CC BY
12
УДК 575.1, 616.8
Анализ генетической предрасположенности к наследственной каталепсии в мышиной модели нейропсихических заболеваний с использованием полногеномных данных
Т. В. Андреева1,2*, Ф. Е. Гусев1,2, Н. А. Синякова3, А. В. Куликов3, А. П. Григоренко2, И. Ю. Адрианова2, Д. В. Базовкина4, Е. И. Рогаев2,5*
1Научный центр генетики и наук о жизни, Университет «Сириус», Сочи, 354340 Россия 2Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, Отдел геномики и генетики человека, Москва, 119991 Россия
3Институт цитологии и генетики СО РАН, Сектор генетических коллекций нейропатологий, Новосибирск, 630090 Россия
4Институт цитологии и генетики СО РАН, Лаборатория нейрогеномики поведения, Новосибирск, 630090 Россия
5Медицинская школа Чан Массачусетского университета, Департамент психиатрии,
Шрусбери, 01545 США Массачусетс, США
*E-mail: an_tati@vigg.ru, Evgeny.Rogaev@umassmed.edu
Поступила в редакцию 12.12.2022
Принята к печати 23.01.2023
DOI: 10.32607/actanaturae.11875
РЕФЕРАТ Каталепсия - это особое состояние организма, сопровождающее тяжелые нейропсихические патологии, включая шизофрению, депрессивные расстройства, болезнь Паркинсона. У некоторых линий мышей каталепсия может быть вызвана зажиманием кожи загривка. Ранее методом анализа сцепления участок 105-115 млн п.н. на хромосоме 13 был определен как главный локус наследственной щипковой каталепсии у мышей. С целью поиска вероятных генов-кандидатов каталепсии мы провели полногеномное секвенирование мышей из линий, склонных и устойчивых к щипковой каталепсии. Нами установлено, что главный локус каталепсии ограничен участком 103.92-106.16 млн п.н. Гомологичный локус в геноме человека расположен на хромосоме 5 и содержит генетические и эпигенетические маркеры, ассоциированные с шизофренией. Кроме того, нами выявлен миссенс-вариант в гене Nln у мышей из линий, склонных к каталепсии. Nln кодирует фермент нейролизин, участвующий в расщеплении нейротензина - пептида, индуцирующего эпилепсию у мышей. Полученные данные указывают на Nln как на наиболее вероятный ген-кандидат, связанный со щипковой каталепсией у мышей, и на общие механизмы развития каталепсии у мышей и нейропсихических патологий у человека. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА каталепсия, мышь, геном, мозг, нейролизин.
ВВЕДЕНИЕ
Каталепсия - естественное состояние организма, характеризующееся длительной реакцией замирания и неспособностью изменить принятую позу, представляет собой одну из форм пассивно-оборонительного поведения и встречается у большинства позвоночных. У человека каталепсия утратила свою защитную функцию и является симптомом ряда тя-
желых нейропсихических патологий, таких, как шизофрения и депрессия [1, 2].
Каталепсия у грызунов может быть вызвана блокадой дофаминовых D2-рецепторов нейролептиками, такими, как галоперидол или морфин [3-6]. Немедикаментозная (щипковая) каталепсия у мышей (Дополнительный файл 1. Мышь со щипковой каталепсией (видеофайл) см. по ссылке https://
evolgenomics.org/catalepsy/) может быть вызвана зажиманием кожи загривка [7], при этом предрасположенность разных линий мышей к данному типу каталепсии значительно различается. Мыши наиболее распространенных инбредных линий, таких, как C57BL/6J, DBA/2, AKR/J, устойчивы к щипковой каталепсии, тогда как около 50% мышей линии CBA/Lac демонстрируют наследственную каталепсию [8-11].
Главный локус наследственной каталепсии у мышей был недавно картирован методами QTL-анализа в дистальной части (61-70 сМ) хромосомы 13 [12]. Генетическое сцепление подтверждено экспериментами по селективному скрещиванию [13] и путем переноса дистального фрагмента хромосомы 13, расположенного между генетическими маркерами D13Mit74 и D13Mit214, из линии CBA в геном устойчивой к каталепсии линии AKR. Около 50% мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 проявляли выраженную каталепсию, как и мыши линии СВА [10]. Линия ASC/Icg (антидепрессант-чувствительная каталепсия) была создана путем селективного возвратного скрещивания CBA х (CBA х AKR) и отбора мышей, склонных к каталепсии. Показано, что наследственная каталепсия у мышей линии СВА ассоциирована с депрессивноподобными чертами и чувствительностью к хронической терапии антидепрессантами [2, 9, 11, 14]. Около 80-85% мышей ASC проявляют каталепсию [13], но гены, ответственные за щипковую каталепсию, в этой линии все еще не выявлены.
