпочтителен вариант с элиминацией природных плазмид. Признаки динамичности генома бактерий Lc. rhamnosus БИМ B-189 — активация профага и инверсивная перестройка протяженного локуса генома у части клеток популяции — свидетельствуют о нестабильности генома данных бактерий, возможность индукции лизиса клеток является нежелательной характеристикой для бактерий, рассматриваемых в качестве основы систем экспрессии. В геномах L. lactis БИМ В-1834 и L. cremoris NZ3900 присутствует несколько профаговых последовательностей, однако анализ данных секвенирования не выявил признаков активности профагов, а многолетнее использование штамма L. cremoris NZ3900 для продукции различных гетерологичных белков косвенно подтверждает стабильность данного генома.
Таким образом, из коллекционных штаммов L. lactis БИМ В-1834 имеет более стабильный геном и может быть использован в качестве реципиента экспрессионных конструкций при условии элиминации природных плазмид.
Список использованных источников
1. Editorial: Lactic Acid Bacteria: Microbial Metabolism and Expanding Applications / J.-M. Liu [et al.] // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2021. - Vol. 9. - P. 794 164.
2. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probi-otic / C. Hill [et al.] // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. - 2014. - Vol. 11, № 8. - P. 506-514.
3. Lactococci and lactobacilli as mucosal delivery vectors for therapeutic proteins and DNA vaccines / L. G. Bermudez-Humaran [et al.] // Microb. Cell Factories. - 2011. - Vol. 10, № 1. - P. S4.
4. Lactic Acid Bacteria as a Live Delivery System for the in situ Production of Nanobodies in the Human Gastrointestinal Tract / B. del Rio [et al.] // Front. Microbiol. - 2019. - Vol. 9.
5. Novel Strategies for Efficient Production and Delivery of Live Biotherapeutics and Biotech-nological Uses of Lactococcus lactis: The Lactic Acid Bacterium Model / L. M. Tavares [et al.] // Front. Bioeng. Biotechnol. - 2020. - Vol. 8.
6. Recent advances in genetic tools for engineering probiotic lactic acid bacteria / K. Mug-wanda [et al.] // Biosci. Rep. - 2023. - Vol. 43, № 1. - P. BSR20211299.
7. Peng, X. Whole genome sequencing for the risk assessment of probiotic lactic acid bacteria / X. Peng, A. Ed-Dra, M. Yue // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2023. - Vol. 63, № 32. - P. 11 244-11 262.
8. Carrillo, C. D. Whole-Genome Sequence Datasets: A Powerful Resource for the Food Microbiology Laboratory Toolbox / C. D. Carrillo, B. W. Blais // Front. Sustain. Food Syst. - 2021.
- Vol. 5.
9. Systematic discovery of antiphage defense systems in the microbial pangenome / S. Doron [et al.] // Science. - 2018. - Vol. 359, № 6 379. -P. eaar4120.
10. Use of Wild Type or Recombinant Lactic Acid Bacteria as an Alternative Treatment for Gastrointestinal Inflammatory Diseases: A Focus on Inflammatory Bowel Diseases and Mucositis / R. D. D. O. Carvalho [et al.] // Front. Microbiol.
- 2017. - Vol. 8. - P. 800.
11. Development of a novel expression system in lactic acid bacteria controlled by a broad-host-range promoter PsrfA / C. Guan [et al.] // Microb. Cell Factories. - 2022. - Vol. 21, № 1. - P. 23.
12. Draft Genome Sequence of Lactobacillus rhamnosus NRRL B-442, a Potential Probiotic Strain / M. S. Muyyarikkandy [et al.] // Genome Announc. - 2018. - Vol. 6, № 7. - P. e00046-18.
13. NICE_Expression_System-Handbook [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.mobitec.com/media/datasheets/ mobitecgmbh/NICE_Expression_System-Hand-book.pdf. - Дата доступа: 12.01.2023.
14. Sikolenko, M. A. Barapost: Binning of Nucleotide Sequences According to Taxonomic
Annotation / M. A. Sikolenko, L. N. Valentovich // IEEE/ACM Trans. Comput. Biol. Bioinform. -2021. - T. 18, № 6. - C. 2 766-2 767.
15. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline / T. Tatusova [et al.] // Nucleic Acids Res. -2016. - Vol. 44, № 14. - P. 6 614-6 624.
16. ResFinderFG v2.0: a database of antibiotic resistance genes obtained by functional metagen-omics / R. Gschwind [et al.] // Nucleic Acids Res.
- 2023. - Vol. 51, № W1. - P. W493-W500.
17. AMRFinderPlus and the Reference Gene Catalog facilitate examination of the genomic links among antimicrobial resistance, stress response, and virulence / M. Feldgarden [et al.] // Sci. Rep. - 2021. - Vol. 11, № 1. - P. 12 728.
18. CARD 2023: expanded curation, support for machine learning, and resistome prediction at the Comprehensive Antibiotic Resistance Database / B. P. Alcock [et al.] // Nucleic Acids Res.
- 2023. - Vol. 51, № D1. - P. D690-D699.
19. VFDB: a reference database for bacterial virulence factors / L. Chen [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, № Database issue. -P. D325-328.
