CC BY
19
Анализ экспрессии генов семейства ABC-транспортеров « в опухоли молочной железы: связь с эффективностью химиотерапии и прогнозом заболевания
М.М. Цыганов1, М.К. Ибрагимова1, А.М. Певзнер1, 2, К.А. Гаптулбарова1, 2, Е.Ю. Гарбуков1, Е.М. Слонимская1, Е.А. Усынин1, Н.В. Литвяков1
НИИ онкологии ФГБНУ«Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук»;
Россия, 634009 Томск, переулок Кооперативный, 5; 2ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»; Россия, 634050 Томск, проспект Ленина, 36
Контакты: Матвей Михайлович Цыганов TsyganovMM@yandex.ru
Введение. Одной из основных причин неэффективности химиотерапии по-прежнему считают формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухоли за счет экспрессии энергозависимых белков АВС-транспортеров. Результаты предыдущих наших исследований для некоторых генов ABC позволили установить, что экспрессия данных генов коррелирует с эффективностью неоадъювантной химиотерапии (НХТ). Стоит отметить, что некоторые из клинических исследований указывают на то, что ABC-транспортеры могут влиять не только на формирование химиорезистентности в опухоли, но также на прогрессию, инвазию и метастазирование опухолевого узла.
Цель исследования — оценка уровня транскриптов всех известных 49 генов ABC в опухоли молочной железы до и после проведения лечения и их прогностической значимости.
Материалы и методы. В исследование была включена 31 пациентка с диагнозом рака молочной железы IIA—IIIB стадий. РНК выделяли из парных образцов опухолевой ткани до и после НХТ. Проведено микроматричное исследование всех образцов опухоли на микрочипах Clariom™ SAssay, human. С помощью микроматричного исследования изучена экспрессия 49 генов семейства ABC-транспортеров. Анализ данных микрочипа осуществляли с использованием программы Transcriptome Analysis Console (TAC) software 4.0.
Результаты. Установлено, что изменение экспрессии (повышение/снижение в процессе НХТ) генов ABCA5, ABCA7, ABCB1, ABCB4, ABCB11, ABCC1, ABCC10, ABCC11, ABCG1, ABCG2, ABCG4, ABCG5, ABCG8 статистически значимо связано с ответом на НХТ. Кроме этого, установлена прогностическая значимость экспрессии генов ABCB1 и ABCB4. Анализ выживаемости продемонстрировал, что показатели 5-летней выживаемости у больных с высокой экспрессией генов ABCB1 и ABCB4 ниже по сравнению таковыми у пациенток с низкой экспрессией данных генов (log-rank-тест p = 0,001 и 0,04 соответственно).
Заключение. Получены данные о связи экспрессии генов семейства ABC-транспортеров с эффективностью НХТ у больных раком молочной железы и исходом заболевания. Установлен прогностический потенциал генов ABCB1 и ABCB4 у больных раком молочной железы.
Ключевые слова: рак молочной железы, микроматричные исследования, транскриптом, ABC-транспортеры, неоадъювантная химиотерапия, прогноз
Для цитирования: Цыганов М.М., Ибрагимова М.К., Певзнер А.М. и др. Анализ экспрессии генов семейства ABC-транспортеров в опухоли молочной железы: связь с эффективностью химиотерапии и прогнозом заболевания. Успехи молекулярной онкологии 2020;7(2):29-38.
DOI: 10.17650/2313-805X-2020-7-2-29-38
Gene expression analysis of ABC transporter family in breast tumors: relationship with chemotherapy effect and disease
prognosis
M.M. Tsyganov1, M.K. Ibragimova1, A.M. Pevzner1,2, K.A. Gaptulbarova1,2, E. Yu. Garbukov1, E.M. Slonimskaya1, E.A. Usynin1, N. V. Litviakov1
'Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences; 5 Kooperativny Pereulok, Tomsk 634009, Russia; Tomsk State University; 36 Prospekt Lenina, Tomsk 634050, Russia
Background. One of the main reasons of the ineffectiveness of chemotherapy is still considered to be the formation of the multidrug resistance phenotype of the tumor due to the expression of energy-dependent proteins of ABC transporters. Our previous studies for some ABC genes have established that the expression of these genes correlates with the effectiveness of neoadjuvant chemotherapy (NAC). Some of the clinical studies indicate that ABC transporters can influence not only the formation of chemoresistance in the tumor, but also the progression, invasion and metastasis of the tumor node.
cv cv
us
и
CV а CV
CV
us
и ш U
Objective: to evaluate the level of transcription of all 49 known ABC genes in a breast tumor before and after treatment and their prognostic significance.
Materials and methods. The study included 31 patients with a diagnosis of stage IIA — IIIB breast cancer. RNA was isolated from paired samples of tumor tissue before and after NAC. A microarray study of all tumor samples was performed on Clariom™ S Assay, human micro-arrays. Using microarray studies, the expression of 49 genes of the ABC transporter family was studied. Analysis of the microchip data was carried out using the program Transcriptome Analysis Console (TAC) software 4.0.
Results. It was found that changes in the expression (increase/decrease during NAC) of the ABCA5, ABCA7, ABCB1, ABCB4, ABCB11, ABCC1, ABCC10, ABCC11, ABCG1, ABCG2, ABCG4, ABCG5, ABCG8 genes are statistically significantly associated with the response to NAC. In addition, the prognostic significance of ABCB1 and ABCB4 gene expression was established. Survival analysis showed that 5-year survival rates in patients with high gene expression of ABCB1 and ABCB4 are lower compared to patients with low expression of these genes (log-rank-testp = 0.001 and 0.04 respectively).
Conclusion. Data were obtained on the relationship of gene expression of the ABC transporter family with the effect of NAC in patients with breast cancer and the outcome of the disease. The prognostic potential of the ABCB1 and ABCB4 genes in patients with breast cancer has been established.
