CC BY
8УДК 612.843.116.1; 591.185.67
АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ РАЗЛИЧИЙ ЗЕЛЕНЫХ И КРАСНЫХ ПАЛОЧЕК БЕСХВОСТЫХ АМФИБИЙ
DOI
Ротов А. Ю., Астахова Л. А., Новоселов А. Д., Ермолаева М. Э., Фирсов М. Л.
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Россия e-mail: rotovau@gmail.com
Аннотация: Зеленые палочки — уникальные фоторецепторы сетчатки амфибий. В данной работе мы показали, что они являются еще более специализированными рецепторами ночного зрения, чем типичные «красные» палочки, а их чувствительность к низким освещенностям повышена за счет замедленной кинетики выключения и высокой стабильности зрительного пигмента.
Ключевые слова: амфибии, зеленые палочки, красные палочки, зрительные пигменты
В сетчатке бесхвостых и некоторых хвостатых амфибий, помимо палочек и нескольких типов колбочек, встречается уникальный тип фоторецепторов — так называемые «зеленые палочки» (ЗП). Эти клетки примечательны тем, что они содержат колбочко-спец-ифичный синечувствительный зрительный пигмент, однако имеют морфологию наружного сегмента, типичную для типичных «красных палочек» (КП). Таким образом, они сочетают признаки, характерные как для типичных палочек, так и для колбочек, что делает их привлекательным объектом для изучения функциональных переходов в эволюции фоторецепторов.
Ранее было показано, что ЗП жабы по своей функции являются рецепторами сумеречного зрения — подобно КП, они обладают высокой чувствительностью и насыщаются при ярких засветках [1]. Необычные биохимические свойства демонстрирует также си-нечувствительный пигмент ЗП бесхвостых амфибий — в экспериментах in vitro он менее склонен к спонтанной темновой активации, чем гомологичные пигменты колбочек других позвоночных, и близок по этому параметру к родопсину КП [2]. Исходя из этого, можно
было бы ожидать, что спонтанные темновые события (дискретный шум) в ЗП будут происходить с той же частотой, как и в КП, однако два независимых исследования, выполненных на изолированных фоторецепторах, дали результаты, различающиеся в 400 раз [3, 4]. Такое расхождение не позволяет корректно оценить предельную чувствительность ЗП, ограниченную в том числе дискретным тем-новым шумом клетки. Оценка чувствительности ЗП в сравнении с КП важна для понимания механизмов палочкового (сумеречного) цветового зрения — феномена, продемонстрированного в поведенческих экспериментах на бесхвостых амфибиях [5]. Для того чтобы оценить ряд параметров в работе каскада фототрансдукции, влияющих на чувствительность ЗП и КП бесхвостых амфибий, и провести сравнительный анализ, нами было проведено детальное электрофизиологическое исследование этих типов фоторецепторов.
Эксперименты были выполнены на изолированных фоторецепторах двух видов бесхвостых амфибий: озерных лягушек (Pelophylax ridibundus) и жаб-ага (Rhinella marina). Ток одиночных ЗП и КП регистрировали методом всасывающей микропипетки в камере, перфузируемой раствором Рингера, световая стимуляция производилась с помощью зеленого светодиода (Xmax = 525 нм). Дополнительно в начале протокола клетке предъявлялась яркая красная вспышка (Xmax = 630 нм), по наличию/отсутствию ответа на которую однозначно определяется тип палочки. Регистрировались ответы фоторецепторов на короткие (10 мс) вспышки или продолжительные (30 с) засветки разной интенсивности, а также выполнялись длительные темновые записи для оценки собственного шума клеток. Измерение спектров зрительных пигментов ЗП и КП проводилось с помощью поляризационного микроспектрофотометра. Суспензию фоторецепторов помещали между двумя покровными стеклами, после чего измеряли спектр отдельных клеток лучом света, поляризованного в плоскости, параллельной или перпендикулярной оси наружного сегмента.