Мы провели полногеномное секвенирование устойчивых к каталепсии (AKR/J) и склонных к каталепсии линий мышей (CBA, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC) для поиска предполагаемых генов-кандидатов или хромосомных локусов, связанных с развитием наследственной щипковой каталепсии у мышей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Животные
В работе использовали мышей из устойчивых (AKR/J) и предрасположенных к каталепсии (CBA/LacJ) линий, более 50 лет содержавшихся в Институте цитологии и генетики (Новосибирск, Россия), а также животных из конгенной AKR.CBA-D13Mit76 линии с CBA-производным фрагментом хромосомы 13, содержащим главный ген каталепсии, который был перенесен в геном AKR, и мышей из линии ASC с наследственной предрасположенностью к каталепсии. Проведение исследований одобрено Этическим комитетом Института цитологии и генетики РАН, все экспери-
ментальные процедуры соответствовали Директиве Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC). Животных тестировали на каталепсию (в том числе AKR/J на отсутствие каталепсии), как описано ранее [15]: тест считали положительным, если мышь сохраняла неизменной позу не менее 20 с. Для анализа отбирали животных с положительной реакцией на щипок (за исключением контрольной линии AKR).
Полногеномное секвенирование
Геномную ДНК выделяли из фрагментов длиной 3-4 мм хвостов мышей. По фрагменту хвоста от одного животного использовали для выделения ДНК из линий AKR и D13Mit76C; по два хвоста использовали для выделения ДНК из животных линий ASC и CBA. ДНК очищали с использованием колонок QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Hilden, ФРГ). 1.5 мкг геномной ДНК использовали для подготовки фрагментных геномных библиотек с использованием набора TruSeq DNA Sample Preparation kit v2 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США). Приготовленные фрагментные библиотеки со средней длиной вставки 350 п.н. были секвенированы на платформе Illumina HiSeq2000 в режиме парных прочтений длиной 101 н. Полученные в результате секвенирования геномные данные депонированы в базу NCBI SRA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, PRJNA900682).
Анализ данных секвенирования и статистика
Прочтения, полученные в результате секвенирования, картировали на референсный геном мыши (GRCm38/mm10) с использованием программ BWA v. 0.7.17 [16] и Sarek v.2.7.1 [17]. ПЦР-дупликаты маркировали с помощью инструмента Picard (http:// broadinstitute.github.io/picard/). Генетические варианты были предсказаны с использованием программного пакета GATK v.4.1.7.0 [18] и аннотированы с помощью VEP [19]. Предсказание структурных вариантов выполнено с помощью Manta 1.6.0 [20]. В результате секвенирования получено среднее геномное покрытие каждого образца 17-33* (табл. 1).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Точное картирование главного локуса щипковой каталепсии мышей
Наследственная каталепсия, как показано ранее, является гомозиготным рецессивным состоянием [8], поэтому для поиска генов-кандидатов каталепсии мы использовали только гомозиготные варианты, обнаруженные в дистальном фрагменте хромосомы 13 у мышей всех трех линий, предрасположенных
Таблица 1. Статистика геномного секвенирования мышей четырех линий
к каталепсии (CBA, D13Mit76C и ASC), и отсутствующие у мышей линии AKR.
Ранее показали, что основной локус, связанный со щипковой каталепсией у мышей, расположен на дистальном конце хромосомы 13 мыши. Этот фрагмент, маркированный D13Mit76, был перенесен из линии CBA в линию AKR, что привело к созданию рекомбинантной линии AKR.CBA-D13Mit76. С помощью метода микросателлитного картирования основной ген каталепсии был картирован между 105.8 и 115.3 млн п.н. хромосомы 13 мыши [10]. Однако границы перенесенного фрагмента могут быть определены неточно в связи с недостаточно высокой разрешающей способностью использованного метода. Чтобы уточнить координаты основного локуса каталепсии, мы проанализировали распределение родительских (AKR и CBA-специфических) гомозиготных вариантов в линиях ASC и AKR.CBA-D13Mit76 на дистальном фрагменте хромосомы 13 с использованием данных геномного секвенирования и обнаружили гомозиготные варианты, специфичные для линии CBA, на участке 103.92-106.16 млн п.н. как в линии ASC, так и у мыши из линии AKR.CBA-D 13Mit76.