Key words: breast cancer, microarray, transcript, ABC transporters, neoadjuvant chemotherapy, prognosis
For citation: Tsyganov M.M., Ibragimova M.K., Pevzner A.M. et al. Gene expression analysis of ABC transporter family in breast tumors: relationship with chemotherapy effect and disease prognosis. Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2020;7(2):29—38. (In Russ.).
s Введение
SS На сегодняшний день системная химиотерапия
с; является важным компонентом комплексного лечения а: больных раком молочной железы (РМЖ), при этом о в качестве стандарта используются различные схемы ®® химиотерапии на основе препаратов антрациклино-вого ряда, 5-фторурацила, препаратов платины, рас-gE тительного происхождения и т. д. [1]. Как правило, gî использование химиотерапии для лечения РМЖ ограничено индивидуальной вариабельностью пациентов Ц и опухоли в ответе на лекарственное лечение и разви-s тием резистентности опухолевых клеток. Хорошо из-ш вестно, что ксенобиотики, в том числе противоопу-5 холевые препараты, интенсивно метаболизируются в организме посредством различных механизмов, в частности процесса биотрансформации [2], который обусловлен экспрессией группы энергозависимых ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette transporter), играющих решающую роль в развитии лекарственной устойчивости опухолевых клеток [3]. Текущий уровень современных исследований показывает, что экспрессия генов ABC связана с эффективностью лекарственного лечения [4, 5]. Причем данный факт установлен не только в клинической практике, но и на клеточных линиях и животных моделях [6]. Важно отметить, что результаты некоторых клинических исследований указывают на то, что ABC-транспортеры могут оказывать влияние не только на формирование множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, но и на прогрессию, инвазию и метастазирование опухоли [5, 7]. В подавляющем большинстве случаев исследования АВС-транспортеров на клиническом материале ограничиваются 5—10 из 49 генов этого семейства, для которых показано значение для формирования множественной лекарственной устойчивости. Однако значение других генов семейства АВС-транспортеров также нельзя полностью исключать.
Цель исследования — оценка уровня транскриптов всех известных 49 генов ABC в опухоли молочной железы до и после проведения лечения и их прогностического потенциала.
Материалы и методы
В исследование был включен 31 больной люми-нальным В типом РМЖ стадий IIA—IIIC с морфологически верифицированным диагнозом в возрасте 25—68 (49,1 ± 2) лет. Больные находились на лечении в клинике НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2006 по 2017 г.
В соответствии с рекомендациями Консенсусной конференции по неоадъювантной химиотерапии (НХТ) при раке молочной железы (26—28 апреля 2003 г. Филадельфия, Пенсильвания) [8] все больные получали 4—8 курсов НХТ по схемам AC (фторура-цил, доксорубицин, циклофосфан), CAX (циклофос-фан, доксорубицин, капецитабин) или монотерапию таксотером. Затем выполняли операцию, далее больным проводили 2 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC, а лучевую терапию и/или гормональное лечение назначали по показаниям. Исследование проводили в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. (исправленной в 2013 г.), получено разрешение локального этического комитета НИИ онкологии Томского НИМЦ. Использовали биопсийные опухолевые образцы (~10 мм3), взятые до лечения под ультразвуковым контролем, а также операционный материал (~60—70 мм3) после НХТ (через 4—5 нед после последнего курса НХТ). Образцы опухоли помещали в раствор RNAlater (Ambion, США) и сохраняли при температуре —80 °С (после 24-часовой инкубации при +4 °С) для дальнейшего выделения РНК.
Выделение РНК. РНК выделяли из 31 парного образца до лечения и после НХТ с помощью набора RNeasy Plus mini Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию
Таблица 1. Клинико-патологические параметры больных раком молочной железы
Table 1. Clinical and pathological parameters ofpatients with breast cancer
Клинико-патологический параметр Число больных, n (%)
Clinical and pathological parameter | The number of patients, n (%)
Возраст, лет:
Age, years:
<45 9 (29,0)
>45 22 (71,0)
Менструальный статус:
Menstrual status:
пременопауза 16 (51,6)
premenopause
постменопауза 15 (48,4)
postmenopause
Гистологический тип:
Histological type:
инвазивный протоковый рак 17 (54,8)
invasive ductal carcinoma
инвазивный дольковый рак 14 (45,2)
invasive lobular carcinoma
Размер опухоли:
Tumor size:
T1 2 (6,5)
T2 26 (83,9)
T3 1 (3,2)
T4 2 (6,5)
Лимфогенное метастазирование:
Lymphogenic metastasis:
N0 12 (38,7)
N1 13 (41,9)
N2 3 (9,7)
N3 3 (9,7)
Стадия:
Stage:
IIA 13 (41,9)
IIB 11 (35,5)
IIIA 3 (9,7)
IIIB 1 (3,2)
IIIC 3 (9,7)
Гистологическая форма:
Histological form:
уницентрическая 18 (58,1)
unicentric
мультицентрическая 13 (41,9)
multicentric
Схема неоадъювантной
химиотерапии:
Neoadjuvant chemotherapy scheme:
CAX 11 (35,5)
AC 14 (45,2)
таксотер 6(19,4)
taxotere
Эффективность
неоадъювантной химиотерапии:
Reply to the neoadjuvant
chemotherapy:
полная регрессия 2 (6,5)
complete regression
частичная регрессия 18 (58,1)
partial regression
стабилизация 10 (32,3)
stabilization
прогрессирование 1 (3,2)
progression
Примечание. CAX — циклофосфан, доксорубицин, капеци-табин; AC — фторурацил, доксорубицин, циклофосфан. Note. CAX — cyclophosphamide, doxorubicin, capecitabine; AC — fluoro-uracil, doxorubicin, cyclophosphamide.
