CC BY
22
УДК 616.981.452:575(471)
А.И.Павлова, Г.А.Ерошенко, Г.Н.Одиноков, Л.М.Куклева, Н.Ю.Шавина, Я.М.Краснов, В.В.Кутырев
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТАММОВ YERSINIA PESTIS СРЕДНЕВЕКОВОГО БИОВАРА ИЗ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ ЧуМЫ РОССИИ И МОНГОЛИИ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведен анализ генетических особенностей штаммов Yersinia pestis основного подвида, выделенных в природных очагах Российской Федерации и Монголии. Установлено, что в 7 из 9 очагов сусликового и песча-ночьего типа циркулируют штаммы средневекового биовара, имеющие типичный генотип glpDl napA2 rhaSl. В Забайкальском степном очаге распространены штаммы античного биовара с генотипом glpDl napAl rhaSl. Аналогичный генотип имеют штаммы Y. pestis из Тувинского горного очага чумы, что коррелирует с наличием денитрифицирующей активности и отсутствием у них маркерной мутации средневекового биовара - замены единичного нуклеотида G^-T в позиции 613 гена napA и свидетельствует о принадлежности штаммов из этого очага к античному биовару. Среди штаммов Y pestis, выделенных в Монголии, выявлены два атипичных штамма, не редуцирующие нитраты, но относящиеся к античному биовару.
Ключевые слова: возбудитель чумы, средневековый биовар, генотипы штаммов.
A.I.Pavlova, G.A.Eroshenko, G.N.Odinokov, L.M.Koukleva, N.Yu.Shavina, Ya.M.Krasnov, V.V.Kutyrev
Analysis of Genetic Variability of Yersinia pestis Strains (Medieval Biovar) Isolated in Natural Plague Foci of the Russian Federation and Mongolia
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Carried out is the analysis of genetic peculiarities of Yersinia pestis strains (main ssp.), isolated in natural foci of the Russian Federation and Mongolia. Determined is the fact that strains of medieval biovar characterized by typical glpDl napA2 rhaSl genotype circulate in 7 out of 9 marmot and sandy-type foci. Strains of antique biovar characterized by glpDl napAl rhaSl genotype prevail in the Trans-Baikal steppe foci. Y. pestis strains from Tuva mountain focus have similar genotype, which correlates with denitrification activity and absence of marker mutation of medieval biovar - single nucleotide substitution G^T in the 613 position of napA gene, and testifies to affiliation of these strains to antique biovar. Among Y. pestis strains isolated in Mongolia, identified are two atypical strains incapable of reducing nitrates but pertinent to antique biovar.
Key words: plague agent, medieval biovar, strain genotypes.
Штаммы Yersinia pestis основного (высоковирулентного и эпидемически значимого) подвида делятся на три биовара - античный, средневековый и восточный, каждый из которых получил пандемическое распространение во время одной из трех прошедших пандемий чумы. Для каждого из этих биоваров характерна принадлежность к различным ландшафтногеографическим зонам и очагам определенного типа. Штаммы античного биовара распространены, как правило, в высокогорных природных очагах сурочьего типа, в то время как штаммы средневекового биовара - в равнинно-предгорных, степных и пустынных очагах сусликового и песчаночьего типа, а штаммы восточного биовара - в очагах крысиного типа, расположенных на морских и океанических побережьях. В природных очагах чумы в Российской Федерации и сопредельных странах циркулируют штаммы средневекового и античного биоваров, причем большую часть из этих очагов занимают штаммы средневекового биовара, которые распространены на обширных пространствах засушливых зон степей и пустынь. Причины такой широкой распространенности штаммов средневекового биовара остаются не установленными. Возможно, они связаны с изменениями в геноме штаммов средневекового биовара, которые обеспечили их лучшую адаптацию к усло-
виям почвенного биоценоза нор грызунов в засушливых зонах расположения этих очагов.
В Российской Федерации существуют 11 природных очагов чумы. Значительное большинство из них (9) составляют очаги сусликового (очаги № 01-03, 14, 15, 38, 37) и песчаночьего (№ 16, 43) типов, в которых, как правило, циркулируют штаммы средневекового биовара [6, 7]. Штаммы этого биовара распространены и в большинстве природных очагов чумы, расположенных на пограничных с Россией территориях, в том числе в большой группе Среднеазиатских пустынных очагов (№ 18-30, 42), в Закавказских песчаночьих очагах (№ 07-13), в очаге сусликового типа в Казахстане (№ 17). В связи с этим очевидна необходимость тщательного изучения штаммов У. pestis средневекового биовара, имеющих широкое распространение на территории Российской Федерации. Важным также является установление генетических особенностей штаммов средневекового биовара из разных природных очагов чумы России и сопредельных стран и определение генотипов этих штаммов, наличие которых необходимо для установления происхождения изолятов У. pestis и возможных путей заноса инфекции.
