CC BY
56
АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ В СТАБИЛЬНОЙ И НЕСТАБИЛЬНОЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШКАХ МЕТОДОМ ПОЛНОГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ РНК: ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Иванощук Д. Е.1'2'4, Рагино Ю. И.1, Шахтшнейдер Е. В.1'4, Михайлова С. В.1, Фишман В. С.2,4, Полонская Я. В.1, Каштанова Е. В.1, Чернявский А. М. , Мурашов И. С. , Воевода М. И. ,
Цель. Выполнить анализ дифференциальной экспрессии генов металлопро-теиназ, вовлеченных в процесс стабилизации/дестабилизации атеросклеро-тической бляшки методом полногеномного секвенирования РНК и определить уровень металлопротеиназ в гомогенатах атеросклеротических бляшек разного типа методом иммуноферментного анализа (ИФА). Материал и методы. Исследование выполнено на образцах атеросклеротических бляшек пациентов 45-65 лет, жителей Западно-Сибирского региона с коронароангиографически документированным коронарным атеросклерозом без острого коронарного синдрома со стабильной стенокардией напряжения II-IV функционального класса. Забор тканей атеросклеротической бляшки проводился в ходе операции при наличии интраоперационных показаний. Выполнено гистологическое исследование бляшек. В гомогенатах фрагментов интима/медии методом ИФА с использованием наборов BCM Diagnostics определены уровни деструктивных биомаркеров MMP-1, MMP-3, MMP-7 MMP-9, TIMP-1 на анализаторе Multiscan EX (Thermo Fisher Scientific, USA). Подготовка библиотек для полногеномного секвенирования РНК проведена с использованием набора Illumina's TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, USA). Профиль экспрессии в тканях бляшек определен на приборе HiSeq 1500 (Illumina, USA).
Результаты. Отличия в экспрессии между типами бляшек были отмечены для генов матриксных металлопротеиназ MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, MMP12, и MMP14. Наблюдалось 8-кратное статистически значимое увеличение уровня экспрессии ММР9 (p<0,001) в нестабильной атеросклеротической бляшке дистрофически-некротического вида. Исследование методом ИФА содержания MMP-7, являющейся активатором про-MMP^, а также содержания самой MMP-9, выявило их повышение в нестабильных бляшках в сравнении липид-ными пятнами (в 1,5 и 2,4 раза) и молодыми стабильными бляшками (в 1,4 и 2,1 раза).
Заключение. Для гена ММР9 получены статистически значимые различия уровня экспрессии в стабильной атеросклеротической бляшке фиброзного вида и нестабильной атеросклеротической бляшки дистрофически-некротического вида. При проведении ИФА выявлено, что в липидных пятнах и молодых стабильных атеромах коронарных артерий повышена концентрация MMP-3 и снижена активность тканевого ингибитора металлопротеиназ. В нестабильных бляшках со склонностью к изъязвлению/разрыву повышены концентрации MMP-1, MMP-7, MMP-9.
Российский кардиологический журнал. 2018;23(8):52-58
http://dx.doi.org/1015829/1560-4071-2018-8-52-58
Ключевые слова: матриксные металлопротеиназы, атеросклеротические бляшки, РНК, полногеномное секвенирование РНК, транскриптом, атеросклероз.
Конфликт интересов: работа выполнена при поддержке РФФИ (№ 17-0402120) и ГЗ 0324-2018-0001.
1Научно-исследовательский институт терапии и профилактической меди-
цины — филиал ИЦиГ СО РАН, Новосибирск; 2ФИЦ Институт цитологии и гене-
тики СО РАН, Новосибирск; 3ФГБУ НМИЦ им. акад. Е. Н. Мешалкина, Новосибирск; 4фГАОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия.