cv a cv
cv
и ш u
и чистоту выделения РНК оценивали на флуориметре Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Для РНК концентрация составила 80—250 нг/мкл. Целостность РНК оценивали с помощью капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, США). Номер целостности РНК (RIN) составил 6,4—8,1. g
Исследование экспрессии генов семейства АВС- ^ транспортеров. Анализ экспрессии 49 генов семейства Ц АВС-транспортеров проводили на микроматричной в платформе Clariom™ S Assay, human (ThermoFisher et Scientific, США). Данная микроматрица позволяет g проанализировать экспрессию более 20 тыс. основных ^ генов человека. Процедуры пробоподготовки, гибри- Ц дизации и сканирования проводили в соответствии 2 с протоколом производителя на системе Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix, США). Анализ данных микрочипа осуществляли с помощью програм- g мы Transcriptome Analysis Console (TAC) software 4.0. q Уровень экспрессии для каждой пациентки выражали в в виде логарифма по основанию 2. Нормализацию данных экспресс выполняли, как описано в статье [9]. *
Статистическая обработка данных. Статистическую g обработку данных проводили с использованием паке- §2 та прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoft Inc., g США). Для проверки нормальности выборки приме- ж няли критерий Шапиро—Уилка. Для каждой выборки as вычисляли среднее арифметическое и среднюю ква- ос дратичную ошибку. Для проверки гипотезы о зна- а* чимости различий между исследуемыми группами ш использовали непараметрический критерий Вилкок- в сона—Манна—Уитни. Для коррекции уровней значи- Ц мости на множественные сравнения применяли по- g правку Бонферрони, рассчитанную как отношение 0,05 /49, где 49 — количество анализируемых генов. Уровень р считали статистически значимым с учетом поправки на множественные сравнения при значении 0,001. Для анализа показателей общей и безметастатической выживаемости (БМВ) использовали кривые выживаемости, построенные по методу Каплана— Майера, и log-rank-тест. Для оценки различий в частотах снижения и повышения экспрессии генов в группах с объективным ответом на НХТ и без ответа на нее использовали х2-критерий (http://vassarstats.net/index. html).
Результаты
В результате проведенного исследования с помощью микроматрицы оценена экспрессия 49 генов семейства ABC-транспортеров. На 1-м этапе был проведен анализ связи эффективности НХТ с основными клинико-патологическими характеристиками пациенток (возраст, менструальный статус, гистологический тип, размер опухоли, лимфогенное мета-стазирование, гистологическая форма) (табл. 1). Установлено, что ни один из параметров не оказывает статистически значимое влияние на эффективность НХТ (данные не представлены). Далее мы оценили связь экспрессии генов АВС-транспортеров
u
CV а CV
CV
us
с основными клинико-патологическими характеристиками пациенток. Статистически значимые различия экспрессии были установлены только для пациенток с разным размером опухоли и эффективностью химиотерапии. Показано, что уровень экспрессии генов АВСВ1, АВСВ8, АВСС2, АВСС4, ABCD1, АВС04, ABCG8 выше в группе пациенток с Т3—4 по сравнению с таковым у пациенток с Т1—2 (р <0,05) (данные не представлены).
Интересный результат показан для эффективности химиотерапии. В табл. 2 представлены данные о связи экспрессии с эффективностью НХТ.
У всех пациенток в группе с объективным ответом на НХТ уровень экспрессии генов АВСВ1, АВСВ2, АВСВ3, АВСВ7, АВСС3, АВСС5, АВСГ1, АВСГ3, АВС04 в опухоли до лечения статистически значимо выше, чем в группе больных с отсутствием ответа на НХТ (см. табл. 2). Однако при использовании поправки Бонферрони на множественные сравнения ни по одному гену статистическая значимость не достигалась. Важно отметить, что полученный результат согласуется с данными наших предыдущих исследований, а также с данными литературы. Установлено, что исходный уровень экспрессии исследуемых генов слабо связан
и ш u
Таблица 2. Связь начального уровня экспрессии генов ABC с эффективностью неоадъювантной химиотерапии Table 2. Relationship of the initial level of ABC gene expression with the effect of neoadjuvant chemotherapy
X ш
и
Ген Полная и частичная регрессия (n = 20) Full and partial regression (n = 20) Прогрессирование
Gene
ABCA1 10,14 ± 0,37 9,22 ± 0,51 0,23
ABCA2 7,31 ± 0,20 7,34 ± 0,23 0,93
ABCA3 7,98 ± 0,30 7,69 ± 0,34 0,57
ABCA4 6,76 ± 0,19 6,19 ± 0,38 0,40
ABCA5 9,95 ± 0,33 9,57 ± 0,51 0,86
ABCA6 7,25 ± 0,20 7,08 ± 0,27 0,50
ABCA7 9,64 ± 0,39 8,76 ± 0,49 0,17
ABCA8 7,95 ± 0,32 7,56 ± 0,38 0,56
ABCA9 7,60 ± 0,26 7,05 ± 0,32 0,15
ABCA10 6,48 ± 0,28 5,70 ± 0,31 0,14
ABCA11P 8,77 ± 0,34 7,88 ± 0,43 0,11
ABCA12 9,67 ± 0,54 9,07 ± 0,96 0,40
ABCA13 6,87 ± 0,30 6,59 ± 0,40 0,71
ABCB1 6,44 ± 0,23 5,76 ± 0,33 0,01
ABCB2 10,30 ± 0,35 9,38 ± 0,38 0,02
ABCB3 8,66 ± 0,26 7,33 ± 0,36 0,007
ABCB4 6,78 ± 0,29 6,57 ± 0,38 0,50
ABCB5 7,32 ± 0,46 6,27 ± 0,57 0,13
ABCB6 5,83 ± 0,18 5,33 ± 0,27 0,06
ABCB7 9,80 ± 0,37 8,55 ± 0,48 0,04
ABCB8 6,36 ± 0,17 5,75 ± 0,26 0,07
ABCB9 6,55 ± 0,26 6,03 ± 0,26 0,24
ABCB10 8,42 ± 0,23 7,71 ± 0,44 0,11
ABCB11 5,86 ± 0,31 5,51 ± 0,42 0,39
ABCC1 8,65 ± 0,33 8,44 ± 0,37 0,82
ABCC2 5,26 ± 0,26 5,29 ± 0,59 0,95
ABCC3 9,30 ± 0,50 7,58 ± 0,43 0,03
ABCC4 7,49 ± 0,20 7,20 ± 0,42 0,32
ABCC5 8,51 ± 0,28 7,51 ± 0,33 0,01
ABCC6 8,53 ± 0,21 8,10 ± 0,35 0,20
ABCC7 5,64 ± 0,25 5,14 ± 0,35 0,26
ABCC8 6,18 ± 0,19 5,74 ± 0,24 0,12
ABCC9 7,48 ± 0,21 6,82 ± 0,43 0,06
ABCC10 8,48 ± 0,25 8,11 ± 0,34 0,44
ABCC11 8,57 ± 0,37 7,98 ± 0,76 0,14
ABCC12 7,42 ± 0,20 7,65 ± 0,52 0,93
ABCD1 6,93 ± 0,19 6,90 ± 0,26 0,83
ABCD2 7,55 ± 0,23 6,72 ± 0,41 0,07
ABCD3 7,02 ± 0,24 6,51 ± 0,26 0,50
ABCD4 6,62 ± 0,19 6,20 ± 0,25 0,16
ABCE1 11,68 ± 0,40 11,48 ± 0,51 0,62
ABCF1 9,01 ± 0,25 8,35 ± 0,26 0,01
ABCF2 6,94 ± 0,20 6,85 ± 0,34 0,91
ABCF3 6,43 ± 0,16 5,82 ± 0,22 0,01
ABCG1 8,02 ± 0,35 7,35 ± 0,46 0,23
ABCG2 6,92 ± 0,24 6,97 ± 0,79 0,38
ABCG4 5,92 ± 0,25 5,08 ± 0,28 0,02
ABCG5 5,19 ± 0,25 4,78 ± 0,30 0,40
ABCG8 4,91 ± 0,22 4,77 ± 0,31 0,95
Примечание. Жирным шрифтом обозначены статистически значимые различия.
