CC BY
78
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616-006.81.04-031.13-07
Митин А.Н.1, Литвина М.М.1, Митина Т.А2, Голенков А.К.2,
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЫ FOXP3 И ЕЕ ИЗОФОРМ CD4+ Т-КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ТЕЧЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
1ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва, Российская Федерация; 2ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, 129110, г. Москва, Российская Федерация
В работе методом проточной цитометрии проведена оценка экспрессии молекулы FOXP3 и ее изоформ CD4+ Т-клетками периферической крови у пациентов с различными формами течения множественной миеломы (ММ). Показано, что экспрессия молекулы FOXP3 CD4+ Т-лимфоцитами играет важную роль в патогенезе ММ. Так, у первичных и резистентных пациентов с ММ отмечено увеличение процента CD4+ Т-клеток, экспрессирующих FOXP3. Основной вклад в увеличение этого процента вносили клетки, которые экспрессировали изоформу FOXP3, лишенную экзона 2 (FOXP3A2). У первичных пациентов, помимо увеличения данного процента, увеличивалось и абсолютное количество всех CD4+FOXP3+ Т-клеток. Уровень экспрессии FOXP3CD4+ Т-клетками также отражал эффективность проводимой противоопухолевой терапии у пациентов с ММ ввиду нормализации и количества, и процента CD4+FOXP3+ Т-лимфоцитов, а соответственно и регуляторных Т-клеток (Treg) при ремиссии заболевания. Обсуждена возможная связь посттранскрипционной модификации мРНК FOXP3, а именно альтернативного сплайсинга, со стабильностью экспрессии FOXP3 Treg.
Ключевые слова: FOXP3; изоформы; регуляторные Т-клетки человека; множественная миелома; проточная цитометрия.
Mitin A.N.1, Litvina MM.1, Mitina T.A.2, Golenkov A.K.2, \Yarilin A.A.1]
FLOW CYTOMETRY ANALYSIS OF FOXP3 AND ITS ISOFORMS EXPRESSION BY CD4+ T CELLS FROM PERIPHERAL BLOOD IN VARIOUS FORMS OF MULTIPLE MYELOMA
'National Research Centre «Institute of Immunology» FMBA of Russia, 115478, Moscow , Russian Federation; 2Moscow regional research clinical institute named after M.F. Vladimirsky, 129110, Moscow, Russian Federation In this study we have assessed FOXP3 and its isoforms expression by CD4+ T cells from peripheral blood of patients with various forms of multiple myeloma (MM). Significant role of FOXP3 expression by CD4+ T lymphocytes in pathogenesis of MM was shown. Thus, increase of FOXP3-expressing cells percent among CD4+ T cells is registered in patients with newly diagnosed MM and in resistant/relapsed patients. The main contribution to this percent increment is made by FOXP3A2 isoform expressing cells. In addition to the percent increment the number of CD4+FOXP3+ T cells is also risen in patients with newly diagnosed MM. The level of FOXP3 expression by CD4+ T cells also reflects the effectiveness of antitumor therapy, considering normalization of CD4+FOXP3+ T cells number and percent in patients with disease remission. We also discuss the possible relationship between FOXP3 mRNA post-transcriptional modification, namely alternative splicing, with stable expression of FOXP3 in Tregs.
Key words: FOXP3; isoforms; human regulatory T cells; multiple myeloma; flow cytometry.
ярилин А.А.1
Множественная миелома (ММ) - злокачественное заболевание системы крови, связанное с накоплением в костном мозге зрелых плазматических клеток и сопровождающееся разрушением костной ткани и нарушением нормального ге-мопоэза. Некоторые исследователи обнаружили повышенное количество регуляторных Т-клеток (Treg) в периферической крови и костном мозге у пациентов с ММ [1, 2] и даже выявлена связь с течением заболевания [3].