Иванощук Д. Е. — н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, м.н.с. лаборатории молекулярной генетики человека, м.н.с. лаборатории молекулярной эпидемиологии и биоинформатики, ORCID: 0000-0002-0403-545X, ResearcherlD: N-2325-2018, Рагино Ю. И. — член-корр. РАН, д.м.н., профессор, зав. лабораторией клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний, ORCID: 0000-0002-4936-8362, Шахтшнейдер Е. В.* — к.м.н., в.н.с. лаборатории моле-кулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний, с.н.с. лаборатории молекулярной эпидемиологии и биоинформатики, ORCID: 00000001-6108-1025, ResearcherlD: E-9453-2015, Михайлова С. В. — к.б.н., н.с. лаборатории молекулярной генетики человека, ORCID: 0000-0002-0897-5473, ResearcherlD: N-2399-2018, Фишман В. С. — в.н.с. сектора геномных механизмов онтогенеза, преподаватель кафедры молекулярной биологии, ORCID: 0000-0002-5573-3100, ResearcherlD: R-8892-2016, Полонская Я. В. — к.м.н., с.н.с. лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний, ORCID: 0000-0002-3538-0280, ResearcherlD: H-4397-2016, Каштанова Е. В. — д.б.н., с.н.с. лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний, ORClD: 0000-0003-2268-4186, ResearcherlD: J-4675-2016, Чернявский А. М. — д.м.н., профессор, руководитель Центра хирургии аорты, коронарных и периферических артерий, ORClD: 0000-0001-9818-8678, ResearcherlD: l-9975-2014, Мурашов И. С. — н.с. лаборатории патоморфологии, ORClD: 0000-0002-37121258, ResearcherlD: N-5706-2017 Воевода М. И. — академик РАН, д.м.н., профессор, руководитель института, зав. лабораторией молекулярной генетики человека, зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии и биоинформатики, ORClD: 0000-0001-9425-413X, ResearcherlD: N-6713-2015.
*Автор, ответственный за переписку (Corresponding author): 2117409@mail.ru
ГМК — гладкомышечные клетки, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА — иммуноферментный анализ, мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота, кДНК — комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота, РНК — рибонуклеиновая кислота, рРНК — рибосомная рибонуклеиновая кислота, тРНК — транспортная рибонуклеиновая кислота, FDR — false discovery rate, средняя доля ложных отклонений гипотез, MMP1/MMP26 — гены матриксных металлопротеиназ, ММР-1/ММР-26 — матриксные металлопротеиназы, RNA-seq — метод полногеномного секвенирования РНК.
Рукопись получена 28.06.2018 Рецензия получена 03.072018 Принята к публикации 11.07.2018
ANALYSIS OF DIFFERENTIAL EXPRESSION OF MATRIX METALLOPROTEASES IN STABLE AND UNSTABLE ATHEROSCLEROTIC LESIONS BY A METHOD OF FULL GENOME SEQUENCING OF RNA: PILOT STUDY
12 4 1 14 1 2 4 1 1
Ivanoschuk D. E.'' , Ragino Yu. I., Shakhtshneider E. V.' , Mikhailova S. V., Fishman V. S.' , Polonskaya Ya. V., Kashtanova E. V.,
3 3 124
Chernyavsky A. M., Murashov I. S. , Voevoda M. I.''
Aim. To analyze differential expression of metalloproteases genes, Involved Into the processes of stabilization/destabilization of atherosclerotic plaque, with the method of full genome sequencing of RNA, and to evaluate the level of metalloproteases in homogenates of plaques of various types by immune enzyme assay method (IEA). Material and methods. The study has been conducted on the specimens of atherosclerotic plaques of patients aged 45-65 y.o., inhabitants of Western Siberia with angiographically proven coronary atherosclerosis and no acute coronary syndrome, with stable angina II-IV functional class. Specimens collection from the plaques was done during an operation if there were intraoperational indications. Histology performed. In intima/media homogenates by IEA method, with BCM Diagnostics assays the levels of destructive markers were measured: MMP-1, MMP-3, MMP-7 MMP-9, TIMP-1 on the Multiscan EX (Thermo Fisher Scientific, USA). Libraries preparation for full genomic sequencing of RNA was done with Illumina's TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, USA). Expression profile in tissues was done on HiSeq 1500 (Illumina, USA).