Note. Statistically significant differences are indicated in bold.
с эффективностью НХТ при РМЖ [4, 10—12]. Однако отмечено, что именно изменение экспрессии в процессе лечения определяет ответ на проводимую химиотерапию [4].
На основании этого мы сравнили уровень экспрессии до и после НХТ у больных с разным ответом на НХТ Оказалось, что в группе больных с объективным ответом на химиотерапию (полная и частичная регрессия) статистически значимо снижается экспрессия 28 (57 %) из 49 исследованных генов (при 2 х 10-5 < р <0,04). В данную группу вошли следующие гены: АВСА2, АВСА3, АВСА5, АВСА6, АВСА7, АВСА11Р, АВСА12, АВСВ1, АВСВ3, АВСВ4, АВСВ7, АВСВ10, АВСВ11, АВСС1, АВСС2, АВСС6, АВСС9, АВСС10, АВСС11, АВСС12, ABCD2, АВСЕ1, АВСГ1, АВС01, АВС02, АВС04, АВС05, АВС08 (табл. 3). Статистически значимое повышение экс-
прессии наблюдается у 10 (21 %) из 49 генов и у 11 (22 %) генов экспрессия не изменяется. В группе больных со стабилизацией и прогрессией опухоли наблюдается повышение экспрессии большинства исследуемых генов ABC. Всего экспрессия повышается у 35 (71 %) из 49 генов, а статистически значимо повышается у 19 (38 %) генов (при 0,001 <p <0,01): ABCA4, ABCA5, ABCA7, ABCA8, ABCB1, ABCB4, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC7, ABCC8, ABCC10, ABCC11, ABCF2, ABCG1, ABCG2, ABCG4, ABCG5, ABCG8. Сравнение частот повышения и снижения экспрессии исследуемых генов у пациенток с разным ответом на НХТ показало статистически значимые различия по х2-критерию (х2 = 13,93; р = 0,0009). Важно отметить, что экспрессия генов ABCA5, ABCA7, ABCB1, ABCB4, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC10, ABCC11, ABCG1, ABCG2, ABCG4, ABCG5,
cv а cv
CV
us
и ш U
Таблица 3. Экспрессии генов ABC-транспортеров у больных раком молочной железы до и после проведения НХТ в зависимости от эффективности НХТ
Table 3. Expression of ABC transporter genes in patients with breast cancer before and after neoadjuvant chemotherapy, depending on the effect of NAC
Ген Полная и частичная регрессия (n = 20) Прогрессирование и стабилизация (n = 11)
Full and partial regression (n = 20) Progression and stabilization (n = 11)
до лечения после НХТ изменение до лечения после НХТ изменение
before treatment after NAC expression change before treatment after NAC expression change
ABCA1 10,14 ± 0,37 9,28 ± 0,37 Снижение Decline 0,11 9,22 ± 0,51 8,88 ± 0,25 Снижение Decline 0,54
ABCA2 7,31 ± 0,20 5,02 ± 0,20 Снижение Decline 1 х 10-4 7,34 ± 0,23 4,68 ± 0,25 Снижение 0,002 Decline
ABCA3 7,98 ± 0,30 5,69 ± 0,30 Снижение Decline 0,003 7,69 ± 0,34 5,97 ± 0,34 Снижение о 22 Decline
ABCA4 6,76 ± 0,19 10,10 ± 0,19 Повышение Increase 7 х 10-4 6,19 ± 0,38 10,10 ± 0,54 Повышение q qqj Increase
ABCA5 9,95 ± 0,33 5,52 ± 0,33 Снижение Decline 2 х 10-5 9,57 ± 0,51 10,77 ± 0,18 Повышение q qqj Increase
ABCA6 7,25 ± 0,20 6,39 ± 0,20 Снижение Decline 0,01 7,08 ± 0,27 8,44 ± 0,15 Повышение о 07 Increase
ABCA7 9,64 ± 0,39 8,40 ± 0,39 Снижение Decline 0,003 8,76 ± 0,49 10,75 ± 0,29 Повышение 0,01
ABCA8 7,95 ± 0,32 11,88 ± 0,32 Повышение Increase 2 х 10-5 7,56 ± 0,38 11,08 ± 0,33 Повышение q qqj Increase
ABCA9 7,60 ± 0,26 9,13 ± 0,26 Повышение Increase 0,01 7,05 ± 0,32 7,70 ± 0,25 Повышение 0 54 Increase
ABCA10 6,48 ± 0,28 5,89 ± 0,28 Снижение Decline 0,82 5,70 ± 0,31 5,98 ± 0,43 Повышение 0 54 Increase
ABCA11P 8,77± 0,34 5,05 ± 0,34 Снижение Decline 2 х 10-5 7,88 ± 0,43 5,99 ± 0,27 Снижение 007 Decline
ABCA12 9,67 ± 0,54 6,55 ± 0,54 Снижение Decline 7 х 10-4 9,07 ± 0,96 6,77 ± 0,23 Снижение 0 22 Decline
ABCA13 6,87 ± 0,30 8,32 ± 0,30 Повышение Increase 0,01 6,59 ± 0,40 7,65 ± 0,22 Повышение 0 07 Increase
ABCB1 6,44 ± 0,23 5,23 ± 0,27 Снижение Decline 0,001 5,76 ± 0,33 7,43 ± 0,23 Повышение о 007 Increase
X ш
и
CV а CV
CV
us
Продолжение табл. 3 Continuation of table 3
И
ш u
X ш
и
Ген Полная и ча< Full and I ггичная регрессия (n = 20) - Прогрессирование и стабилизация (n = 11) Progression and stabilization (n = 11) -