В основе деления штаммов У. pestis основного подвида на биовары лежат два дифференциальных
биохимических признака - ферментация глицерина и редукция нитратов. Штаммы античного биовара активны в отношении обоих этих субстратов, штаммы средневекового биовара не редуцируют нитраты, а штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин. Отсутствие ферментации глицерина связано с наличием делеции размером 93 п.н. в гене glpD глицерол-3-фосфатдегидрогеназы у штаммов восточного биовара, а редукции нитратов - с наличием замены единичного нуклеотида G^-T в позиции 613 гена napA периплазматической нитратредуктазы у штаммов средневекового биовара [5, 8-10]. За исключением последнего признака, отсутствие редукции нитратов и лежащей в его основе мутации в гене napA, другие различия, которые могли бы быть использованы для дифференциации средневекового и античного биоваров, не выявлены. Генетические особенности штаммов средневекового биовара из природных очагов России и сопредельных стран исследованы недостаточно. В связи с этим в данной работе нами проведен анализ генетических свойств штаммов Y. pestis средневекового биовара из природных очагов России и некоторых сопредельных стран, и определены генотипы типичных и измененных штаммов Y pestis, распространенных на этих территориях.
Материалы и методы
Штаммы, биохимические свойства, выделение ДНК. Использованные в работе природные штаммы Y. pestis из различных очагов России и пограничных стран представлены в таблице. Штаммы выращивали на агаре Хоттингера (pH 7,2), в бульоне и на агаре LB (pH 7,2) в течение 18-24 ч при 28 °С. Изучение способности к редукции нитратов, ферментации глицерина и рамнозы проводили так, как это указано в практическом руководстве по лабораторной диагностике опасных инфекционных болезней [3]. Выделение ДНК штаммов Y pestis выполняли в соответствии с методическими указаниями [4].
ПЦР, секвенирование, биоинформационный анализ. ПЦР проводили по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.2569-09. Для амплификации фрагментов генов применяли ранее использованные праймеры [2, 5, 9, 10]. Полученные в ПЦР продукты анализировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле при напряжении 10-15 В/см. Для расчета олигонуклеотидных праймеров и проведения сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей использовали программы Primer Express и алгоритм BLAST. Секвенирование полученных ПЦР фрагментов генов осуществляли на генетическом анализаторе модели «CEQ 8000» (Beckman Coulter).
Результаты и обсуждение
В работе исследованы свойства 68 штаммов Y. pestis основного подвида из 9 природных очагов Российской Федерации сусликового и песчаночьего
типов, а также 8 штаммов, выделенных в Монголии. Количество изученных штаммов У. pestis из каждого природного очага представлено в таблице. Анализ биохимических свойств этих штаммов показал, что все они не ферментируют рамнозу (как это свойственно штаммам основного подвида), ферментируют глицерин и неоднородны по признаку редукции нитратов (таблица).
Ранее нами была разработана система мульти-локусного сиквенс-типирования штаммов У pestis, основанная на вариабельности генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые в фенотипических схемах внутривидовой классификации возбудителя чумы [1]. В разработанной системе ти-пирования в качестве генетического маркера средневекового биовара использована мутация - замена единичного нуклеотида G^■Т в позиции 613 гена парА периплазматической нитратредуктазы. Генотип по этому гену у штаммов античного и восточного биоваров был обозначен как парА1 (интактный ген), а штаммов средневекового биовара - парА2 (наличие замены нуклеотида). Аналогично этому, генотип штаммов античного и средневекового биовара по гену glpD был обозначен как glpD1 (интактный ген), а восточного биовара - glpD2 (делеция размером 93 п.н.). Для разделения штаммов У. pestis основного и неосновных подвидов использовали замену единичного нуклеотида G^■A в позиции 671 регуляторного гена гка8 рамнозного оперона у основного подвида (генотип гкаБ1), которая отсутствует у штаммов неосновных подвидов (генотип тка^2') - кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского [2]. В соответствии с фенотипическими признаками характерными генотипами биоваров возбудителя чумы являются: у античного - glpD1 napА1 гкаБ1, у средневекового -glpD1 napА2 гкаБ1 и у восточного - glpD2 napА1 гкаБ1.
