CC BY
73
УДК 575.22; 502.4
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ НАЗЕМНОГО МОЛЛЮСКА внапувлт гвитюиттт. с использованием паро- и іббп- маркеров1
Э.А. Снегин
Белгородский государственный национальный исследовательский университет Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы 85
E-mail: snegin@bsu.edu.ru
На основе метода полимеразной цепной реакции с использованием RAPD- и ISSR- маркеров ДНК проанализирована генетическая структура популяций модельного вида наземных моллюсков Brady-baena fruticum Müll, обитающих в условиях Среднерусской возвышенности. Дается расшифровка полученных фингерпринтов. Выделены полиморфные и мономорфные ампликоны. Определен уровень генетической изменчивости и выяснена степень оригинальности генофондов изученных популяций.
Ключевые слова: ПЦР, наземные моллюски, популяционный генофонд, Среднерусская возвышенность.
Введение
На протяжении последних сорока лет ведутся исследования популяционной структуры кустарниковой улитки (Bradybaena (Fruticicola) fruticum Müll.) на территории Европы с использованием полиморфных признаков раковины и изоферментов [1—13]. Несмотря на значимость результатов, полученных в предыдущих работах, проанализирована изменчивость только кодирующей части генома, тогда как остальная часть «молчащей» ДНК осталась вне поля зрения. Настоящая работа является первой попыткой изучения внутрипопуляционной изменчивости этого вида на основе маркеров, включающих случайные участки генома, а так же тандемные повторы сателлит-ной ДНК.
Цель работы. На основе метода полимеразной цепной реакции с использованием RAPD- и ISSR-маркеров, оценить уровень изменчивости в популяциях Br. fruticum в условиях Среднерусской возвышенности.
Для сопоставления были взяты выборки из популяций, обитающих на территории Урала, Вятского региона и Румынии.
Материал и методика
Материалом для исследования послужили образцы тканей особей Br. fruticum, хранящиеся в криобанке, созданном при зоологическом музее БелГУ. Выборки из популяций были сделаны во время экспедиции с 2004 по 20010 годы. Моллюски собирались вручную с поверхности почвы, со стеблей и листьев растений, иногда в подстилке. Всего было исследовано 697 особей из шестнадцати популяций. Описание пунктов сбора приведены в табл. 1.
Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции (RAPD, ISSR). В результате предварительного скрининга были выбраны три праймера, дающие наиболее хорошо выделяющиеся и воспроизводимые фингерприн-ты (табл. 2).
Метод RAPD. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, 100 мМ трис-НС1 (рН=8.з), 500 мМ КС1, 2 мМ MgCl, 0.25 dNTP, 0.5 мМ праймера, 0.5 единиц Taq ДНК-полимеразы. Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин/94°С, 35 циклов (денатурация---45 с/94°С, отжиг праймера -
15 с/30°С, 15 с/45°С, синтез - 1 мин/72°С), дополнительный синтез - 10 мин/72°С, охлаждение до 4°С.
1 Работа выполнена при финансовой поддержке программы РНПВШ № 2.2.3.1/ 9731, РФФИ № 09-04-97513 р_центр_а., Министерства образования и науки РФ ГК П 1050.
Регион Пункт N
Среднерусская
возвышенность
1 11
2 21
3 22
4 65
5 71
15
50
8 25
9 30
Вятский
регион
Урал
Румыния
10
11
12
13
14
16
16
43
17
23
54
81
84
85
Таблица 1
Описание пунктов сбора
Описание биотопа Пойма р. Осколец, д. Стойло (Старооскольский р-н Белгородской области). Заросли ивы, в подлеске лопух и крапива. Северные окрестности территории Стойленского ГОКа. Заповедный участок «Ямская степь» (Губкинский район Белгородской области). Смешанный лес, заросли крапивы. Территория влияния Лебединского ГОКа и, в меньшей степени, Стойленского.
Долина р. Оскол, дубрава возле с. Сорокино (Старооскольский р-н Белгородской области). Заросли крапивы и лопуха. Территория влияния Стойленского ГОКа, г. Ст. Оскол и, в меньшей степени, Лебединского ГОКа.
Пойма р. Дубенка (Губкинский и Старооскольский р-ны Белгородской области). Пойменная дубрава, в подлеске крапива, лопух, хмель. Территория влияния Стойленского и Лебединского ГОКов.