Нами определено, что этот локус на хромосоме 13 мыши гомологичен участку 63.24-65.93 млн п.н. на хромосоме 15 человека (в соответствии с версией GRCh38 генома человека). С использованием данных полногеномного анализа ассоциаций, представленных в базе GWAS Catalog [21], мы выявили статистически строго значимые ассоциации полиморфных вариантов в этом локусе с когнитивными и образовательными способностями (P < 5 х 10-8), а также нестрого значимые ассоциации (P < 10-6) с шизофренией и депрессивными расстройствами (Дополнительная таблица S1. Генетические ассоциации хромосомного локуса в геноме человека, гомологичного главному локусу каталепсии у мыши).
Нами также проведен анализ данных ацетили-рования маркера активного энхансера - гистона H3K27ac - в мозге пациентов с шизофренией [22]. Обнаружено изменение эпигенетического статуса пяти из 76 энхансеров в нейрональных клетках пре-фронтальной коры в локусе хромосомы 15 человека при шизофрении, а также семи из 114 энхансеров тотальной ткани префронтальной коры человека (Дополнительная таблица S2. Изменения эпигенетического статуса энхансеров (H3K27ac), выявленные при шизофрении в локусе, гомологичном главному локусу каталепсии у мышей). В целом, эти данные позволяют предположить общие молекулярные механизмы щипковой каталепсии у мышей и нейро-психических патологий у человека.
Кодирующие варианты в локусе хромосомы 13, сцепленном с каталепсией
Всего в главном локусе наследственной щипковой каталепсии мышей выявлены 13147 полиморфных геномных позиций, содержащих однонуклеотидные замены или короткие инсерционно-делеционные варианты. Среди них 6087 вариантов представлены в гомозиготном состоянии во всех трех секвениро-ванных геномах линий мышей, склонных к каталепсии, и отсутствуют в некаталептической линии (Дополнительная таблица S3. Однонуклеотидные варианты, выявленные в главном локусе каталепсии у мыши). В этом локусе обнаружены также 239 структурных вариантов, из которых 21 вариант специфичен для мышей из линий, склонных к каталепсии (обнаружены во всех трех линиях и отсутствуют в геноме мыши AKR), но ни один из структурных вариантов не изменяет белок-кодирующих последовательности (Дополнительная таблица S4. Структурные варианты, выявленные в главном ло-кусе каталепсии у мыши).
Мы проанализировали однонуклеотидные замены в белок-кодирующих участках локуса, сцепленного с каталепсией, и обнаружили, что девять из них приводят к изменению аминокислотной последовательности соответствующих белков у мышей, склонных к каталепсии, по сравнению с мышью линии AKR без каталепсии (табл. 2). Дополнительно мы провели анализ этих девяти вариантов в референсных геномах 14 линий мышей, представленных в GenBank (линии DBA_2J _ v3, BALB_ cJ_ v3, A_ J _ v3, CBA_J_v3, C3H_HeJ_v3, AKR_J_v3, NOD_ShiLtJ_v3, FVB_NJ_v3, Mm_Celera, LP_J_v1, PWK_PhJ_v3, WSB_EiJ_v3, CAST_EiJ_v3, C57BL/6J), включая известные линии устойчивых (C57BL/6J, DBA/1J) и склонных к каталепсии (C3H/HeJ, A/He, BALB/cLac) мышей [8]. В геноме линии C3H/HeJ, мыши которой склонны к каталепсии, выявлены все
Образец (линия) Число прочтений Прочтения, картированные на геном мыши (Grcm38/mm10), % Среднее геномное покрытие
HT76 561995272 99.56 19 х
ASC 720038088 99.35 23 х
CBA 555706906 97.95 17 х
AKR 986011514 99.49 33 х
Таблица 2. Гомозиготные миссенс-варианты в главном локусе щипковой каталепсии мышей на хромосоме 13, выявленные в секвенированных геномах мышей трех линий, предрасположенных к каталепсии, и отсутствующие в геноме мыши из устойчивой к каталепсии линии