Для получения молекулярной характеристики и определения генотипов штаммов из природных очагов Российской Федерации и некоторых пограничных стран нами был проведен анализ наличия у них маркерных мутаций, типичных для разных био-варов У. pestis. У всех использованных в нашей работе штаммов не выявлено в ПЦР делеции размером в 93 п.н. в гене glpD, и, следовательно, эти штаммы не относились к восточному биовару. Все они содержали характерную для штаммов основного подвида замену единичного нуклеотида в позиции 671 гена гкаБ, что на генетическом уровне подтверждало их принадлежность к основному подвиду возбудителя чумы. По способности к редукции нитратов и наличию характерной делеции в позиции 613 гена napA среди изученных штаммов У. pestis было выявлено несколько вариантов. Оказалось, что в большинстве очагов (7 из 9) сусликового и песчаночьего типов в России циркулируют штаммы средневекового биовара, которые содержат характерную мутацию - замену единичного нуклеотида G^■Т в позиции 613 гена napA. Это штаммы из Центрально-
Штаммы Y. pestis из природных очагов чумы, их фенотипическая и генетическая характеристика
Очаги (количество изученных штаммов) Ферментация глицерина Редукция нитратов Ферментация рамнозы glpD* napA** rhaS*** Генотипы
Песчаночьего типа:
Волго-Уральский песчаный (10) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! - ср
Прикаспийский песчаный (7) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! - ср
Сусликового типа:
Центрально-Кавказский высокогорный (15 ) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! - ср
Терско-Сунженский низкогорный (3 ) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! — ср
Дагестанский равнинно-предгорный (8 ) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! — ср
Прикаспийский Северо-Западный степной ( 7) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! — ср
Волго-Уральский степной (5 ) + - -1 21 glpD1 парА2 гкаБ! — ср
Забайкальский степной (5) + + -1 11 glpD1 парА1 гкаБ! — ант
Тувинский горный (8 ) + + -1 11 glpD1 парА1 гкаБ! — ант
Монголия (8)
2 + - -1 11 glpD1 парА1 гкаБ! — ант
6 + + -1 11 парА1 гкаБ! — ант
CO92 (GenBank) - + -2 11 glpD2 парА1 гкаБ! — вост.
Antiqua (GenBank) + + -1 11 парА1 гкаБ! — ант
Harbin35 (GenBank) + - -1 11 glpD1 парА1 гкаБ! - ант
KIM (GenBank) + - -1 21 па^2 гкаБ! — ср
PestoidesF (GenBank) + + + 1 1 2 glpD1 па^2 гкаБ! — кавк. п/в
* Отсутствие (1) или наличие (2) делеции в гене glpD.
**Отсутствие (1) или наличие (2) замены нуклеотида в позиции 613 гена парА. ***Наличие (1) или отсутствие (2) замены нуклеотида в позиции 671 гена гка8.
Кавказского высокогорного, Терско-Сунженского низкогорного, Дагестанского равнинно-предгорного. Прикаспийского Северо-Западного степного, ВолгоУральского степного, Волго-Уральского песчаного и Прикаспийского песчаного очагов чумы. Они имеют типичный генотип средневекового биовара glpD1 парА2 гкаБ1 (таблица).
Два из восьми штаммов У. pestis, изолированных в пограничной с Россией Монголии - У. pestis 231/14 (Хэнтейский аймак) и 231 (21) (Запхинский аймак), имели другой генотип. Эти штаммы не редуцировали нитраты, на основании чего были отнесены ранее к средневековому биовару. Однако проведенное нами секвенирование гена napA показало, что у обоих штаммов отсутствует мутация в позиции 613 этого гена, и что их генотип идентичен штаммам античного биовара - glpD1 парА1 гкаБ1. Аналогичное несовпадение между фенотипом и генотипом выявлено нами у выделенного в Китае штамма У. pestis НагЫп35, который, по данным базы NCBI GenBank. относится к средневековому биовару, но, как установлено нами при анализе его нуклеотидной последовательности, также не содержит мутации в гене парА, и имеет генотип античного штамма - glpD1 парА1 гкаБ1. Таким образом, нами впервые выявлено несоответствие между дифференциальным признаком -редукцией нитратов и наличием маркерной мутации в гене парА, что ставит под сомнение диагностическую значимость одного из этих маркеров.