Ранее описаны как CD4+CD25hi Т-лимфоциты [4, 5]. Позже установлена их связь с транскрипционным фактором FOXP3, который, являясь основным регулятором дифферен-цировки и функционирования Т^, стал лучшим молекулярным индикатором этих клеток [6]. У мышей дифферен-цировка Т^ однозначно связана с экспрессией гена FOXP3, причем нокаут этого гена приводит к утрате этих клеток, а повышенная экспрессия вследствие трансфекции гена в Т-клетки - к приобретению ими супрессорной активности и фенотипа [7, 8]. У человека взаимосвязь между активностью FOXP3 и дифференцировкой не столь однозначна: экспрессия FOXP3 является необходимым, но не достаточ-
Для корреспонденции: Митин Александр Николаевич, e-mail: mitin@inbox.ru
For correspondence: Mitin Alexandr Nikolaevich, e-mail:mitm@mbox.ru
ным условием дифференцировки этих клеток [9, 10]. Так, например, экспрессия FOXP3 определяется в недавно активированных наивных CD25-CD4+ Т-клетках и соответственно не может расцениваться как абсолютный индикатор Treg у человека [11-13].
При изучении молекулярной структуры установлено, что у мышей фактор FOXP3 существует в единственной форме, а у человека описано по крайней мере четыре изоформы данной молекулы, одна из которых является полномасштабной, а три другие формируются в результате альтернативного сплайсинга с делецией отдельно экзонов 2, 7 или одновременно 2 и 7 [8, 14-16]. Экзон 2 кодирует домен молекулы FOXP3, ответственной за связывание транскрипционных факторов семейства ROR - а и у. Одна из функций этих факторов - индукция дифференцировки ТЫ7-клеток [17, 18]. Экзон 7 кодирует последовательность, ответственную за ди-меризацию молекулы [16].
Еще одной особенностью молекул FOXP3 с делецией продуктов экзонов 2 и 7 в отличие от полномасштабной молекулы является их преимущественная локализация внутри ядра вследствие утери одной из двух последовательностей, отвечающих за экспорт из ядра (nuclear export sequences -NESs), расположенных в областях, кодируемых экзонами 1/2 и 6/7 соответственно [19]. В этой же работе показано, что при активации наивных CD25-CD4+ Т-клеток экспрессия FOXP3 определяется в основном в цитоплазме в отличие от преиму-
1-fiQ
РСН101
-inR.-IQn
опп.ооч
150D/E4
F J К-16s
236А/Е7 eBio7979
Клоны MAT
Рис. 1. Схема молекулы FOXP3, локализации в нем доменов и сайтов связывания различных МАТ к молекуле FOXP3 человека [24 и сайт http://www.ebioscience.com/].
Под участками молекулы FOXP3 даны характеристики доменов и названия клонов МАТ, с которыми они связываются. PR (Prolin-rich) - домен, богатый пролином; r0r (Retimoid-like orphan receptor) - семейство транскрипционных факторов; HDAC - деацетилаза гистонов; ZF (Zink finger -«цинковые пальцы») - домен; LZ (Leucin zipper - «лейциновая застежка») - домен, ответственный за димеризацию; FOX (Forkhead box - «вильчатая голова») - домен, ответственный за основную функцию FOXP3 как транскрипционного фактора Treg.
щественной локализации внутри ядра у CD25+CD4+ Treg. С точки зрения функционирования FOXP3 в качестве транскрипционного активатора и супрессора [20] представляется весьма важным его нахождение внутри ядра.
Исходя из вышеизложенного, а также имея опыт работы с методикой цитометрического определения экспрессии изо-форм молекулы FOXP3, содержащих продукт экзона 2 и лишенных его, с помощью коммерческих моноклональных антител фирмы еВ^мепсе (США), специфически распознающих продукты экзонов 1 и 2 [21], мы посчитали весьма интересным и важным оценить экспрессию изоформ у пациентов с различным течением ММ методом проточной цитомерии.