Вариант Идентификатор Ген Аминокислотная замена Эффект, предсказанный с помощью SIFT [23]
13:104069202 T/C rs50518036 Nln H148R tolerated(0.35)
13:104111134 G/A rs51459950 Sgtb C7Y deleterious(0.01)
13:104111173 A/G rs50301687 Sgtb N20S tolerated(0.99)
13:104174454 T/C rs51569005 Shld3 I150V tolerated(0.41)
13:104174470 G/T rs219600951 Shld3 S144R tolerated(0.68)
13:104220239 T/C rs221133823 Ppwdl E256G tolerated(0.23)
13:104220303 A/G rs49763463 Ppwdl Y235H tolerated(0.11)
13:104230784 G/T rs48594661 Cenpk V43L tolerated(1)
13:104312759 T/A rs45772491 Adamts6 S226T tolerated(0.29)
девять миссенс-вариантов, как и в линии CBA, однако в двух других линиях мышей с каталепсией (A/He, BALB/cJ) присутствует только один из этих вариантов - замена His146Arg в гене Nln. Таким образом, в главном локусе щипковой каталепсии мышей на хромосоме 13 выявлена единственная замена T > C (rs50518036) в кодирующей области гена нейролизина Nln, присутствующая у всех исследованных мышей из линий CBA, AKR.CBA-D13Mit76 и ASC, а также в геномах мышей из линий C3H/HeJ, A/He, BALB/cJ из GenBank, склонных к каталепсии, и отсутствующая в геномах мышей, устойчивых к каталепсии (линии AKR/J, C57BL/6J, DBA/1J).
Нейролизин - это металлоэндопептидаза, участвующая в деградации нейротензина и брадикини-на, которые являются фармакологическими индукторами каталепсии у мышей [24-27]. Во всех линиях мышей, склонных к каталепсии, в положении 146 продукта гена Nln присутствует гистидин, в то время как устойчивые к каталепсии линии, включая AKR, содержат аргинин. Данные, свидетельствующие о связи вариантов в гене Nln с каталепсией, ранее не были получены, однако продукт этого гена участвует в расщеплении нейротензина, который может вызывать каталепсию у мышей [24]. Таким образом, ген Nln является наиболее вероятным кандидатом на роль основного гена наследственной щипковой каталепсии у мышей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате полногеномного секвенирования склонных и устойчивых к каталепсии линий мы-
шей мы показали, что связанный со щипковой каталепсией участок хромосомы 13 расположен в области 103.92-106.16 млн п.н., а также выявили мутацию в гене нейролизина Nln, сцепленную с каталепсией. Главный ген каталепсии, по результатам проведенных ранее исследований, определяет около 20% пенетрантности признака [10]. Принимая во внимание, что каталепсия проявляется у 50% мышей рекомбинантной линии D13Mit76 и у 80% животных склонной к каталепсии линии ASC, оставшаяся пенетрантность признака, вероятно, является результатом влияния генов и/ или регуляторных локусов на других хромосомах. Полученные нами на мышиных моделях полногеномные данные наследуемых особенностей поведения, которые у человека являются характерными симптомами таких заболеваний, как шизофрения и депрессивные расстройства, могут в дальнейшем использоваться для идентификации генетических и эпигенетических факторов психических расстройств у человека.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта РНФ № 19-75-30039 (биоинформатический анализ баз данных и регуляторных локусов генома человека).
Дополнительный материал к этой статье можно найти онлайн по ссылке https://evolgenomics.org/catalepsy/
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Singerman B., Raheja R. // Ann. Clin. Psychiatry. 1994. V. 6. № 4. P. 259-266.
2. Kolpakov V.G., Gilinsky M.A., Alekhina T.A., Barykina N.N., Nikulina E.M., Voitenko N.N., Kulikov A.V., Shtilman N.I. // Behav. Processes. 1987. V. 14. № 3. P. 319-341.
