CC BY
42
АНАЛИЗ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ВОДОРОСЛИ CLORELLA PYRENOIDOSA S-39 С ПОМОЩЬЮ ИМПЕДАНСНЫХ ДИАГРАММ
Е.С. Озерова1, С.В. Константиновская2, Ю.Ф. Перов1, Л.Б. Братковская1, С.Е. Плеханов1
биологический факультет,
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова,
Воробьевы горы, 119899, Москва, Россия;
2Экологический факультет, Российский университет дружбы народов, Подольское шоссе, 8/5, 113093, Москва, Россия
Анализ электрических свойств клеток показал возможность использования полученных данных для оценки физиологического состояния развивающихся культур водоросли.
Для графического представления и анализа зависимости активного сопротивления R от реактивного X в широким диапазоне частот суспензий клеток водоросли Chlorella предлагается метод построения импедансных диаграмм в комплексной плоскости. Анализ электрических свойств клеточных суспензий позволил определить величину сопротивления внутреннего содержимого клетки ReH и сопротивления межклеточной среды RMK. Установлено, что действие 2,4 ДНФ и ПХФ-iVa на мембраны клеток водоросли сопровождается изменениями концентрации ионов как в межклеточной, так и во внутренней среде клетки. Показана двухфазность действия ПХФ-/Va-активация процессов ионного транспорта при 10"4 М, их ингибирование при 10_3 М и необратимые нарушения функционирования мембран при 10'3 М. Использование импедансных диаграмм позволяет оценивать функциональное состояние клеток водоросли путем измерения их электрических свойств в широком диапазоне частот в норме, при воздействии химических загрязнителей и определения механизмов их действия.
Измерение электрических свойств суспензий клеток в широком диапазоне частот, или электроспектроскопия, позволяет изучать и контролировать те изменения, которые происходят в процессе развития культур или действия повреждающих факторов в реальном масштабе времени и без нарушения интактности клеток. При этом соответствующие методы анализа экспериментальных данных открывают возможность получения информации, позволяющей объективно и с высокой точностью оценивать функциональное состояние клеток.
В первую очередь к таким методам анализа следует отнести предложенный К. Cole: представление электрических параметров биологических объектов путем построения их активной (R) и реактивной (X) составляющих в комплексной плоскости или в виде импедансной диаграммы [1]. Этот методический прием, который в настоящее время значительно усложнился [2], успешно используется при разработке биосенсоров и других инструментальных средств исследования и контроля за состоянием окружающей среды и биологических объектов [3, 4]. Ранее нами были изучены электрические свойства суспензии клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa S-39 в экспоненциальную фазу роста в диапазоне частот от 103 д0 ю7 Гц, где в области частот 5><105-107 Гц установлена /3-дисперсия [5]. Можно полагать, что привлечение к анализу полученных результатов метода построения импедансных диаграмм по К. Cole позволит существенно расширить
информативные возможости экспериментальных данных по электрическим параметрам клеток водоросли Chlorella.
Материал и методика. В качестве объекта исследования использовали ак-сеничную культуру водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick, штамм DMMSU S-39. Культуру С. pyrenoidosa выращивали накопительным методом на среде Тамия в культуральных сосудах с 250 мл среды при температуре 37°С и непрерывном освещении 40 Вт/м2 лампами ЛБ-80. Измерения электрических свойств суспензии клеток водоросли Chlorella на 7-е сутки культивирования проводились на установке по ранее описанной методике [5]. В экспериментах использовались 2,4 динитрофенол (2,4 ДНФ; «Cerva») и натриевая соль пентахлорфенола — (ПХФ-УУд; «Мегск»), которые вносились в культуральную среду в концентрациях 10~4 М (2,4 ДНФ) и 10 2, 10'3 и 10~4 М (ПХФ-УУй) после 2-го отмыва (из 3-х) клеток водоросли раствором холинхлорида в концентрации, эквимолярной среде культивирования.