Материалы и методы
В исследование включили 37 пациентов в возрасте от 46 до 75 лет (средний возраст 58 лет) с III стадией ММ и 15 здоровых доноров в возрасте от 33 до 55 лет (средний воз-
раст 46 лет) в качестве контроля. Основываясь на критериях оценки противоопухолевого ответа по B. Durei и соавт. [22], пациентов разделили на 3 группы: первичные пациенты (n = 17), пациенты в ремиссии (n = 7) и резистентные/рецидивные пациенты (n = 13). Все больные перед исследованием подписали информированное согласие на его проведение.
Забор периферической крови производили в пробирки с антикоагулянтом. Выделение мононуклеров периферической крови (МНПК) и последующий анализ проводили в течение последующих 6 ч. Подсчет клеток осуществляли по общепринятой методике. МНПК выделяли на градиенте концентрации. Клетки суспендировали в PBS с 1% BSA и 0,1% NaN затем инкубировали с моноклональными антителами (МАТ) к поверхностным маркерам в том же буфере в течение 30 мин при 4°С, после чего клетки отмывали и пермеабилизи-ровали в течение 40 мин буфером фирмы eBioscience (США) («Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer») согласно ее мето-
Рис. 2. Алгоритм определения количества клеток, экспрессирующих молекулы РОХР3 (на примере мононуклеаров крови резистентного пациента с ММ).
На графиках типа «дот-плот» по осям отражена интенсивность свечения флюорохрома, соответствующего исследуемому маркеру. Сами клетки представлены в виде точек.
а - анализ уровня лимфоцитов по экспрессии маркеров СБ3 и СБ4; выделяются клетки правого верхнего квадранта с фенотипом СБ3+4+; б - разделение СБ4+ Т-клетки по экспрессии маркеров СБ25 и БОХР3 на СБ3+4+25+РОХР3+ (правый верхний квадрант) и СБ3+4+25"РОХР3+ (левый верхний квадрант); в - анализ уровня СБ4+ Т-клеток по экспрессии изоформ РОХР3, выявляемой при одновременном использовании МАТ клонов РСН101 и 150Б/Е4; в левом верхнем квадранте - СБ3+4+РОХР3А2+-клетки, в правом верхнем квадранте - СБ3+4+РЬ"РОХР3+-клетки; РСН101 и 150Б/Е4 - гибри-домные клоны, продуцирующие МАТ против РОХР3 (см. "Материалы и методы").
Изменение численности (в млн/л) исследованных субпопуляций лимфоцитов из периферической крови доноров и пациентов с различным течением ММ
Группа пациентов Квартиль Лимфоциты CD3+4+ CD3+4+25+FOXP3+ CD3+4+25-FOXP3+
Доноры (контроль) H 1323,0 1518,0 557,8 660,7 18,6 22,9 5,1 6,3
L 1224,0 485,7 15,9 2,3
Первичные H 2047,8* 2776,1 795,5* 1095,6 51,4* 58,7 19,3* 29,0
L 1935,6 638,1 25,0 11,5
Ремиссия H 1260,0 1505,5 485,8 657,7 19,8 25,8 6,0 9,0
L 1072,0 373,3 10,6 3,3
Резистентные H 1368,3 1756,8 446,5 696,9 16,7 28,6 9,3 16,2
L 787,5 199,8 8,9 5,5
Примечание. * - p < 0,05.
дическим указаниям. Затем клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при при 4°С в темноте с МАТ к FOXP3, снова отмывали и сразу без фиксации анализировали на проточном цитометре. Учитывая минорность фракции Treg, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.