Микроспектрофотометрические данные о поглощении зрительных пигментов исследуемых типов палочек позволили учесть различия в их перекрывании со спектром стимулирующего источника света и перейти к абсолютной оценке чувствительности фоторецепторов (в обесцвеченных молекулах зрительного пигмента на единицу объема клетки). Из зависимостей ответ-интенсивность для коротких вспышек следует, что по абсолютной чувствительности ЗП лягушки и жабы примерно в 1.5—2 раза превосходят КП. Анализ восходящей
фазы ненасыщенных фотоответов (прошкалированных с учетом абсолютной чувствительности) показал, что данная фаза ответов ЗП и КП практически совпадают. С другой стороны, кинетика выключения фотоответов ЗП оказалась заметно медленнее, чем у КП. Так, для озерной лягушки постоянная времени, рассчитанная с помощью экспоненциальной аппроксимации нисходящей фазы ответа, была в среднем в 1.5 раза больше у ЗП, чем у КП, а для жабы-аги — в 2.5 раза (см. Рис. 1). Таким образом, ЗП бесхвостых амфибий являются еще более специализированными рецепторами ночного зрения, чем КП. При этом усиление в каскаде фототрансдукции у двух типов палочек не различается, а повышенная чувствительность ЗП связана с более медленной кинетикой выключения и, как следствие, увеличенным временем интегрирования фотоответа.
Красная палочка Зеленая палочка
— Зеленая палочка (поправка на разницу в чувствительности
3 о m g 2-
Я О
t га 1 * S 1
i
¿I
■
кп
(П=в>
ЗГ (п=10)
КП (п=6|
ЗП (п=9)
Время, с
Озерная лягушка
Рис. 1. Анализ кинетики фотоответов ЗП и КП (А). Сравнение постоянных времени выключения каскада, характеризующих нисходящую фазу фотоответа (Б). * — статистически значимые различия по критерию Стьюдента с поправкой Уэлча, p<0.05.
Данные представлены в виде среднее ± ст. отклонение.
Среднюю частоту дискретных темновых событий определяли путем анализа гистограммы плотности вероятности тока, записанного в полной темноте [6]. Оказалось, что она имеет одинаковый порядок величины у двух типов палочек для обоих исследуемых видов. Этот результат согласуется с данными одной из предыдущих работ, выполненной на клетках жабы-аги [3], а также с данными анализа in vitro [2] и свидетельствует в пользу высокой специализации ЗП как рецепторов ночного зрения. Также анализ зависимостей ответ-интенсивность для длительных засветок показал, что ЗП и КП имеют широкую (до шести порядков) область перекрытия рабочих диапазонов интенсивности в скотопической области. Высо-
кая чувствительность ЗП дополнительно подтверждает их возможность функционировать совместно с КП, обеспечивая сумеречное цветовое зрение на основе палочек.
Работа выполнена в рамках государственного задания ИЭФБ РАН
№ 075—00408—21—00.
Список литературы:
1. Matthews G. Physiological characteristics of single green rod photoreceptors from toad retina. J. Physiol. 1983, 342, 347—359.
2. Kojima K, Matsutani Y, Yamashita T, Yanagawa M, Imamoto Y, Yama-no Y, Wada A, Hisatomi O, Nishikawa K, Sakurai K, Shichida Y. Adaptation of cone pigments found in green rods for scotopic vision through a single amino acid mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017, 114, 5437—5442.
3. Matthews G. Dark noise in the outer segment membrane current ofgreen rod photoreceptors from toad retina. J. Physiol. 1984, 349, 607—618.
4. Luo D. G., Yue W. W., Ala-Laurila P., Yau K. W. Activation of visual pigments by light and heat. Science. 2011, 332, 1307—1312.
5. Yovanovich C. A., Koskela S. M., Nevala N., Kondrashev S. L., Kel-ber A., Donner K. The dual rod system of amphibians supports colour discrimination at the absolute visual threshold. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2017, 372, 20160066.
6. Donner K., Firsov M. L., Govardovskii V. I. The frequency of isomer-ization-like 'dark'events in rhodopsin and porphyropsin rods of the bull-frog retina. J. Physiol. 1990, 428, 673—692.
ANALYSIS OF FUNCTIONAL DIFFERENCES BETWEEN ANURAN GREEN AND RED RODS
Rotov A.Yu., Astakhova L. A., Novoselov A. D., Ermolaeva M. E., Firsov M. L.
Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry RAS, Saint-Petersburg, Russia e-mail: rotovau@gmail.com
Abstract: Green rods are unique photoreceptor type in the amphibian retina. In this work, we have shown that they are even more specialized nocturnal receptors than the typical "red" rods, and their higher sensitivity to low light levels is related to slow turn-off kinetics and high visual pigment stability.
Key words: amphibians, green rods, red rods, visual pigments