Для того чтобы уточнить биоварную принадлежность атипичных штаммов, выделенных в Монголии
и Китае, нами был проведен поиск новых ДНК мишеней, которые могли быть использованы для дифференциации штаммов античного и средневекового биоваров. Проведенный сравнительный компьютерный анализ штаммов античного биовара Y. pestis Antiqua, Nepal315 (NCBI GenBank) и средневекового биовара KIM позволил нам выявить наличие делеции размером 24 п.н. после 3626563 нуклеотида у штамма KIM, которая отсутствовала у штаммов Antiqua и Nepal315. На вариабельный участок генома KIM были сконструированы праймеры, имевшие следующие последовательности.
M 24-S ataccggtattttgtgtc
M 24-As attaatgagacaccgcca
Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР: 1 цикл - 94 °С в течение 5 мин, затем 35 циклов - 94 °С 45 с, 56 °С 1 мин, 72 °С 45 с и завершающий цикл - 3 мин при 72 °С.
С помощью разработанной ПЦР было исследовано наличие делеции размером 24 п.н у штаммов основного подвида Y. pestis, использованных в этой работе. Оказалось, что эта делеция, обозначенная нами как М 24, отсутствовала у всех штаммов античного биовара, но присутствовала практически у всех штаммов средневекового биовара (рисунок). Эта ДНК мишень использована нами как дополнительный маркер штаммов средневекового биовара. На ее наличие были проверены атипичные штаммы, выделенные в Монголии Y pestis 213/14 и 235 (21) и штамм Harbin35 из Китая (NCBI GenBank). Делеция М 24 в их геноме отсутствовала, что в комплексе с
222 п.н.
198 п.н. —>
ПЦР-анализ на наличие делеции размером 24 п.н. у штаммов У. pestis^.
1 - Терско-Сунженский низкогорный (14Д); 2—6 - Тувинский горный (И-3223, И-3358, И-2638, И-3205, 1771); 7 - Дагестанский равнинно-предгорный (С749); 8-10 - Забайкальский степной (И-1270, 1843, И-1996); 11—12 - Прикаспийский Северо-Западный степной (65(98), 177 (264)); 13-14 - Волго-Уральский степной (А-1792, 107);
15-16 - Центрально-Кавказский высокогорный (С-761, С-624);
17-18 - Волго-Уральский песчаный (М-1245, М-1274);
19 - Прикаспийский песчаный (133); 20 - отрицательный контроль
отсутствием маркерной мутации в гене napA доказывает принадлежность этих атипичных по признаку редукции нитратов штаммов к античному биовару.
В число 7 природных очагов чумы сусликового типа, расположенных на территории Российской Федерации, входят Забайкальский степной и Тувинский горный очаги. Фенотипический анализ штаммов У. pestis из этих природных очагов чумы, показал, что они способны к редукции нитратов (таблица), что свидетельствует о том, что эти штаммы не относятся к средневековому биовару. О циркуляции штаммов У. pestis античного биовара в Забайкальском степном очаге сусликового типа известно давно. Это связывают с произошедшей здесь в середине прошлого столетия сменой основного носителя. Взамен истребленного в результате хозяйственной деятельности человека монгольского сурка Marmota sibirica основным носителем чумы в этом природном очаге стал даурский суслик СШПш dauricus. В то же время смены носителя в Тувинском горном очаге не зарегистрировано, и основным носителем чумы в этом природном очаге является длиннохвостый суслик С. и^иШш, в связи с чем остается неясным, почему штаммы из этого природного очага чумы обладают способностью к редукции нитратов, в соответствии с которой по фенотипической схеме классификации они должны быть отнесены к античному биовару.
Для определения генотипов штаммов из Забайкальского степного и Тувинского горного очагов чумы нами было проведено секвенирование гена napA и исследовано наличие у них делеции М 24. Как оказалось, характерная для средневекового био-вара мутация (замена единичного нуклеотида G^■Т в позиции 613) гена napA у этих штаммов отсутствует, что, в комплексе с наличием у них способности к редукции нитратов, доказывает их принадлежность к античному биовару. Эта принадлежность подтверждена нами и при использовании ПЦР для выявления
делеции М 24, которая, как оказалось, отсутствует в их геноме. Полученные нами данные на генетическом уровне подтверждают принадлежность штаммов из Забайкальского степного очага чумы к античному биовару, а также впервые ставят вопрос о циркуляции штаммов античного биовара и в Тувинском горном очаге чумы сусликового типа. В отношении Тувинского горного очага чумы остается неясным вопрос о том, произошла ли здесь незарегистрированная ранее смена основного носителя, или тип носителя вообще не важен для циркуляции штаммов античного или средневекового биоваров. Полученные нами данные о циркуляции в Забайкальком степном и Тувинском горном очагах чумы сусликового типа штаммов античного биовара свидетельствуют об отсутствии жесткой корреляции между биоварной принадлежностью штаммов Y pestis и типом основного носителя в очаге. Из примера Забайкальского степного очага следует, что произошедшая здесь смена носителя не привела к замене существующих на этой территории штаммов античного биовара на штаммы средневекового биовара, которые, как правило, циркулируют в очагах сусликового типа.