СеПе до лечения Г после НХТ изменение до лечения после НХТ изменение
before treatment | after NAC 1before treatment 1 after NAC
ABCB2 10,30 ± 0,35 9,92 ± 0,35 Снижение Decline 0,11 9,38 ± 0,38 8,29 ± 0,33 Снижение Decline 0,07
ABCB3 8,66 ± 0,26 8,14 ± 0,26 Снижение Decline 0,003 7,33 ± 0,36 7,35 ± 0,31 Повышение Increase 1,00
ABCB4 11,78 ± 0,29 9,24 ± 0,26 Снижение Decline 2 х 10-5 9,57 ± 0,38 10,41 ± 0,29 Повышение Increase 0,01
ABCB5 7,32 ± 0,46 6,43 ± 0,24 Снижение Decline 0,11 6,27 ± 0,57 7,45 ± 0,46 Повышение Increase 0,22
ABCB6 5,83 ± 0,18 8,10 ± 0,18 Повышение Increase 0,003 5,33 ± 0,27 7,33 ± 0,42 Повышение Increase 0,22
ABCB7 9,80 ± 0,37 7,00 ± 0,37 Снижение Decline 7 х 10-4 8,55 ± 0,48 7,28 ± 0,33 Снижение Decline 0,07
ABCB8 6,36 ± 0,17 6,50 ± 0,17 Повышение Increase 0,82 5,75 ± 0,26 6,65 ± 0,33 Повышение Increase 1,00
ABCB9 6,55 ± 0,26 6,09 ± 0,26 Снижение Decline 0,82 6,03 ± 0,26 5,68 ± 0,13 Снижение Decline 0,07
ABCB10 8,42 ± 0,23 7,74 ± 0,18 Снижение Decline 0,003 7,71 ± 0,44 7,94 ± 0,23 Повышение Increase 0,07
ABCB11 5,86 ± 0,31 3,37 ± 0,26 Снижение Decline 1 х 10-4 5,51 ± 0,42 8,07 ± 0,31 Повышение Increase 0,002
ABCC1 8,65 ± 0,33 6,82 ± 0,33 Снижение Decline 7 х 10-4 8,44 ± 0,37 10,01 ± 0,28 Повышение Increase 0,01
ABCC2 5,26 ± 0,26 4,09 ± 0,26 Снижение Decline 0,003 5,29 ± 0,59 7,30 ± 0,22 Повышение Increase 0,01
ABCC3 9,30 ± 0,50 9,30 ± 0,35 Снижение Decline 0,11 7,58 ± 0,43 8,68 ± 0,50 Повышение Increase 0,07
ABCC4 7,49 ± 0,20 7,15 ± 0,20 Снижение Decline 0,50 7,20 ± 0,42 7,41 ± 0,21 Повышение Increase 0,54
ABCC5 8,51 ± 0,28 7,85 ± 0,28 Снижение Decline 0,50 7,51 ± 0,33 7,56 ± 0,17 Повышение Increase 0,54
ABCC6 8,53 ± 0,21 6,01 ± 0,21 Снижение Decline 2 х 10-5 8,10 ± 0,35 6,04 ± 0,28 Снижение Decline 0,07
ABCC7 5,64 ± 0,25 10,09 ± 0,25 Повышение Increase 2 х 10-5 5,14 ± 0,35 9,32 ± 0,36 Повышение Increase 0,002
ABCC8 6,18 ± 0,19 9,96 ± 0,19 Повышение Increase 2 х 10-5 5,74 ± 0,24 8,58 ± 0,32 Повышение Increase 0,002
ABCC9 7,48 ± 0,21 5,64 ± 0,21 Снижение Decline 1 х 10-4 6,82 ± 0,43 5,24 ± 0,18 Снижение Decline 0,01
ABCC10 8,48 ± 0,25 6,83 ± 0,25 Снижение Decline 1 х 10-4 8,11 ± 0,34 9,91 ± 0,23 Повышение Increase 0,01
ABCC11 8,57 ± 0,37 6,99 ± 0,37 Снижение Decline 0,01 7,98 ± 0,76 9,04 ± 0,20 Повышение Increase 0,01
ABCC12 7,42 ± 0,20 6,22 ± 0,20 Снижение Decline 0,01 7,65 ± 0,52 10,13 ± 0,34 Повышение Increase 0,07
Окончание табл. 3 End of table 3
Полная и ча< личная регрессия (n = 20) Прогрессирование и стабилизация (n = 11) Progression and stabilization (n = 11)
Ген - -
до лечения Г после НХТ изменение до лечения Г после НХТ expression change
before treatment after NAC before treatment after NAC
ABCD1 6,93 ± 0,19 8,94 ± 0,19 Повышение Increase 1 х 10-4 6,90 ± 0,26 8,34 ± 0,40 Повышение Increase 0,07
ABCD2 7,55 ± 0,23 4,77 ± 0,23 Снижение Decline 2 х 10-5 6,72 ± 0,41 6,10 ± 0,21 Снижение Decline 0,22
ABCD3 7,02 ± 0,24 7,71 ± 0,24 Повышение Increase 0,11 6,51 ± 0,26 7,56 ± 0,19 Повышение Increase 0,07
ABCD4 6,62 ± 0,19 6,49 ± 0,19 Снижение Decline 1,00 6,20 ± 0,25 6,07 ± 0,16 Снижение Decline 0,54
ABCE1 11,68 ± 0,40 8,93 ± 0,40 Снижение Decline 0,01 11,48 ± 0,51 8,92 ± 0,37 Снижение Decline 0,07
ABCF1 9,01 ± 0,25 7,72 ± 0,25 Снижение Decline 7 х 10-4 8,35 ± 0,26 7,10 ± 0,30 Снижение Decline 0,01
ABCF2 6,94 ± 0,20 8,56 ± 0,20 Повышение Increase 2 х 10-5 6,85 ± 0,34 8,83 ± 0,20 Повышение Increase 0,01
ABCF3 6,43 ± 0,16 7,68 ± 0,16 Повышение Increase 7 х 10-4 5,82 ± 0,22 7,48 ± 0,25 Повышение Increase 0,07
ABCG1 8,02 ± 0,35 7,04 ± 0,40 Снижение Decline 0,04 7,35 ± 0,46 8,65 ± 0,35 Повышение Increase 0,001
ABCG2 6,92 ± 0,24 5,02 ± 0,46 Снижение Decline 7 х 10-4 6,97 ± 0,79 7,89 ± 0,24 Повышение Increase 0,001
ABCG4 5,92 ± 0,25 3,11 ± 0,30 Снижение Decline 2 х 10-5 5,08 ± 0,28 8,03 ± 0,25 Повышение Increase 0,001