Results. There are differences in expression of the genes MMP2, MMP7, MMP8, MMP9, MMP12, u MMP14 in different types of plaques. There was 8 times higher significant raise in increase of the expression level of MMP9 (p<0,001) in unstable plaque of dystrophic-necrotic type. Study by IEA of MMP-7 content, which is an activator of pro-MMP-9, as well as the content of MMP-9 itself, showed their increased levels in unstable plaques comparing to fatty streaks (1,5 and 2,4 times) and young stable plaques (1,4 and 2,1 times).
Conclusion. For the gene MMP9 there were significant differences obtained, of expression levels in stable atherosclerotic fibrous plaque and unstable plaque of dystrophic-necrotic type. With the IEA it was found that fatty streaks and young stable
atheromas of coronary arteries have an increased concentration of MMP-3 and decreased activity of tissue inhibitor of metalloproteases. In unstable plaques with the tendency to rupture/ulceration there are increased levels of MMP-1, MMP-7 MMP-9.
Russ J Cardiol. 2018;23(8):52-58
http://dx.doi.org/10.15829/1560-4071-2018-8-52-58
Key words: matrix metalloproteases, atherosclerotic plaques, RNA, full genomic sequencing of RNA, transcriptome, atherosclerosis.
Conflicts of Interest: supported by RFFR (№ 17-04-02120) and State Assignment 0324-2018-0001.
'Scientific Research Institute of Therapy and Prevention Medicine — branch of FRCCG SD RAS, Novosibirsk; 2Federal Research Center for Cytology and Genetics (FRCCG) of SD RAS, Novosibirsk; 3E.N. Meshalkin Novosibirsk National Medical Research Institute, Novosibirsk; Novosibirsk National Research State University, Novosibirsk, Russia.
Ivanoschuk D. E. ORCID: 0000-0002-0403-545X, Ragino Yu. I. ORCID: 0000-00024936-8362, Shakhtshneider E. V. ORCID: 0000-0001-6108-1025, Mikhailova S. V. ORCID: 0000-0002-0897-5473, Fishman V. S. ORCID: 0000-0002-5573-3100, Polonskaya Ya. V. ORCID: 0000-0002-3538-0280, Kashtanova E.V. ORCID: 00000003-2268-4186, Chernyavsky A. M. ORCID: 0000-0001-9818-8678, Murashov I. S. ORCID: 0000-0002-3712-1258, Voevoda M. I. ORCID: 0000-0001-9425-413X.
В клинической картине атеросклероза важно своевременно диагностировать признаки дестабилизации атеросклеротической бляшки, т.к. нестабильные бляшки подвержены разрыву, что может привести к развитию осложнений (инсульт, инфаркт и т.д.). Актуален поиск и выявление молекулярных факторов, отражающих процессы, связанные с дестабилизацией бляшек, особенно для пациентов с бессимптомным течением заболевания. Согласно литературным данным, существует положительная корреляция риска деструкции атеросклеротической бляшки с изменением уровня экспрессии ряда мат-риксных металлопротеиназ [1, 2].
Матриксные металлопротеиназы (ММР) принадлежат к семейству эндопептидаз, которые содержат цинк-связывающий консервативный мотив на сайте, отвечающем за каталитическую активность белка. Известно, более 20 членов этого семейства, разделенные на 5 основных групп, исходя из их субстратной специфичности. Секретируемые тканевые пепти-дазы: коллагеназы (ММР-1, ММР-8 и ММР-13), желатиназы (ММР-2 и ММР-9), стромелизины (ММР-3, ММР-10 и ММР-11), мальтризин (ММР-7), макрофагальная металлоэластаза (ММР-12) и мем-бранно-связанные эндопротеиназы ММР-14, ММР-17, ММР-25 и ММР-26 [3]. Помимо разрушения внеклеточных компонентов, ММР участвуют во многих
физиологических процессах, таких как органогенез, ремоделирование тканей, ангиогенез, апоптоз, иммунный ответ и процессы заживления ран. Активность данного семейства протеаз регулируется на транскрипционном уровне, на стадии процес-синга белка, а также контролируется рядом тканеспе-цифичных ингибиторов — tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) — для внеклеточных ММР и а2-макроглобулином для плазма-ассоциированных ММР [4]. Смещение равновесия между образованием активной формы ММР и ингибиторами приводит к развитию патологических состояний, связанных с воспалением, нарушением пролиферации и миграции клеток. Известно четыре ингибитора семейства TIMP (TIMP1-TIMP4), которые селективно подавляют активность матриксных металло-протеиназ через связывание N-терминального конца ингибитора с каталитическим центром металлопро-теиназы. TIMP-1 ингибирует MMP-7, MMP-9, MMP-1 и MMP-3, TIMP-2 — эффективный ингибитор для ММР-2, TIMP-3 может ингибировать MMP-2 и MMP-9, в то время как TIMP-4 подавляет активность MMP-14 и MMP-2 [5].