3. Sanberg P.R., Bunsey M.D., Giordano M., Norman A.B. // Behav. Neurosci. 1988. V. 102. № 5. P. 748-759.
4. Klemm W.R. // Prog. Neurobiol. 1989. V. 32. № 5. P. 403-422.
5. VanderWende C., Spoerlein M.T. // Neuropharmacology. 1979. V. 18. № 7. P. 633-637.
6. de Ryck M., Teitelbaum P. // Behav. Neurosci. 1984. V. 98. № 2. P. 243-261.
7. Ornstein K., Amir S. // J. Comp. Physiol. Psychol. 1981. V. 95. № 5. P. 827-835.
8. Kulikov A.V., Kozlachkova E.Y., Maslova G.B., Popova N.K. // Behav. Genet. 1993. V. 23. № 4. P. 379-384.
9. Базовкина Д.В., Куликов А.В., Кондаурова Е.М., Попова Н.К. // Генетика. 2005. Т. 41. № 9. C. 1222-1228.
10. Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Kondaurova E.M., Popova N.K. // Genes. Brain. Behav. 2008. V. 7. № 4. P. 506-512.
11. Tikhonova M.A., Kulikov A.V. // Chin. J. Physiol. 2012. V. 55. № 4. P. 284-293.
12. Куликов А.В., Базовкина Д.В., Муазан М.П., Мормэд П. // Доклады РАН. 2003. Т. 293. С. 134-137.
13. Kondaurova E.M., Bazovkina D.V., Kulikov A.V., Popova N.K. // Genes. Brain. Behav. 2006. V. 5. № 8. P. 596-601.
14. Куликов А.В., Козлачкова Е.Ю., Попова Н.К. // Генетика. 1989. Т. 25. № 8. С. 1402-1408.
15. Kulikov A.V., Kozlachkova E.Y., Kudryavtseva N.N., Popova N.K. // Pharmacol. Biochem. Behav. 1995. V. 50. № 3. P. 431-435.
16. Li H., Durbin R. // Bioinformatics. 2009. V. 25. № 14. P. 1754-1760.
17. Garcia M., Juhos S., Larsson M., Olason P.I., Martin M., Eisfeldt J., DiLorenzo S., Sandgren J., Diaz De Stähl T., Ewels P., et al. // F1000Research. 2020. V. 9. P. 63.
18. McKenna A., Hanna M., Banks E., Sivachenko A., Cibulskis K., Kernytsky A., Garimella K., Altshuler D., Gabriel S., Daly M., et al. // Genome Res. 2010. V. 20. № 9. P. 1297-1303.
19. McLaren W., Gil L., Hunt S.E., Singh Riat H., Ritchie G.R.S., Thormann A., Flicek P., Cunningham F. // Genome Biol. 2016. V. 17. № 122. P. 1-14.
20. Chen X., Schulz-Trieglaff O., Shaw R., Barnes B., Schlesinger F., Källberg M., Cox A.J., Kruglyak S., Saunders C.T. // Bioinformatics. 2016. V. 32. № 8. P. 1220-1222.
21. Buniello A., MacArthur J.A.L., Cerezo M., Harris L.W., Hayhurst J., Malangone C., McMahon A., Morales J., Mount-joy E., Sollis E., et al. // Nucl. Acids Res. 2019. V. 47. № D1. P. 1005-1012.
22. Girdhar K., Hoffman G.E., Bendl J., Rahman S., Dong P., Liao W., Hauberg M.E., Sloofman L., Brown L, Devillers O., et al. // Nat. Neurosci. 2022. V. 25. № 4. P. 474-483.
23. Adzhubei I.A., Schmidt S., Peshkin L., Ramensky
V.E., Gerasimova A., Bork P., Kondrashov A.S., Sunyaev S.R. // Nat. Methods. 2010. V. 7. № 4. P. 248-249.
24. Dunn A.J., Snijders R., Hurd R.W., Kramarcy N.R. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982. V. 400. № 1. P. 345-353.
25. Snuders R., Kramarcy N.R., Hurd R.W., Nemeroff C.B., Dunn A.J. // Neuropharmacology. 1982. V. 21. № 5. P. 465-468.
26. Bhattacharya S.K., Rao P.J.R.M., Brumleve S.J., Parmar S.S. // Pharm. Res. 1986. V. 3. № 3. P. 162-166.
27. Dixon A.K. // Br. J. Med. Psychol. 1998. V. 71. № 4. P. 417-445.