ABCG5 5,19 ± 0,25 3,04 ± 0,26 Снижение Decline 2 х 10-5 4,78 ± 0,30 7,28 ± 0,25 Повышение Increase 0,001
ABCG8 4,91 ± 0,22 3,06 ± 0,24 Снижение Decline 2 х 10-5 4,77 ± 0,31 7,42 ± 0,22 Повышение Increase 0,001
Примечание. НХТ — неоадъювантная химиотерапия. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия в уровне экспрессии генов ABC до и после НХТ в зависимости от ответа на лечение. В группе пациенток с объективным ответом (полная и частичная регрессия) выделено только статистически значимое снижение экспрессии; в группе пациенток без ответа на лечение (прогрессирование и стабилизация) — только статистически значимое повышение экспрессии. Жирным шрифтом и курсивом выделены статистически значимые различия в уровне экспрессии генов ABC до и после НХТ в зависимости от ответа на лечение с учетом поправки Бонферрони.
Note. NAC — neoadjuvant chemotherapy. In bold, statistically significant differences in the level of ABC gene expression before and after NAC are shown in bold type depending on the response to treatment. In the group ofpatients with an objective response (full and partial regression), only a statistically significant decrease in expression was identified; in the group without response to treatment (progression and stabilization) — only a statistically significant increase in expression. Bold and italics indicate statistically significant differences in the level of ABC gene expression before and after NAC depending on the response to treatment, taking into account the Bonferroni correction.
cv a cv
cv
us
и
Ш
u
X ш
и
ABCG8 статистически значимо изменялась и была связана с ответом на НХТ в обеих группах пациенток (см. табл. 3).
Далее с использованием метода Каплана—Майера была оценена связь показателей БМВ с экспрессией АВС-транспортеров. Для выявления связи показателей экспрессии с выживаемостью мы воспользовались статистическими характеристиками нашей выборки по медиане экспрессии исследуемых генов. Это сделано для того, чтобы было равное число пациенток в 2 противоположных группах. Соответственно группу с высоким уровнем экспрессии составили пациентки, у которых экспрессия генов выше значения медианы,
группу с низким уровнем — те, у кого значения медианы ниже. В результате установлено, что только при высоком уровне экспрессии генов АВСВ1 и АВСВ4 после НХТ наблюдаются низкие показатели БМВ (см. рисунок). Показатели 5-летней выживаемости в группе больных с высокой экспрессией гена АВСВ1 составили 43 % против 92 % в противоположной группе (log-rank-тест р = 0,001). Для гена АВСВ4 показан аналогичный результат: в группе с высоким уровнем экспрессии гена показатели 5-летней БМВ сравнительно невысокие — 58 %, а в группе с низким уровнем — 87 % (log-rank-тест р = 0,04).
Статистически значимых различий в показателях БМВ у пациенток с экспрессией других генов
CV а CV
CV
us
и ш U
1,0
0,9
•чО
„ 0,8
I О,7 0,6 J 0,5
I-
и
Л 0,4
ш
3 0,3 s
! 0,2 са
0,1 0
"ih... ,
i Р = 0,001
0-.- + -*-
t... — -,
— Низкий уровень экспрессии ABCB1 / Low expression ABCB1 — Высокий уровень экспрессии ABCB1 / High expression ABCB1
20 40 60 80 100 Время, мес / Time, months
120 140
1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
et-cm— 1 ,„
i........ p = 0,04
А................ Низкий уровень экспрессии ABCB4 /
Low expression ABCB4 Высокий уровень экспрессии
ABCB4 / High expression ABCB4
20 40 60 80 100 Время, мес / Time, months
120 140
График выживаемости Каплана—Майера, представляющий связь безметастатической выживаемости с уровнем экспрессии генов ABCB1 (а) и ABCB4 (б) после неоадъювантной химиотерапии. В качестве группирующей переменной использовалась медиана экспрессии: для ABCB1 — 7,6; ABCB4 — 10,1.
Kaplan-Meyer survival graph representing the relationship between metastatic survival and the level of gene expression of ABCB1 (а) and ABCB4 (б) after neoadjuvant chemotherapy. The expression median was used as a grouping variable: for ABCB1 — 7.6; ABCB4 — 10.1.