Использовали МАТ, меченные различными флюоро-хромами: FITC (флюоресцеина изотиоцианат), PE (фи-коэритрин), APC (алофикоцианин), PerCP-eFluor710 (перидинин-хлорофилл-протеин^1иог710) и PE-Cy7 (фикоэритрин-цианин7). Использовали следующие комбинации МАТ фирмы eBioscience (США) (препараты для изоти-пических контролей той же фирмы):
1. CD3-PE-Cy7 + CD4-FITC + CD25-PerCP-eFluor710 + F0XP3(PCH101)-APC;
2. CD3-PE-Cy7 + CD4-FITC + F0XP3(PCH101)-APC + F0XP3(150D/E4)-PE.
МАТ клона PCH101 специфичны к продукту экзона 1 молекулы FOXP3 и выявляют все изоформы, а 150D/E4 - к продукту экзона 2 молекулы FOXP3 (рис. 1). При сочетании данных МАТ их одновременное связывание с клеткой указывает на экспрессию целой молекулы FOXP3, а при связывании только МАТ PCH101 - на экспрессию изоформы FOXP3 с делецией продукта экзона 2.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде
Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали ^-критерий Манна-Уитни. Различие показателей в группах полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel.
результаты и обсуждение
Перед началом исследования мы поставили перед собой задачу оценить количество и процент Treg при различных формах течения ММ, а также экспрессию в этих клетках изоформ FOXP3, содержащих продукт экзона 2 (FL-FOXP3 - full length), и с делецией экзона 2 (FOXP3A2). В связи с этим мы выбрали алгоритм анализа цитометрических данных, представленный на рис. 2. По уровню прямого и бокового светорассеяния определяли гейт лимфоцитов (данные на рис. 2 не представлены). Среди лимфоцитов по экспрессии CD3 и CD4 выделяли гейт CD3+4+-лимфоцитов (см. правый верхний квадрант на рис. 2, а). Далее проводили анализ уровня CD3+4+-клеток, представленный на двух следующих графиках типа «дот-плот» (рис. 2, б, в). На рис. 2, б - определение клеток с фенотипом CD3+4+25+FOXP3+ (правый верхний квадрант) и CD3+4+25-FOXP3+ (левый верхний квадрант). На рис. 2, в - экспрессия FOXP3, выявляемая при одновременном использовании МАТ клонов PCH101 и 150D/ E4. Клетки c экспрессией FOXP3, выявляемых только МАТ клона PCH101 (левый верхний квадрант), расценивали как
70 60 50 40 30 20 10 0
Т
CD34+FOXP3+CD25+
CD3+4+25"FOXP3+
ЮЛ Доноры Первичные пациенты с ММ
Ремиссия ММ Резистентные пациенты с ММ
и
I Т
CD25+FOXP3+
Доноры Ремиссия ММ
CD25 FOXP3 Первичные пациенты с ММ Резистентные пациенты с ММ
Рис. 3. Изменение количества СЭ4+25+Р0ХР3+- и СЭ4+25Т0ХР3+-клеток при различных формах течения ММ.
По оси абсцисс - фенотипическая характеристика исследуемых субпопуляций; по оси ординат - количество клеток (в млн/л) (Ме (Ь—И)). Здесь и на рис. 4, 5: * -р < 0,05 относительно показателей в контроле.
Рис. 4. Изменение процента СЭ25+Р0ХР3+- и СЭ25-Р0ХР3+-клеток среди СЭ4+ Т-лимфоцитов при различных формах течения ММ. По оси абсцисс - фенотипическая характеристика исследуемых субпопуляций; по оси ординат - процент клеток исследуемой субпопуляции относительно такового СБ4+ Т-клеток (Ме (Ь—И)).
50 -| 45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 -0 -
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 О
С04+Р1_~ РОХРЗ+
С04"ГОХРЗЛ2+
С04+р[Г РОХРЗ+
Е88&81 Доноры
Ремиссия ММ
С04+РОХРЗА2+
Первичные пациенты с ММ Резистентные пациенты с ММ
Рис. 5. Изменение количества Treg, экспрессирующих FL-FOXP3 и FOXP3A2 при различных формах течения ММ.