Результаты и обсуждение. При анализе электрических параметров биологических объектов принято использовать эквивалентные электрические схемы различной степени сложности, отражающие характер частотных зависимостей электрических свойств в iiiироком диапазоне частот. При этом предполагается, что окружающая среда и внутреннее содержимое клетки обладают электрической проводимостью и емкостью. Наиболее простые эквивалентные электрические схемы состоят из активного сопротивления R и емкости С, которые соединены или последовательно (Rpj Ср), или параллельно (Ду, Q) [6]. Однако такие схемы являются упрощенными и не способны в достаточной степени отражать электрические параметры биологических объектов в широком диапазоне частот.
В связи с этим правильнее использовать эквивалентную электрическую схему, которая более полно соответствует электрическим параметрам суспензии клеток, состоящую из комбинации последовательного и параллельного
соединений активных сопротивлений и емкости (рис.1).
О
R
мк
1
J
R
М
R
ви
т
Рис. 1. Эквивалентная электрическая схема суспензии клеток: Я,, и См- соответственно активное сопротивление и емкость клеточной мембраны; ЛМК — активное сопротивление межклеточной среды; — активное сопротивление внутреннего содержимого клетки.
Применение такой эквивалентной схемы с минимальным числом однозначно связанных между собой элементов позволяет без сложных математических расчетов по величине одной из составляющих определять величины других. В этой эквивалентной схеме клеточная мембрана представлена параллельным соединением активного сопротивления Ям и емкости См, а сопротивлениями межклеточной среды и внутреннего содержимого клетки соответственно являются Ямк и Явн [6]. Наличие в эквивалентной схеме активного сопротивления Ям, включенного параллельно емкости клеточной мембраны См, изначально предполагает, что мембрана помимо емкости обладает и электрической проводимостью.
Анализ частотной зависимости эквивалентной схемы показывает, что часть переменного тока проходит по межклеточной среде, тогда как другая часть — через мембрану и внутреннюю среду клетки. Отношение величин этих токов проявляет значительную зависимость от частоты благодаря наличию у клеточной мембраны емкости См.
Общее сопротивление на переменном токе или импеданс представленной на рис. 1 эквивалентной схемы 2ЭК может быть выражен в следующем виде:
7 +%м) ,п
ж п п „ д и
К, + К, + 7-
где Zм — импеданс клеточной мембраны равный:
. (2)
В выражении (2) Хм — реактивное сопротивление мембраны;
®С„
где со = 2я/~; / — частота, на которой проводится измерение электрических свойств.
Величина емкости См не зависит от частоты и для мембран различных биологических объектов имеет стабильную величину ~ 1,0 мкФ/см2, тогда как реактивное сопротивление мембраны Хм проявляет частотную зависимость. Активные сопротивления Ямк и Ят не зависят от частоты, однако их значения отражают функциональное состояние как самой клетки с ее внутренним содержимым, так и внешней мембраны. Т^к, величина сопротивления Ям зависит от уровня проницаемости мембраны клетки и в первую очередь для ионов, тогда как Ямк определяется концентрацией ионов в межклеточной среде.
При экстраполяции импеданса эквивалентной электрической схемы (рис. 1) в область крайне низких частот (м -*■ 0) реактивное сопротивление клеточной мембраны Хм очень велико {Хы —» «з) и им можно пренебречь. Поскольку величина активного сопротивления мембраны Ям в низкочастотной области значительно выше, чем сопротивления межклеточной среды Ямк и внутреннего содержимого клетки Лвн, то измеренное на этих частотах сопротивление Я0 будет определяться преимущественно Ямк, т.е. Я0=ЯМК. В случае высоких частот (со —» со) реактивное сопротивление клеточной мембраны стремится к своему минимальному значению (Хм —* 0), и оно шунтирует активное сопротивление клеточной мембраны Ям, в результате чего величина сопротив-
ления Ryj будет определяться соотношением сопротивлений RMK и /?вн. В отсутствии шунтирования, т.е. при низкой электрической проводимости межклеточной среды (большое значение сопротивления RMK), величина Д., будет равна сопротивлению внутреннего содержимого клетки Rm.