20. Comprehensive prediction of secondary metabolite structure and biological activity from microbial genome sequences / M. A. Skinnider [et al.] // Nat. Commun. - 2020. - Vol. 11, № 1.
- P. 6 058.
21. The antiSMASH database version 4: additional genomes and BGCs, new sequence-based searches and more / K. Blin [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2024. - Vol. 52, № D1. - P. D586-D589.
22. REBASE: a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes / R. J. Roberts [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2023.
- Vol. 51, № D1. - P. D629-D630.
23. Li, T. T. Elevation of Lactococcus lactis subsp. cremoris to the species level as Lactococcus cremoris sp. nov. and transfer of Lactococcus lactis subsp. tructae to Lactococcus cremoris as Lactococcus cremoris subsp. tructae comb. nov / T. T. Li, W. L. Tian, C. T. Gu // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2019. - Vol. 71, № 3.
24. The Lactococcus lactis Pan-Plasmidome / P. Kelleher [et al.] // Front. Microbiol. - 2019. -Vol. 10. - P. 707.
25. Complete Genome S equence of the Prototype Lactic Acid Bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 / U. Wegmann [et al.] // J. Bac-teriol. - 2007. - Vol. 189, № 8. - P. 3 256-3 270.
26. Occurrence and genetic diversity of prophage sequences identified in the genomes of L. casei group bacteria / P. Jarocki [et al.] // Sci. Rep. - 2023. - Vol. 13. - P. 8 603.
27. Effects of diverse environmental conditions on {phi}LC3 prophage stability in Lactococcus lactis / M. Lunde [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, № 2. - P. 721-727.
28. Comprehensive Scanning of Prophages in Lactobacillus: Distribution, Diversity, Antibiotic Resistance Genes, and Linkages with CRIS-PR-Cas Systems / Z. Pei [et al.] // mSystems.
- Vol. 6, № 3. - P. e01211-20.
29. Investigating lactic acid bacteria genus Lactococcus lactis properties: Antioxidant activity, antibiotic resistance, and antibacterial activity against multidrug-resistant bacteria Staphylococcus aureus / N. Hamdaoui [et al.] // Heliyon. -2024. - Vol. 10, № 11. - P. e31957.
30. Cloning and molecular analysis of the dihy-drofolate reductase gene from Lactococcus lactis / K. Leszczynska [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - Vol. 61, № 2. - P. 561-566.
31. Genus-Wide Assessment of Antibiotic Resistance in Lactobacillus spp. / I. Campedel-li [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2018. -Vol. 85, № 1. - P. e01738-18.
32. Extensive screening reveals previously undiscovered aminoglycoside resistance genes in human pathogens / D. Lund [et al.] // Commun. Biol. - 2023. - Vol. 6, № 1. - P. 1-10.
33. Whole-Genome Sequence of Lactococcus lactis Subsp. lactis LL16 Confirms Safety, Pro-biotic Potential, and Reveals Functional Traits / J. Mileriene [et al.] // Microorganisms. - 2023. -Vol. 11, № 4. - P. 1 034.
34. Benjdia, A. Radical SAM Enzymes and Ri-bosomally-Synthesized and Post-translationally Modified Peptides: A Growing Importance in the Microbiomes / A. Benjdia, O. Berteau // Front. Chem. - 2021. - Vol. 9. - P. 678 068.
3 5. Garvieacin Q, a Novel Class II Bacteriocin from Lactococcus garvieae BCC 43578 / A. To-sukhowong [et al.] // Appl. Environ. Microbiol.
- 2012. - Vol. 78, № 5. - P. 1 619-1 623.
36. Tang, H. The metabolites of lactic acid bacteria: classification, biosynthesis and modulation of gut microbiota / H. Tang, W. Huang, Y.-F. Yao // Microb. Cell Graz Austria. - 2023. - Vol. 10, № 3. - P. 49-62.
O. V. Evdokimova, A. A. Muratova, A. E. Akhremchuk, M. A. Sikolenko, L. N. Valentovich
GENOME ANALYSIS OF LACTIC ACID BACTERIA PROMISING FOR THE DEVELOPMENT OF HETEROLOGOUS GENE EXPRESSION
State Scientific Institution "Institute of Microbiology of the National Academy of Sciences of Belarus" 2 Kuprevich St., 220084 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: [email protected]
Sequencing and de novo assembly of the genomes of Lacticaseibacillus rhamnosus BIM B-189, Lactococcus lactis BIM B-1834 and Lactococcus cremoris NZ3900 bacteria as the potential recipients of heterologous gene expression systems were performed. The in silico genome analysis confirmed the safety of the strains showing the absence of genes for toxins and virulence factors and determinants associated with the transfer of antibiotic resistance. Secondary metabolite synthesis clusters, including bacteriocins, were predicted for all strains. Analysis of mobile genetic elements revealed instability of the Lc. rhamnosus BIM B-189 genome. L. lactis BIM B-1834 bacteria contains three low-copy plasmids; one of them contains conjugative transfer determinants. The possibility of using these strains for the development of heterologous gene expression systems is discussed.
Keywords: Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Lacticaseibacillus rhamnosus, whole-genome sequencing, genome annotation.
Дата поступления в редакцию: 16 сентября 2024 г.