По оси абсцисс - фенотипическая характеристика исследуемых субпопуляций; по оси ординат: а - количество клеток (в млн/л) (Ме (Ь-Щ); б - процент клеток исследуемой субпопуляции относительно такового CD4+-Т-клеток (Ме (Ь-Щ)).
СВ3+4+РОХР3Д2+-клетки, а клетки с экспрессией РОХР3, выявляемых одновременно МАТ клонов РСН101 и 1500/Е4 (правый верхний квадрант), - как СВ3+4+П-РОХР3+-клетки.
Начиная исследование образцов крови с подсчета количества клеток, мы выявили достоверное повышение уровня лимфоцитов у первичных пациентов до 2,05 • 109/л против 1,32 • 109/л у здоровых доноров, сопровождающееся значимым увеличением количества СБ4+-Т-клеток до 0,8 • 109/л против 0,56 • 109/л у доноров (см. таблицу). Достоверных различий этих показателей у резистентных больных и пациентов в ремиссии не обнаружили.
При определении содержания Тге§ по экспрессии РОХР3 и СБ25 (см. таблицу, рис. 3) у первичных пациентов с ММ обнаружили достоверное увеличение количества как СБ25+ (в 2,76 раза), так и СБ25- (в 3,78 раза) субпопуляций СБ4+РОХР3+-Т-клеток по сравнению с таковым в контрольной группе. У резистентных пациентов, несмотря на отсутствие Т-лимфоцитоза, абсолютное количество лимфоцитов с фенотипом СВ3+4+25-РОХР3+ было также повышено в 1,82 раза по сравнению с таковым у доноров, но данное увеличение не являлось статистически достоверным. Пациенты, находящиеся в ремиссии, демонстрировали абсолютное количество Тге§, идентичное показателям у здоровых людей.
При анализе относительных показателей (рис. 4) выявили статистически значимое по сравнению с таковым у доноров повышение процента СБ25+ГОХР3+- и СВ25-РОХР3+-клеток среди СБ3+4+ лимфоцитов у первичных пациентов с ММ (5 и 2,5% соответственно). Таким образом, рост абсолютного количества РОХР3+-клеток у этой группы был обусловлен не только Т-лимфоцитозом, но и увеличением относительного количества этих клеток внутри субпопуляции СБ4+ Т-лимфоцитов. Данные показатели у пациентов с ремиссией заболевания и здоровых людей практически совпадали
- 3,5% СБ25+РОХР3+- и около 1% СБ25-РОХР3+-клеток от общего количества СБ3+4+-лимфоцитов. Весьма интересными оказались относительные показатели экспрессии РОХР3 в СБ3+4+-лимфоцитах у пациентов с ММ, резистентных к проводимому лечению, они были повышены, причем увеличение процента СБ25-РОХР3+-клеток от общего количества СБ3+4+-лимфоцитов было статистически достоверным и равнялось соответствующему показателю у первичных пациентов (2,5%). Расценивая СБ4+25+ГОХР3+-Т-лимфоциты как субпопуляцию, состоящую из Тге§ и активированных наивных СЙ4+-Т-клеток, а СБ4+25-РОХР3+-Т-лимфоциты как уже прошедшую через активацию фракцию нерегуляторных СБ4+ Т-клеток с остаточной экспрессией РОХР3, по результатам анализа при одновременном определении экспрессии СБ25 и РОХР3 можно косвенно судить об активности иммунного ответа при ММ или на саму опухоль, или сопутствующую ей инфекцию, а также об эффективности проводимой терапии, что особенно важно при разработке новых схем лечения [23].