X ш
и
ABC-транспортеров как до лечения, так и после НХТ не установлено.
Обсуждение
В настоящее время существует немало исследований экспрессии генов ABC-транспортеров при различных злокачественных новообразованиях. Были выделены основные гены ABC, участвующие в транспорте лекарственных препаратов при раке, к которым были отнесены такие гены, как ABCA1, ABCA2, ABCA3, ABCB1, ABCB4, ABCB5, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCC6, ABCC10, ABCC11, ABCG2 [3]. Интересно, что если связь экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG1, ABCG2 и некоторых других с эффективностью НХТ показана во многих исследованиях [13—15], то для генов подсемейства ABCA связь весьма неочевидна. Тем не менее было продемонстрировано, что высокая экспрессия ABCA2 и ABCA3 коррелирует с плохим химиотерапевтическим ответом [16]. Результаты предыдущего нашего исследования показали, что изменение экспрессии генов ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC5, ABCG1, ABCG2 коррелирует с ответом на НХТ, что согласуется с полученными результатами данного исследования [4]. На сегодняшний день остается непонятной роль гена ABCF1, поскольку он не имеет трансмембранного домена и его функция отличается от большинства ABC-транспор-теров [17]. Тем не менее мы показали, что снижение экспрессии данного гена в опухоли молочной железы связана с химиочувствительностью. Аналогичный результат был показан при гепатоцеллюлярной карциноме [18]. Примечательно, что уровень экспрессии ABCA9, ABCA10 и ABCC9 был связан с безрецидивной выживаемостью [19]. Мы установили, что гиперэкс-
прессия гена ABCB4 после химиотерапии связана с эффективностью лечения и низкими показателями БМВ. Это в определенной мере объясняет результаты исследования J. F. Huang и соавт. на клеточных линиях РМЖ, в котором было показано, что гиперэкспрессия гена ABCB4 связана с резистентностью к доксоруби-цину и, как следствие, может определять ответ опухоли на химиотерапевтическое лечение [20]. Установлено, что ABCB4 локализуется на мембране гепатоцитов, секретирующих фосфатидилхолин в желчь, для защиты гепатобилиарного эпителия от повреждения свободными желчными кислотами. При этом нарушения в ABCB4 вызывают редкие заболевания желчевыводя-щих путей [21]. Тем не менее точная функция, а также потенциальные механизмы гена ABCB4 детально не определены. Однако установлено, что гиперэкспрессия ABCB4 связана с химиорезистентностью при лечении 5-фторурацилом и сопряжена с низкими показателями безрецидивной и общей выживаемости [21], связана с химиорезистентностью при лечении доксо-рубицином [22] и др.
Связь гена ABCB1 с прогнозом в основном показана для полиморфизмов данного гена [23, 24] и для направления изменения его экспрессии в процессе НХТ [7].
Заключение
Результаты проведенного исследования позволили подтвердить результаты исследований прошлых лет и получить новые данные о связи новых генов ABC-транспортеров с эффективностью НХТ и прогнозом заболевания. Основываясь на этих результатах, мы предполагаем, что выявленные гены могут быть новыми предиктивными и прогностическими маркерами при РМЖ.
б
а
0
0
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Семиглазов В.Ф., Горбунова В.А., Тюляндин С.А. Химиотерапия рака молочной железы: современный взгляд на проблему. Медицинский совет 2017;1(6):56-60. DOI:10.21518/2079-701X-2017-6-56-60 [Semiglazov V.F., Gorbunova V.A., Tjuljandin S.A. Chemotherapy for breast cancer: a modern view of the problem. Meditsinskiy sovet = Medical Advice 2017;1(6):56-60.
(In Russ.)].
2. Parkinson A., Ogilvie B.W. Biotransformation of xenobiotics. Casarett and Doull's toxicology: Basic Sci Poisons 2008;7(1):161-304.
3. Fletcher J.I., Haber M., Henderson M.J. et al. ABC transporters in cancer: more than just drug efflux pumps. Nat Rev Cancer 2010;10(2):147-56.
DOI: 10.1038/nrc278.9.
4. Litviakov N.V., Cherdyntseva N.V., Tsyganov M.M. et al. Changing the expression vector of multidrug resistance genes is related to neoadjuvant chemotherapy response. Cancer Chemother Pharmacol 2013;71(1):153-63. DOI: 10.1007/s00280-012-1992-x.
5. Hlavata I., Mohelnikova-Duchonova B., Vaclavikova R. et al. The role of ABC transporters in progression and clinical outcome of colorectal cancer. Mutagenesis 2012;27(2):187-96. DOI: 10.1093/mutage/ger075.
6. Patel A., Li T.W., Anreddy N. et al. Suppression of ABCG2 mediated MDR in vitro and in vivo by a novel inhibitor of ABCG2 drug transport. Pharmacol Res 2017;121:184-93.
DOI: 10.1016/j.phrs.2017.04.025.
7. Литвяков Н.В., Гарбуков Е.Ю., Слонимская Е.М. и др. Связь безметастатической выживаемости больных раком молочной железы и вектора изменения экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости
в опухоли при проведении НХТ. Вопросы онкологии 2013;59(3):334-40. DOI: https://doi.org/10.18722/ VO2013593334-340. [Litviakov N.V., Garbukov E.Yu., Slonimskaya E.M. et al. Connection of metastasis-free survival in breast cancer patients and an expression vector of multidrug resistance genes
in tumor during neoadjuvant chemotherapy. Voprosy onkologii = Oncology Issues 2013;59(3):334—40. (In Russ.)].
8. Schwartz G.F., Hortobagyi G.N. Proceedings of the consensus conference on neoadjuvant chemotherapy in carcinoma of the breast, April 26-28, 2003, Philadelphia, Pennsylvania.
Breast J 2004;10(4):273-94.
9. Irizarry R.A., Hobbs B., Collin F. et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 2003;4(2): 249-64.
DOI: 10.1093/biostatistics/4.2.249.