Повышенная экспрессия и протеолитическая активность желатиназы В (ММР-9) обнаружена в глад-комышечных клетках атеросклеротической бляшки, эндотелиальных клетках, макрофагах и микрососуди-
стом эндотелии артерий с атеросклеротическим повреждением. В экспериментах на модельных объектах было показано влияние ММР-9 на миграцию гладко-мышечных клеток (ГМК) к месту повреждения стенки сосуда и обусловленное этим утолщение интимы и, как следствие, стабилизацию бляшек. В этом же эксперименте была установлена зависимость активации про-ММР-9 от стромелизина 1 (ММР-3) [2]. Миграция гладкомышечных клеток на участках повреждения сосудов наблюдалась также при повышенной экспрессии ММР-9 и ММР-2 [6]. При миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из стенки сосудов в область атеросклеротической бляшки происходит формирование и укрепление фиброзной капсулы бляшки. Поскольку этот процесс происходит при участии желатиназы В (ММР-9), желатиназы А (ММР-2) и стромелизина 1 (ММР-3), было выдвинуто предположение об участии этих пептидаз в стабилизации бляшек [2]. Существующие данные дифференцируют роль ММР-9 на различных стадиях атерогенеза: в зависимости от стадии заболевания, повышенная экспрессия ММР-9 обладает различным эффектом. На ранних стадиях высокий уровень ММР-9 вызывает внешнее ремоделирование бляшки и морфологические признаки дестабилизации, но не коррелирует с частотой осложнений, таких как разрыв бляшки или тромбоз. В случае зрелых бляшек, высокий уровень ММР-9 ассоциирован с повышением частоты внутри-бляшечных кровоизлияний, способствуя ее надрыву/ разрыву [7].
Повышенный уровень матрилизина 7 (ММР-7) наблюдался в плазме крови у пациентов с атеросклерозом по сравнению со здоровым контролем [8].
Перспективным маркером развития атеросклеро-тического процесса является коллагеназа-2 (ММР-8) — один из распространённых белков внеклеточного матрикса. Экспрессия гена ММР-8 показана в гладкомышечных, эндотелиальных клетках и макрофагах атеросклеротической бляшки. ММР-8 эффективнее расщепляет коллаген первого типа по сравнению с другими членами этой группы: ММР-1 и ММР-13. ММР-8 способна активировать ММР-2, ММР-3 и ММР-9 и инактивировать Т1МР-1. По сравнению со здоровым сосудом, 8-кратное увеличение активной формы ММР-8 было зафиксировано в нестабильных бляшках и лишь 3-кратное — в фиброзных по сравнению со здоровым сосудом, из чего было выдвинуто предположение, что ММР-8 может играть важную роль в ремоделировании или созревании бляшки [9].
Биомеханическая прочность бляшки зависит от баланса между синтезом коллагена и его деградацией. Накопление коллагена в фиброзной покрышке атеро-склеротической бляшки наблюдалось в эксперименте на мышах при селективном ингибировании ММР-13, что способствовало стабилизации бляшки [10]. Ис-
следование пациентов с атеросклерозом разной степени выраженности показало повышенную экспрессию ММР-13 и ММР-1 клетками макрофагов в ате-роматозных бляшках по сравнению со зрелыми бляшками. Было выдвинуто предположение, что ате-роматозные бляшки (не фиброзные) могут быть больше подвержены разрыву из-за повышенного кол-лагенолиза [2].