Байрачная дубрава возле с. Коньшино (Губкинский р-н Белгородской области). Заросли крапивы. Территория влияния Лебединского и, в меньшей степени, Стойленского и ГОКов. Пойма р. Оскол возле д. Завалищено (Старооскольский р-н Белгородской области). Заросли лопуха, борщевика и крапивы. Территория влияния Стойленского ГОКа, Оскольского электрометаллургического комбината и, в меньшей степени, Лебединского ГОКа.
Пойма р. Короча возле с. Дмитриевка (Шебекинский р-н Белгородской области). Пойменный лес из ивы и клена, заросли крапивы.
Заповедный участок «Стенки Изгорья» (Новооскольский р-н Белгородской области) - заболоченный биотоп, заросли ольхи, в подлеске лопух и крапива
Памятник природы «Борки» (Валуйский р-н Белгородской области) - пойма р. Козинка, ивовый лес, заросли лопуха, крапивы и хмеля.
«Ровеньский природный парк», участок «Айдарский». Пойма реки Айдар, окрестности пос. Ровеньки (Белгородская область). Умеренно увлажненный открытый участок. Заросли лопуха, борщевика с примесью крапивы.
Пойма р. Оскол возле г. Купянск (Харьковская область). Пойменный ивовый лес.
Историко-природный музей-заповедник «Дивногорье» (Острогожский р-н Воронежской области). Пойма р. Тихая Сосна. Лопух, крапива, хмель.
Заповедный участок «Галичья гора» (Липецкая область). Пойма р. Дон. Заросли крапивы, борщевика, лопуха и хмеля. Пойма р. Вятка. Территория городского парка г. Киров. Заросли крапивы и таволги.
Природный парк «Оленьи ручьи» (Свердловская область, Нижнисергинский р-н) - сосново-еловый лес с березой и лиственницей, поляна, заросли таволги, малины.
Долина реки Олт, предгорье Трансильванских Альп возле пос. Авриг. Пойменный лес из ивы и клена, каменистый грунт, сильное увлажнение, заросли крапивы, лопуха и хмеля.
6
7
Метод ^БЯ. Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, 100 мМ трис-НС/ (рН=8.з), 500 мМ КС1, 4 мМ МдС1, 0.25 йЫТР, 0.5 мМ праймера, 0.5 единиц Тад ДНК-полимеразы. Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин/94°С, 40 циклов (денатурация-30 с/94°С, отжиг праймера -
30 с/55°С, синтез - 2 мин/72°С), дополнительный синтез - 10 мин/72°С, охлаждение до 4°С.
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности используемых праймеров
Метод Праймер Последовательность Количество локусов
RAPD OPF 8 5’-GGGATATCGG-3’ 14
ISSR It 1 (CA)8GT 14
UBC 827 (AC)8G 16
Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с использованием ТАЕ буфера, 100 В - 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием.
По картинам электрофореза составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). Ввиду того, что при методе RAPD могут появляться неспецифические продукты амплификации, для анализа мы использовали четко просматриваемые и воспроизводимые ампликоны.
Обработка полученных данных проводилась с использованием программы GenAlEx [14].
Полученные результаты и обсуждение
Полученные фингерпринты приведены на рис. 1, 2. На рис. 2 дается так же расшифровка полученных ДНК-паттернов по трем праймерам.
1500 bp 850 bp
400 bp 200 bp
t • —
Рис. 1. ISSR-PCR спектры ДНК: 1 - праймер It 1; 2 - праймер UBC 827
OPF8 It 1 UBC 827
1500 bp 850 bp
400 bp 200 bp 50 bp
1500 bp 850 bp
400 bp 200 bp 50 bp
14
14
16 ■
1500 bp 850 bp
400 bp 200 bp 50 bp
2
1
1
Рис. 2. Слева - КЛРБ-РОК спектры ДНК, праймер ОРГ8. Справа - расшифровка ДНК-паттернов по трем праймерам (номерами обозначены только первые и последние локусы)
На рис. 3 представлены уровни гетерозиготности сорока четырех локусов, вычисленные на основе анализа шестнадцати популяций. Согласно представленным данным наиболее полиморфными среди ИАРБ-маркеров являются локусы 3 и 7, а среди КБЕ-маркеров более изменчивы оказались локусы 3, 9 и 12 по праймеру К 1, и локусы 4, 5, 8, 10 по прамеру ИБО 827. В группу более мономорфных локусов вошли: по праймеру ОРБ 8 - локусы 1, 11 и 12, по праймеру К 1 - локусы 1, 13 и 14, по праймеру иВС 827 - локусы 2, 14, 15 и 16.