Для графического представления зависимости активного сопротивления R от реактивного X в широком диапазоне частот используется предложенный К. Cole способ построения в комплексной плоскости, или импедансной диаграммы, в которой параметром является частота [1]. Если для различных частот, на которых проводилось измерений электрических параметров клеточной суспензии, отложить значения X по оси ординат, а значения R по оси абсцисс, то полученный результирующий график будет иметь форму полуокружности с центром, смещенным относительно оси абсцисс (рис.2).
Рис. 2. Комплексная импедансная диаграмма по К. Cole
Наибольшее значение X на полуокружности соответствует характеристической частоте fM (для исследуемой суспензии клеток), на которой наблюдается максимальная дисперсия ее электрических параметров. Полученная полуокружность пересекает ось абсцисс (активного сопротивления R) в точках R0 и Дс, что дает возможность использовать построенную импедансную диаграмму для определения электрических параметров суспензии клеток по ее элементам в эквивалентной электрической схеме.
В электрохимии подобный метод анализа был предложен J.H. Sluyters с сотр. для изучения обратимости протекающих на электродах реакций путем измерения электродного импеданса при прохождении переменного электрического тока [6,7]. В том случае, когда реакция полностью обратима, т.е. происходит перенос зарядов через границу раздела сред, или, применительно к биологическим мембранам, когда они обладают полной проницаемостью, график частотной зависимости X от R представляет собой прямую линию с наклоном 45° относительно оси абсцисс. При полностью необратимой реакции или, когда мембраны клеток полностью непроницаемы, график частотной зависимости X от R имеет вид полуокружности с центром, лежащим на оси абсцисс. В суспензиях нативных клеток, мембраны которых обладают избирательной проницаемостью в результате функционирования механизмов активного и пассивного транспорта, перенос через мембрану ионов отражается в понижении центра полуокружности относительно оси абсцисс (рис. 2). В связи с этим, угол <р, образованный прямой, проведенной через центр полуокружности и точку ее пересечения с осью абсцисс (точка Rm), и перпендикуля-
ром, опущенным из центра на эту ось из точки является характеристикой уровня функционирования транспортных процессов (активных и пассивных) через мембрану клетки и представляет собой фазовый угол мембраны <р [8]. Для того, чтобы охарактеризовать проницаемость (проводимость) клеточной мембраны, выражающуюся в виде снижения центра полуокружности, используется безразмерный параметр частотной характеристики мембраны а, (а = Ър/п), который является дополнительным критерием ее состояния и определяется характером распределения процессов релаксации на мембране, то есть связан с процессами транспорта зарядов. В том случае, когда а = 1, электрические свойства мембраны (импеданс) определяются исключительно ее емкостью, а при а < 1 в мембране присутствует проводимость (активное сопротивление).
Таким образом, анализ электрических свойств клеточных суспензий с помощью импедансных диаграмм в комплексной плоскости позволяет, исходя из полученных экспериментально значений сопротивления и емкости СЛ по точкам пересечения полуокружности с осью абсцисс определить величину сопротивления внутреннего содержимого клетки /?ви и сопротивления межклеточной среды /?мк.
Построение импедансной диаграммы на основе экспериментальных данных осуществляется, следующим образом. Значения сопротивления и емкости С5 суспензии клеток, полученные при измерениях на переменном токе в параллельной эквивалентной схеме, пересчитываются в последовательную схему по формулам:
О =,_____^______,г _1 + Р2Д,2С,2 = 1
1+согс;я: " со1 я; с; ' «с
п
где Яр> Ср, Хр соответственно активное сопротивление, емкость и реактивное сопротивление суспензии клеток в последовательной эквивалентной схеме.