Мембранная эндопептидаза ММР-14 известна своей способностью секретироваться в активной форме, участвовать в деградации компонентов внеклеточного матрикса при деструкции бляшки и специфической активации прожелатиназы А (ММР-2) и коллагеназы-3 (ММР-13). Высокий уровень экспрессии белка ММР-14 наблюдался в гладкомышечных клетках и пенистых клетках атеросклеротиче-ской бляшки [2, 11].
Еще одним потенциальным участником, вовлеченным в процесс дестабилизации бляшки, может являться макрофагальная металлоэластаза (ММР-12). Основной ее функцией является гидролиз эластина и компонентов внеклеточного матрикса. Недавние исследования среди лиц с высоким риском сердечно-сосудистых заболеваний показали ассоциацию повышенной плазменной концентрации ММР-12 с цереброваскулярными и сердечно-сосудистыми осложнениями. Было установлено, что ММР-12 вовлечена в развитие атеросклеротического повреждения крупных сосудов через повышение деградации эластина и инвазию макрофагов [12].
Метод полногеномного секвенирования РНК (ККА^ец) позволяет идентифицировать полный набор транскрипционных единиц (малые РНК, мРНК, рРНК, тРНК, некодирующие РНК) и продукты их альтернативного сплайсинга (тканеспецифические транскрипты), которые экспрессируются при определенных условиях в разных клетках или тканях. Данный метод позволяет выявлять паттерны совместно экспрессиру-ющихся генов и выделять функционально связанные единицы. В представленной работе мы использовали метод ККА^ед для проведения пилотного исследования по изучению транскриптомов двух типов бляшек — стабильной атеросклеротической бляшки фиброзного вида и нестабильной атеросклеротической бляшки дистрофически-некротического вида.
Цель исследования — выполнить анализ дифференциальной экспрессии генов металлопротеиназ, вовлеченных в процесс стабилизации/дестабилизации атеросклеротической бляшки, методом полногеномного секвенирования РНК и определить уровень металлопротеиназ в гомогенатах атеросклеротиче-ских бляшек разного типа методом ИФА.
Материал и методы
Сбор образцов атеросклеротических бляшек проводился в ФГБУ НМИЦ им. академика Е. Н. Мешал-
кина Министерства Здравоохранения РФ. Исследование одобрено Этическим комитетом НИИТПМ — филиала ИЦиГ СО РАН. В исследование были включены мужчины (возраст 45-65 лет), жители Западно-Сибирского региона с диагнозом коронарный атеросклероз без острого коронарного синдрома со стабильной стенокардией напряжения II-IV функционального класса (ФК), подтвержденный данными коронароангиографии. Для каждого пациента заполнялся протокол исследования, проводился забор крови и тканей атеросклеротической бляшки в ходе операции при наличии интраоперационных показаний. У лиц, включенных в исследование, эндартери-оэктомия выполнена на коронарных артериях, от каждого пациента получены образцы атеросклеро-тических бляшек. Каждый фрагмент полученного материала атеросклеротических бляшек симметрично разделен на 3 части для гистологического, биохимического и молекулярно-генетического исследований.
Исследование соответствует стандартам надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинской декларации. Все пациенты были ознакомлены с целями и основными положениями исследования, дали информированное согласие на участие в исследовании.
Гистологическое исследование всех образцов выполнено в патоморфологической лаборатории ФГБУ НМИЦ им. акад. Е. Н. Мешалкина Минздрава России (рук. лаборатории д.м.н. профессор Волков А. М.). После макроскопического описания образцов, включающего описание степени распространенности бляшки, уровня стенозирования просвета артерии, наличия кровоизлияния в структуры бляшки, участков обызвествления, тромбов и окрашивания образцов гематоксилин-эозином и Ван Гизон, проводился гистологический анализ фрагментов интимы/медии коронарных артерий на бинокулярном микроскопе с цифровым фотовыходом Axiostar Plus (Carl Zeiss, Германия). В ходе гистологического анализа определяли разные стадии формирования бляшки, с подробным описанием состояния покрышки бляшки, её эндотелиальной поверхности, ядра бляшки, периферии бляшки/очага, клеточно-элементного состава всех компонентов атеросклеро-тического очага.