Следующим этапом исследования была оценка экспрессии изоформ П-РОХР3 и РОХР3А2 СБ4+ Т-лимфоцитами. Результаты анализа этих данных позволили несколько по-иному взглянуть на роль РОХР3 при ММ. У первичных пациентов с ММ увеличено абсолютное количество клеток, экспрессирующих обе изоформы молекулы РОХР3, по сравнению с таковым у доноров, СВ3+4+Г1-РОХР3+-клеток - в 2 раза, СБ3+4+РОХР3А2+-клеток - в 2,4 раза (рис. 5, а). Но только увеличение количества клеток, экспрессирующих РОХР3А2, оказалось статистически значимым. Достоверных различий в количестве клеток, экспрессирующих как П-РОХР3, так и РОХР3А2, у пациентов в ремиссии и резистентных пациентов в сравнении его у доноров не отметили.
Анализируя относительные показатели экспрессии изоформ РОХР3 при различных формах течения ММ, выявили (рис. 5, б), что процент СБ4+ Т-клеток, экспрессирующих РОХР3А2, повышен во всех группах пациентов с ММ по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц, приближаясь к 5% от всех СБ3+4+-клеток и примерно в 2 раза превосходя показатели у доноров. Однако у пациентов с ремиссией заболевания это повышение не являлось статистически достоверным, что, возможно, обусловлено низкой выборкой (всего 7 больных) и большим разбросом полученных данных. Повышение же процента П-РОХР3+-клеток среди СБ3+4+-клеток отметили только у первичных и резистентных пациентов, что не являлось достоверным.
Сопоставляя литературные данные о преимущественной локализации коротких изоформ РОХР3 внутри ядра [19], экспрессии РОХР3 активированными нерегуляторны-ми Т-клетками в основном в цитоплазме [19] и достаточно быстрой элиминации этими клетками транскрипционного фактора по окончании активации, а также полученные нами ранее данные об увеличении относительной экспрессии РОХР3А2 при созревании Тге§ в тимусе [21], можно предположить, что у человека стабильная экспрессия РОХР3 связана с посттранскрипционной модификацией мРНК РОХР3, а именно с альтернативным сплайсингом, и с синтезом молекулы, не содержащей продукт экзона 2. Соответственно определение именно изоформы РОХР3Д2 в наибольшей степени будет отражать связь экспрессии РОХР3 с Тге§. Однако это предположение требует дальнейшего экспериментального подтверждения в опытах по определению супрессорной активности субпопуляций с различной экспрессией изоформ молекулы РОХР3.
Суммируя вышеизложенное, можно констатировать, что экспрессия молекулы РОХР3 СБ4+-Т-лимфоцитами играет важную роль в патогенезе ММ. Так, у первичных и резистентных пациентов с ММ отмечено увеличение процента СБ4+-Т-клеток, экспрессирующих РОХР3. Основной вклад в увеличение этого процента вносят клетки, экспрессирующие короткую изоформу РОХР3А2. У первичных пациентов помимо увеличения этого процента, увеличивается и абсолютное
количество всех CD4+FOXP3+-Т-клеток. Уровень экспрессии FoxP3 CD4+ Т-клетками также отражает эффективность проводимой противоопухолевой терапии у пациентов с ММ ввиду нормализации и количества, и процента CD4+FoxP3+ Т-лимфоцитов, а соответственно и Treg у пациентов с ремиссией заболевания.
литература
4. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3. Иммунология. 2006; 37 (3): 176-88. 23. Голенков А.К., Барышников А.Ю., Караулов А.В., Митина Т.А. Лечение множественной миеломы. М.; 2008.
Поступила 25.04.14
references
1. Atanackovic D., Cao Y., Luetkens T. et al. CD4+CD25+FOXP3+ T regulatory cells reconstitute and accumulate in the bone marrow of patients with multiple myeloma following allogeneic stem cell transplantation. Haematologica. 2008; 93: 423-30.
2. Prabhala R.H., Neri P. J., Bae E. et al. Dysfunctional T regulatory cells in multiple myeloma. Blood. 2006; 107: 301-4.