Затем по оси ординат откладывают значения реактивного сопротивления суспензии клеток А'р, а по оси абсцисс — значения активного сопротивления Яр на всех тех частотах, на которых проводились измерения. Геометрическое место точек всех этих значений образует полуокружность, пересекающую ось
абсцисс в двух точках, одна из которых Ях ~Явн> другая — Я0=ЯМК, а центр полуокружности смещен ниже относительно оси абсцисс (рис. 2) и образует с ней фазовый угол (р. Максимальное значение реактивного сопротивления Хр соответствует частоте /ы, при которой наблюдается максимальная дисперсия электрических параметров исследуемой суспензии клеток водоросли.
В первой группе экспериментов были выполнены измерения электрических свойств суспензии клеток водоросли при внесении в культуральную среду 2,4 ДНФ в концентрации 10~4 М. Комплексная импедансная диаграмма, построенная по результатам измерений, представленная на рис.З, показывает, что влияние 2,4 ДНФ сказалось в снижении, по сравнению с интактными клетками, величины как сопротивления межклеточной среды Ямк, так и внутреннего содержимого клеток Явн. Так, сопротивление межклеточной среды Ямк уменьшилось со 157 Ом у интактных клеток до 127 Ом, а сопротивление внутреннего содержимого клеток Явн снизилось со 128 Ом (интактные клетки) до 75 Ом. Эти изменения сопровождались смещением центра полуокружности импедансной диаграммы вниз относительно оси абсцисс — величина фазового угла <р уменьшилась с 80° до 75°, что ука-
зывает на изменение характеристик транспорта на мембране и соответствующие изменения как /?мх , так и Лвн
2,4 ДНФ, 7 сутки
о - контроль п -10* М »- 1СГ1 М
Рис. 3. Комплексные импедансные диаграммы суспензии клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick S-39 (7-е сутки культивирования): 1 - интктные клетки, 2 — клетки в присутствии в среде 10'4 М 2,4 ДНФ
Несколько иной характер изменения отмечался при внесении в культуральную среду nXO-iVa в концентрациях 10-2, 10_3 и 10~4 М (рис.4). Так, ПХФ-Л^ в концентрациях 10~3 и 10-4 М вызывал по сравнению с интактными клетками изменение только величины сопротивления межклеточной среды RMK, а сопротивление внутреннего содержимого клеток Rm оставалось неизменным. Вместе с тем, ПХФ-iVa в концентрации 1СИ М приводил к повышению величины сопротивления межклеточной среды RMK - с 250 Ом у интактных клеток до 280 Ом у опытных и только в большей концентрации (10‘3 М) величина 7?мк снизилась до 220 Ом.
Рис. 4. Комплексные импедансные диаграммы суспензии клеток водоросли Chlorella pyrenoidosa Chick S-39 (7-е сутки культивирования): 1 - интактные клетки, 2 - клетки в присутствии в среде 1(И М ПХФ-TVe; 3 - клетки в присутствии в среде 10‘3 М ПХФ-А'а; 4 - клетки в присутствии в среде 10"2 М Г1ХФ-/Уй
Следует отметить, что только при концентрации ПХФ-Na в среде, составлявшей 10~3 М, отмечалось уменьшение фазового угла мембраны до 73°, тогда как при 10-4 М его величина не отличалась от величины для суспензии интактных клеток. При дальнейшем увеличении концентрации ПХФ-jVa в культуральной среде (до 10~2 М) отмечалось резкое снижение величины сопротивления межклеточной среды RMк до 90 Ом, а сопротивление внутреннего содержимого клеткок RBH стало меньше 40 Ом (рис. 4). Центр полуокружности импедансной диаграммы еще в большей степени сместился вниз относительно оси абсцисс, что привело к уменьшению величины фазового угла мембраны до 55°.