Результаты, полученные в этой работе, также ставят вопрос о диагностической ценности признака редукции нитратов как характерного признака средневекового биовара. Выявление нами атипичных штаммов Y pestis античного биовара, не способных редуцировать нитраты, свидетельствует о необходимости использования генетического маркера - мутации (замены единичного нуклеотида G^-Т в позиции 613) гена napA для доказательства принадлежности исследуемого изолята Y pestis к средневековому биовару. Эти факты еще раз подтверждают преимущество использования генетических методов дифференциации по сравнению с фенотипическими. Эти данные также требуют разработки более надежных методов разделения штаммов античного и средневекового биоваров, основанных на их генетических особенностях.
Работа выполнена по государственному контракту № 53-Д от 04.06.12 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 годы)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ерошенко Г.А., Одинокое Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Краснов Я.М., Шавина Н.Ю. и др. Стандартный алгоритм молекулярного типирования штаммов Yersinia pestis. Журн. ми-кробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2012; 3:25-35.
2. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Одиноков Г.Н., Кутырев В.В. Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов. Пробл. особо опасных инф. 2008; 3(97):38-42.
3. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М: Медицина; 2009. 470 с.
4. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: МУ 1.3.2569-09. М.; 2009. 42 с.
5. Одиноков ГН, Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Структурно-функциональный
анализ генов nap оперона у штаммов Yersinia pestis разных подвидов. Пробл. особо опасных инф. 2008; 4(98):40-2.
6. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: Медицина; 2004. 192 с.
7. ПоповН.В., Безсмертный В.Е., МатросовА.Н., Немченко Л.С., ВержуцкийД.Б., Малецкая О.В. и др. Эпизоотическая активность природных очагов чумы Российской Федерации в 2010 г. и прогноз на 2011 г. Пробл. особо опасных инф. 2011; 1(107):31-7.
8. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Genome sequence of Yersiniapestis KIM. J. Bacteriol. 2002; 184:4601-11
9. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliot J.M. et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding glycerol-3-phosphate dehydrogenase (glpD). J. Bacteriol. 2002; 184:1019-27.
10. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. DNA microarray analysis of genome dynamics in Yersinia pestis: insights into bacterial genome microevolution and niche adaptation. J. Bacteriol. 2004; 186:5138-46.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Pavlova A.I., Krasnov YaM., Shavina N.Yu. et al. [Standard algorithm of molecular typing of Yersinia pestis strains]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2012; 3:25-35.
2. Koukleva L.M., Yeroshenko G.A., Kouklev VE., Krasnov YaM., Guseva N.P., Odinokov G.N., Kutyrev VV [Comparison of complete nucleotide sequence of rhaS gene in the strains of plague etiological agent of main and minor subspecies]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2008; (97):38-42.
3. Onishchenko G.G., Kutyrev VV., editors [Laboratory Diagnostics of Particularly Dangerous Infections. Practical Guidelines]. M.: Meditsina; 2009. 470 p.
4. [Labor management in laboratories using nucleotide acid amplification methods for work with objects containing microorganisms of I-IV groups of pathogenicity: MR 1.3.2569-09]. M.; 2009. 42 p.
5. Odinokov G.N., Eroshenko GA., Vidyaeva NA., Krasnov JaM., Gouseva N.P., Kutyrev VV [Structural and functional analysis of nap operon genes in Yersinia pestis strains of different subspecies]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2008; (98):40-2.
6. Onishchenko G.G., Kutyrev VV, editors [Plague Natural Foci in Caucasus, Caspian Sea Region, Central Asia and Siberia]. M.: Meditsina; 2004. 192 p.
7. Popov N.V, Bezsmertny VE., Matrosov A.N., Nemchenko L.S., Verzhutsky D.B., Maletskaya O.V et al. [Epizootic activity of plague natural foci in the Russian Federation in 2010 and prognosis for 2011]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; (107):31-7.
Authors:
Pavlova A.I., Eroshenko GA., Odinokov G.N., Koukleva L.M., Shavina N.Yu., Krasnov YaM., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
ПавловаА.И., ЕрошенкоГА., ОдиноковГ.Н., КуклеваЛМ., Шавина НЮ., Краснов ЯМ., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 05.09.12.