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
| | | | | — | | | | | | | | | | | — | | | | | | | | | | | — | | | | | | | | | | | — | | | |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
ОРБ 8 И 1 иве
Рис. 3. Уровень гетерозиготности сорока четырех локусов (усредненные данные по шестнадцати популяциям)
Усредненные частоты аллелей и уровни гетерозиготности для исследуемых популяций, вычисленные по различным праймерам представлены в табл. 3. Согласно полученным данным уровень гетерозиготности популяций по различным праймерам неодинаков. В популяциях 1, 2, 14 - наибольшая гетерозиготность отмечена по праймеру иБС 827, в популяциях 3 и 5 - по праймеру ОРБ 8, в популяциях 4, 6,7, 11, 12, 15 - по праймеру К 1. Еще в двух группах (7, 16) наиболее изменчивы оказались межмикросателлитные участки (по праймерам К 1 и ИВС 827). Только в четырех популяциях (пункты 8, 9, 10, 13) по трем праймерам получены сходные высокие значения гетерозиготности. Стоит отметить, что эти группы обитают на особо охраняемых природных территориях.
Таблица 3
Средние частоты аллелей и уровни гетерозиготности, вычисленные по различным праймерам
Пункт ОРБ 8 К 1 ИВС 827
Р q Не р q Не Р q Не
1 0.250 0.750 0.111 0.112 0.888 0.100 0.196 0.804 0.210
2 0.338 0.662 0.154 0.232 0.768 0.183 0.269 0.731 0.248
3 0.261 0.739 0.198 0.193 0.807 0.082 0.164 0.836 0.184
4 0.273 0.727 0.135 0.139 0.861 0.223 0.100 0.900 0.135
5 0.280 0.720 0.233 0.192 0.808 0.138 0.216 0.784 0.169
6 0.355 0.645 0.052 0.211 0.789 0.264 0.227 0.773 0.155
7 0.184 0.816 0.198 0.196 0.804 0.248 0.341 0.659 0.243
8 0.335 0.665 0.273 0.165 0.835 0.219 0.280 0.720 0.255
9 0.310 0.690 0.209 0.163 0.837 0.222 0.218 0.782 0.235
10 0.301 0.699 0.252 0.219 0.781 0.282 0.203 0.797 0.255
11 0.188 0.812 0.153 0.213 0.787 0.230 0.320 0.680 0.177
12 0.306 0.694 0.176 0.197 0.803 0.240 0.129 0.871 0.192
13 0.346 0.654 0.273 0.207 0.793 0.256 0.239 0.761 0.222
14 0.339 0.661 0.070 0.170 0.830 0.239 0.299 0.701 0.303
15 0.259 0.741 0.127 0.271 0.729 0.318 0.305 0.695 0.235
16 0.287 °.713 0.155 0.155 0.845 0.227 0.199 0.801 0.253
Примечание: р - средняя частота присутствия апликона, q - средняя частота отсутствия ампликона, Не - предполагаемая гетерозиготность.
Результаты однофакторного дисперсионного анализа, приведенные в таблице
4, демонстрируют высокую оригинальность исследуемых популяций по соотношению частот аллелей используемых локусов ДНК. Во всех случаях межпопуляционная вари-анса достоверно превосходит внутрипопуляционную. Это подтверждает выдвинутый нами ранее тезис [12, 13], что урбанизированный лесостепной ландшафт, в условиях которого обитает большинство изучаемых групп улиток, нарушает естественные миграционные процессы, приводит к сильной изолированности и, как следствие, ведет к формированию своеобразных популяционных генофондов.