10. Wind N., Holen I. Multidrug resistance in breast cancer — from in vitro models to clinical studies. Int J Breast Cancer 2011;2011:1-12.
DOI: 10.4061/2011/967419.
11. Kim B., Fatayer H., Hanby A.M. et al. Neoadjuvant chemotherapy induces expression levels of breast cancer resistance protein that predict disease-free survival in breast cancer. PLoS One 2013;8(5):1—8. DOI: 10.1371/journal.pone.0062766.
12. Gillet J.P., Efferth T., Remacle J. Chemotherapy-induced resistance by ATP-bin-ding cassette transporter genes. Biochim Biophys Acta 2007;1775(2):237—62. DOI: 10.1016/j.bbcan.2007.05.002.
13. Velaei K., Samadi N., Soltani S. et al. NFkBP65 transcription factor modulates resistance to doxorubicin through ABC transporters in breast cancer. Breast Cancer 2017;24(4):552—61.
DOI: 10.1007/s12282-016-0738-8.
14. Patch A.M., Christie E.L., Etemadmoghadam D. et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature 2015;521(7553): 489—94. DOI: 10.1038/nature14410.
15. Wilson C.S., Davidson G.S., Martin S.B. et al. Gene expression profiling of adult acute myeloid leukemia identifies novel biologic clusters for risk classification and outcome prediction. Blood 2006;108(2):685—96.
DOI: 10.1182/blood-2004-12-4633.
16. Steinbach D., Gillet J.P., Sauerbrey A. et al. ABCA3 as a possible cause of drug resistance in childhood acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res
2006;12(14):4357-63.
DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-05-2587.
17. Chen Z., Shi T., Zhang L. et al. Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family
in multidrug resistance: a review of the past decade. Cancer Lett 2016;370(1):153-64. DOI: 10.1016/j.canlet.2015.10.010.
18. Fung S.W., Cheung P.F.Y., Yip C.W. et al. The ATP-binding cassette transporter ABCF1 is a hepatic oncofetal protein that promotes chemoresistance, EMT and cancer stemness in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 2019;457:98-109. DOI: 10.1016/j.canlet.2019.05.010.
19. Elsnerova K., Mohelnikova-Duchonova B., Cerovska E. et al. Gene expression of membrane transporters: importance for prognosis and progression of ovarian carcinoma. Oncol Rep 2016;35(4):2159-70.
DOI: 10.3892/or.2016.4599.
20. Huang J.F., Wen C.J., Zhao G.Z. et al. Overexpression of ABCB4 contributes to acquired doxorubicin resistance
in breast cancer cells in vitro. Cancer Chemother Pharmacol 2018;82(2):199-210. DOI: 10.1007/s00280-018-3603-y.
21. Hu H., Wang M., Guan X. et al. Loss of ABCB4 attenuates the caspase-dependent apoptosis regulating resistance to 5-Fu in colorectal cancer. Biosci Rep 2018;38(1):BSR20171428.
DOI: 10.1042/BSR20171428.
22. Hontecillas-Prieto L., Garcia-Dominguez D.J., Vaca D.P. et al. Multidrug resistance transporter profile reveals MDR3 as a marker for stratification of blastemal Wilms tumour patients. Oncotarget 2017;8(7):11173-86.
DOI: 10.18632/oncotarget.14491.
23. Tulsyan S., Mittal R.D., Mittal B. The effect of ABCB1 polymorphisms
on the outcome of breast cancer treatment. Pharmacogen Personal Med 2016;9(1):47-58. DOI: 10.2147/PGPM.S86672.
24. Kim H.J., Im S.A., Keam B. et al. ABCB1 polymorphism as prognostic factor
in breast cancer patients treated with docetaxel and doxorubicin neoadjuvant chemotherapy. Cancer Sci 2015;106(1): 86-93. DOI: 10.1111/cas.12560.
cv a cv
cv
us
и
Ш
u
X ш
и
CV
Вклад авторов
М.М. Цыганов: написание текста рукописи; см М.К. Ибрагимова, А.М. Певзнер, К.А. Гаптулбарова: анализ полученных данных;
Е.Ю. Гарбуков, Е.М. Слонимская: получение данных для анализа, обзор публикаций по теме статьи; Е.А. Усынин, Н.В. Литвяков: разработка дизайна исследования. Authors' contributions es M.M. Tsyganov: article writing;
2 M.K. Ibragimova, A.M. Pevzner, K.A. Gaptulbarova: analysis of the obtained data;
О E.Yu. Garbukov, Е.М. Slonimskaya: obtaining data for analysis, reviewing of publications of the article's theme; Z E.A. Usynin, N.V. Litviakov: developing the research design.
g ORCID авторов / ORCID of authors
М.М. Цыганов / M.M. Tsyganov: https://orcid.org/0000-0001-7419-4512 C9 М.К. Ибрагимова / M.K. Ibragimova: https://orcid.org/0000-0001-8815-2786 Ï А.М. Певзнер / A.M. Pevzner: https://orcid.org/0000-0002-9657-9058 Ц К.А. Гаптулбарова / K.A. Gaptulbarova: https://orcid.org/0000-0003-1091-7528 ZZ Е.Ю. Гарбуков / E.Yu. Garbukov: https://orcid.org/0000-0002-2917-8158
Е.М. Слонимская / Е.М. Slonimskaya: https://orcid.org/0000-0003-4382-5697 Н.В. Литвяков / N.V. Litviakov: https://orcid.org/0000-0002-0714-8927
и ш u
X ш
и
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 18-29-09131 «Феномен «замирания» опухоли в процессе химиотерапии».
Funding. This work was supported by grant number 18-29-09131 Russian Foundation for Basic Research "The phenomenon of tumor "fading" during chemotherapy".
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ онкологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук». Протокол № 1 от 14.01.2013. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics
The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences. Protocol No 1 dated 14.01.2013. All patients gave written informed consent to participate in the study.
Статья поступила: 26.05.2020. Принята к публикации: 25.06.2020. Article submitted: 26.05.2020. Accepted for publication: 25.06.2020.