3. Muthu Raja K.R., Rihova L., Zahradova L. et al. Increased T regulatory cells are associated with adverse clinical features and predict progression in multiple myeloma. PLoS One. 2012; 7: e47077.
4. Yarilin A.A., Donetskova A.D. Natural regulatory T cells and FOXP3 factor. Immunologiya. 2006; 37 (3): 176-88. (in Rusian)
5. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. et al. Immunologic sell-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receplor a-chains (CD25). J. Immunol. 1995; 155: 1151-64.
6. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 2008; 133: 775-87.
7. Fontenot J.D., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+ CD25+ regulatory T cells. Nature Immunol. 2003; 4: 330-6.
8. Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2003; 299: 1057-61.
9. Allan S.E., Passerini L., Bacchetta R. et al. The role of 2 FOXP3 isoforms in the generation of human CD4+ Tregs. J. Clin. Invest. 2005; 115: 3276-84.
10. Ziegler S.F. FOXP3: of mice and men. Annu. Rev. Immunol. 2006; 24: 209-26.
11. Allan S. E., Crome S. Q., Crellin N. K. et al, Activation-induced FOXP3 in human T effector cells does not suppress proliferation or cytokine production. Int. Immunol. 2007; 19: 345-54.
12. Wang J., Ioan-Facsinay A., van der Voort E.I., Huizinga T.W., Toes R.E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+T cells. Eur. J. Immunol. 2007; 37: 129-38.
13. Walker M.R., Kasprowicz D.J., Gersuk VH. et al. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1437-43.
14. Smith E.L., Finney H.M., Nesbitt A.M., Ramsdell F., Robinson M.K. Splice variants of human FOXP3 are functional inhibitors of human CD4+ T-cell activation. Immunology. 2006; 119: 203-11.
15. Kaur G. , Goodall J.C., Jarvis L.B., Gaston J.S.H. Characterisation of Foxp3 splice variants in human cD4+ and cD8+ T cells -identification of Foxp3delta7 in human regulatory T cells. Mol. Immunol. 2010; 48: 321-32.
16. Mailer R.K.W., Kirsten Falk K., Rotzschke O. Absence of leucine zipper in the natural FOXP3D2D7 isoform does not affect dimerization but abrogates suppressive capacity. PLoS ONE. 2009; 4: 1-17.
17. Du J., Huang C., Zhou B., Ziegler S.F. Isoform-specific inhibition of RORa-mediated transcriptional activation by human FOXP3. J. Immunol. 2008; 180: 4785-92.
18. Ichiyama K., Yoshida H., Wakabayashi Y., Chinen T., Saeki K. et al. Foxp3 inhibits RORyt-mediated IL-17A mRNA transcription through direct interaction with RORyt. J. Biol. Chem. 2008; 283: 17003-8.
19. Magg Th., Mannert J., Ellwart J.W. et al. Subcellular localization of FOxP3 in human regulatory and nonregulatory T cells. Eur. J. Immunol. 2012; 42: 1627-38.
20. Zheng Y., Josefowicz S.Z., Kas A., Chu T.T., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells. Nature. 2007; 445: 936-40.
21. Mitin A.N., Litvina M.M., Sharova N.I., Selevanenko V.T., Martakov M.A., Latyshev S.V., Yarilin A.A. FOXP3 expression and its isoform ratio during T cells differentiation. Immunologiya. 2012; 33 (4): 172-6. (in Rusian)
22. Durie B.G.M., Harousseau J.L., S. Miguel J., Blade J. et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia. 2006; 20 (9): 1467-73.
23. Golenkov A.K., Baryshnikov A.Y., Karaulov A.V., Mitina T.A. Multiple Myeloma Treatment. [Lechenie mnozhestvennoy mielomy]. Moscow; 2008. (in Russian)
24. Sakaguchi S., Finney H.M., Nesbitt A.M. et al. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nature Rev. Immunol. 2010; 10: 490-500.
Received 25.04.14