Таблица 4
Результаты однофакторного дисперсионного анализа частот аллелей исследуемых локусов
Локусы праймеров Изменчивость 55 df Ив
ОРБ 8 Между группами 643.1 15 42.9 35.8 1.22
Внутри групп 849.7 681 1.2
К 1 Между группами 387.8 15 25.9 12.9
Внутри групп 1341.5 681 2.0
ИБО 827 Между группами 516.6 15 34.4 19.1
Внутри групп 1259.9 681 1.8
По всем локусам Между группами 1547.5 15 103.2 20.2
Внутри групп 3451.1 681 5.1
В целом по 44 локусам среди популяций Среднерусской возвышенности наибольшие показатели генетической изменчивости отмечены в группах
7, 8, 9, 10, 12, 13 (табл. 5). Сходный высокий уровень изменчивости зафиксирован в популяциях Вятского
регионов (14) , Урала (15) и Румынии (16). Наиболее мономорфной оказалась популяция из пункта 1, обитающая на территории Стойленского горно-обогатительного комбината.
Таблица 5 Значения
Показатели генетического разнообразия генетического рас-
в исследуемых популяциях стояния, вычис-
ленные по Неи (табл. 6), демонстрируют, что по соотношению частот аллелей среди популяций Среднерусской возвышенности наиболее оригинальной является популяция из заповедного участка «Ямская степь» (пункт 2), которая дальше всех дистанцировалась от большинства популя-
Примечание: Р - процент полиморфных локусов; Ае - среднее эффек- ций региона,
тивное число аллелей на локус; I - индекс Шеннона; Не - предпола- включая и близ-гаемая гетерозиготность; значения Ш±Бе лежащие группы
(пункт 1, 6). К румынской группе наиболее близкими оказались популяции из пунктов 6 и 10. Кроме того, группа из пункта 6 так же наиболее близка к популяции из Вятского региона, а группа из пункта 10 ближе остальных групп из Среднерусской возвышенности стоит к уральской популяции.
Пункт Р% Ае I Не
1 47.7 1.24±0.34 0.220 0.144±0.028
2 65.9 1.33±0.37 0.300 0.197±0.030
3 61.4 1.26±0.35 0.243 0.156±0.028
4 72.7 1.25±0.29 0.263 0.163±0.025
5 79.5 1.28±0.32 0.286 0.180±0.026
6 50.0 1.26±0.34 0.239 0.157±0.029
7 79.5 1.39±0.35 0.354 0.230±0.028
8 72.7 1.43±0.38 0.371 0.249±0.031
9 79.5 1.37±0.37 0.342 0.222±0.029
10 81.8 1.45±0.37 0.395 0.262±0.029
11 63.6 1.31±0.35 0.286 0.186±0.029
12 75.0 1.33±0.35 0.316 0.202±0.028
13 79.5 1.44±0.40 0.370 0.249±0.031
14 70.5 1.35±0.36 0.318 0.209±0.029
15 81.8 1.38±0.36 0.347 0.227±0.029
16 75.0 1.35±0.34 0.382 0.213±0.028
Таблица 6
Значения генетического расстояния (по Неи [15])
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Пункт
0.000 1
0.216 0.000 2
0.110 0.195 0.000 3
0.098 0.170 0.165 0.000 4
0.039 0.157 0.068 0.119 0.000 5
0.122 0.220 0.193 0.116 0.105 0.000 6
0.199 0.186 0.238 0.173 0.212 0.178 0.000 7
0.145 0.207 0.160 0.146 0.135 0.203 0.166 0.000 8
0.139 0.216 0.157 0.108 0.149 0.160 0.162 0.071 0.000 9
0.130 0.124 0.138 0.098 0.114 0.114 0.113 0.100 0.112 0.000 10
0.180 0.182 0.178 0.202 0.183 0.211 0.176 0.171 0.146 0.118 0.000 11
0.174 0.218 0.124 0.131 0.147 0.207 0.215 0.140 0.128 0.104 0.171 0.000 12
0.139 0.169 0.156 0.117 0.100 0.129 0.161 0.132 0.109 0.077 0.130 0.185 0.000 13
0.121 0.201 0.238 0.144 0.148 0.051 0.116 0.200 0.190 0.124 0.187 0.270 0.142 0.000 14
0.254 0.196 0.248 0.231 0.254 0.224 0.154 0.176 0.141 0.084 0.125 0.163 0.177 0.216 0.000 15
0.112 0.168 0.189 0.104 0.123 0.073 0.146 0.185 0.176 0.097 0.175 0.217 0.154 0.059 0.207 0.000 16
Литература
1. Хохуткин И.М. Полиморфизм и границы популяций наземных моллюсков из рода Bradybaena // Экология. - 1971. - № 4. - С. 73-80.