Механизм действия таких разобщителей, как 2,4 ДНФ и ПХФ-Мз на биологические мембраны с точки зрения их электрических свойств по P. Mitchell, сводится к повышению их электрической проводимости, что впоследствии было подтверждено исследованиями на искусственных фосфолипидных мембранах, выполненных в лабораториях Е. Либермана и A.L. Lehninger [10, 11]. Как установлено экспериментально, эффективность действия 2,4 ДНФ и ПХФ-TVa на мембраны клеток водоросли можно успешно оценить при измерении их электрических свойств с использованием метода построения комплексных импедансных диаграмм, позволяющего однозначно определить характер изменения проницаемости мембран клеток, которые сопровождаются изменениями концентрации ионов как в межклеточной, так и во внутренней среде клетки. Кроме того, выполненный анализ показал характерную для многих разобщителей двухфазность действия [12], выявленную при использовании ПХФ-Na в различных концентрациях (рис. 4) — активация процессов ионного транспорта при 10-4 М, их ингибирование при 10~3 М и необратимые нарушения функционирования мембран при 10_3 М.
Таким образом, использование метода построения импедансных диаграмм в комплексной плоскости позволяет значительно повысить информативность метода оценки функционального состояния клеток водоросли С. pyrenoidosa путем измерения их электрических свойств в широком диапазоне частот и открывает новые возможности для биотестирования химических загрязнителей окружающей среды или определения механизмов их действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cole K.S. Membranes, Ions and Impulses. — Berkely and Los Angeles, Univ. of California Press, 1968.
2. Кем Д.Б. Изучение электрического импеданса. Принципы и возможности спектроскопии электрического адмиттанса // Биосенсоры: основы и приложения: Пер. с англ. / Под ред. Э. Тернера, И. Краубе, Дж. Уилсона. — М.: Мир, 1992. —С. 344-374.
3. Grimnes S., Martinsen I.G. Bioimpedance and Bioelectricity Basics. — New York: Aca-
demic, 2000.
4. Grimnes S., Martinsen I.G. Cole electrical impedance model — a critique and an alternative // IEEE Trans. Biomed. Eng. 2005. — Vol.52, N.I. — P. 132-155.
5. Озерова E.C., Константиновская С.В., Перов Ю.Ф., Плеханов С.Е. Электрические свойства клеток водоросли Clorella pyrenoidosa // Вестн. РУДН. Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности — 2004.
6. Шван Г. Спектроскопия биологических веществ в поле переменного тока // Электроника и кибернетика в биологии и медицине. - М.: Изд-во Иностранной литературы, 1963. — С. 71-108.
7. Sluyters J.H. On the impedance of galvanic cell. I. Theory // Rec. trav. chim. — 1960. -Vol.79, N.8. - P. 1092-1100.
8. Renbach М., Sluyters J.H. On the impedance of galvanic cell. IV. Determination of the rate constants of rapid electrode reaction from electrode impedance measurements // Ibid. - 1962. - Vol.81, N.4. - P. 301-306.
9. Cole K.S. Electric phase angle of cell membranes // J. Gen. Physiol. — 1932. — Vol. 15, N. 6. - P. 641-649.
10. Либерман E.A. Переносчики ионов через биологические мембраны // Биологические мембраны. - М.: Медицина, 1973. — С. 48-66.
11. Bielawsky Thompson Т.Е., Lehninger A.L. The effect of 2,4-dinitrophenol on the electrical resistance of phospholipid bilayer membrane // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1966. — Vol.24. N. 6.— P. 943 —947.
12. Pentachlorophenol / Environmental Health Criteria; 71. — World Health Organization, Geneva, 1987.
THE ANALYSIS OF ELECTRICAL PROPERTIES OF THE SEAWEED CELLS CHLORELLA PYRENOIDOSA S-39
E.S. Ozerova1, S.V. Konstantinovskaja2, Yu.F. Perov1,
I.F. Bratkovskaya1, S.E. Plehanov1
]M. V. Lomonosov Moscow State University,
Vorob’ovi gori, 119899, Moscow, Russia 2Ecological Faculty, Russian Peoples ’ Friendship University,
Podolskoye shosse, 8/5, 113093, Moscow, Russia
The analysis of electric properties of cells has shown an opportunity of use of the received data for an estimation of a physiological condition of developing cultures seaweed.