2. Хохуткин И. М. О наследовании признака "опоясанности" в естественных популяциях наземного брюхоногого моллюска Bradybaena fruticum (Mull.) // Генетика. - 1979. - Т. 15, № 5. - С. 868-871.
3. Хохуткин И.М. Структура изменчивости видов на примере наземных моллюсков. -Екатеринбург: УрО РАН, 1997. - 175 с.
4. Матекин П.В., Макеева В.М. Полиморфная система эстераз и пространственная структура вида у кустарниковой улитки (Bradybaena fruticum Mull.) // Журн. общ. биол. -1977. - Т. 38, № 6. - С. 908-913.
5. Макеева В.М., Пахорукова Л.В., Уголкова Н.Д. Анализ динамики полиморфных признаков в популяциях Bradybaena fruticum в целях экологического мониторинга // Журн. общ. биол. - 1995. - Т. 56, № 5. - С. 170-185.
6. Макеева В.М., Белоконь М.М., Малюченко О.П., Оценка состояния генофонда природных популяций беспозвоночных животных в условиях фрагментарного ландшафта Москвы и Подмосковья (на примере кустарниковой улитки Bradybaena fruticum (Müll) // Генетика. -2005. - № 11. - С.1495-1510.
7. Макеева В.М., Белоконь М.М., Смуров А.В. Эколого-генетический подход к охране животных антропогенных экосистем (на примере модельных видов в Москве и Подмосковье). -М.: Изд-во Московск. ун-та. - 2011. - 160 с.
8. Зейферт Д.В. Действие естественного отбора на генетическую структуру популяций наземного моллюска Bradybaena fruticum (Mull.) // Журн. общ. биол. - 1987. - Т. 48, № 4. -
С. 549-554.
9. Зейферт Д.В., Хохуткин И.М. Экология кустарниковой улитки Fruticicola fruticum -М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. - 92 с.
10. Falniowski A., Szarowska M., Witkowska-Pelc E. Intra- and interpopulation genetic differentiation and gene flow in a group of isolated populations of Bradybaena fruticum (Muller, 1774) in South Poland // Journ. of Zoolog. Systematics and Evolutionary Research. - 2004. - Vol. 42, № 1. -P. 70-80
11. Снегин Э. А., Структура расселенности Bradybaena fruticum (Mollusca, Gastropoda, Pulmonata) в условиях юга лесостепной зоны Русской равнины. Автореф. дис. ... канд. биол. н. -М, 1999. - 22 с.
12. Снегин Э. А., Эколого-генетические аспекты расселения Bradybaena fruticum (Mollusca, Gastropoda, Pullmonata) в элементах лесостепного ландшафта // Экология. - 2005. -№ 1. - С. 39-47.
13. Снегин Э. А., Оценка состояния популяционных генофондов наземных моллюсков в условиях влияния горно-обогатительных комбинатов на примере Bradybaena fruticum Müll (Gastropoda, Pulmonata) // Экологическая генетика. - 2010. - Т. VIII, № 2. - С. 45-55.
14. Peakall R., Smouse P.E., GenAlEx V5: Genetic Analisis in Excel. Population genetic software for teaching and reseach. Australion National University. - Canberra, Australia, 2001. -http://www.anu.edu.au./BoZo/GenAlEx/.
15. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a smoll numba of individuals // Genetics. - 1978. - Vol. 89. - P. 583-590.
ANALYSIS OF THE GENETIC VARIABILITY OF POPULATIONS OF LAND SNAIL BRMDYBMiNM MT/GUmm. USING RAPD AND ISSR MARKERS
E-mail: snegin@bsu.edu.ru
Belgorod State National Research University, Pobedy St., 85, Belgorod, 308015, Russia;
E.A. Snegin
On the basis of the method of polymerase chain reaction, using RAPD and ISSR DNA markers the genetic structure of populations of model species of terrestrial molluscs Bradybaena fruticum Müll., living in Central Russian Upland, has been analyzed. We give a transcript of the obtained fingerprints. Polymorphic and monomorphic amplicons are identified. The level of genetic variability and the degree of originality of gene pools of studied populations are determined.
Key words: PCR, terrestrial mollusks, population gene pool, Central Russian Upland.