Из 144 образцов в 15 случаях определена стадия липидных пятен/полосок, в 58 случаях нестабильные бляшки, в 71 — стабильные атеросклеротические бляшки (из них атероматозная бляшка стабильная молодая — 24 образца, атероматозная бляшка с фиброзом/кальцинозом стабильная — 47 образцов).
Нестабильная атеросклеротическая бляшка определялась как повреждённая бляшка с толщиной фиброзной покрышки менее 65 мкм, инфильтрированная макрофагами и Т-лимфоцитами (более 25
клеток в поле зрения диаметром 0,3 мм), с крупным липидным ядром (>40%). Был определен тип нестабильных бляшек [13]: 1) липидный тип — фиброате-рома с тонкой фиброзной покрышкой; 2) воспалительно-эрозивный тип — бляшка с повышенным содержанием протеогликанов или воспалением, приводящим к эрозии и тромбозу; 3) дистрофически-некротический тип — бляшка с кальцинированным ядром. Из 58 образцов нестабильных бляшек было 12 бляшек липидного типа, 4 бляшки с воспалением/ эрозией и 42 бляшки дистрофически-некротического типа.
Фрагменты образцов замораживали в жидком азоте и гомогенизировали в растворе фосфатно-соле-вого буфера (рН 7,4) для проведения биохимических исследований.
В гомогенатах фрагментов интима/медии методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов BCM Diagnostics определяли уровни деструктивных биомаркеров MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-9, TIMP-1 на анализаторе Multiscan EX (Thermo Fisher Scientific, США).
После проведения гистологического исследования и определения типов бляшек было выполнено полногеномное секвенирование РНК для двух образцов атеросклеротических бляшек в двух повторах: стабильной атеросклеротической бляшки фиброзного вида и нестабильной атеросклеротической бляшки дистрофически-некротического вида. Пациенты для включения в исследование транскриптома были выбраны по следующим критериям: оба пациента мужского пола, близкого возраста (61 год и 64 года); диагноз (Ишемическая болезнь сердца. Стенокардия напряжения III функциональный класс. ПИКС. ХСН IIA ст. ФК III NYHA); во всех трех образцах атеросклеротических бляшек, полученных от каждого пациента, тип и вид бляшек был однороден для каждого из пациентов по результатам гистологического исследования.
Для предотвращения деградации РНК, пробы ткани атеросклеротических бляшек помещались в стабилизирующий раствор RNAlater (QIAGEN, Германия) и замораживались для последующей транспортировки. Выделение РНК из образцов проводили при помощи набора РеалБест экстракция 100 (АО Вектор Бест, Новосибирск, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Для детекции выделенной РНК выполнялась реакция обратной транскрипции кДНК с последующей постановкой ПЦР на кДНК гена альфа актина. Подтверждение наличия РНК, качество и количество полученных проб тотальной РНК проверялось методом УФ-спек-троскопии на приборе "Epoch" (BioTek, США). Перед приготовлением библиотек, примеси геномной ДНК удалялись с использованием набора DNA free kit (Ambion, США). Качество извлеченной РНК конт-
Таблица 1
Дифференциальная экспрессия металлопротеиназ нестабильной атеросклеротической бляшки дистрофически-некротического вида и стабильной атеросклеротической бляшки фиброзного вида
Название гена Продукт гена Позиция в хромосоме Идентификационный номер белковой последовательности Изменение уровня экспрессии (Fold change) Нестабильная vs стабильная бляшки Pзначение
MMP2 Желатиназа А chr16:55514444-55540603 NM_001302509 2.095 <0,000
chr16:55515468-55540603 NM_001127891 2.095 <0,000
chr16:55513909-55540603 NM_001302510 2.095 <0,000
chr16:55512741-55540603 NM_001302508 1.963 <0,000
chr16:55513080-55540603 NM_004530 1.963 <0,000
MMP3 Стромелизин -1 chr11:102706527-102714420 NM_002422 0.496 <0,253
MMP7 Матрилизин chr11:102391238-102401484 NM_002423 21.915 <0,000
MMP8 Коллагеназа 2 chr1 1:102582525-102595685 NM_002424 11.883 <0,000
MMP9 Желатиназа В chr20:44637546-44645200 NM_004994 8.253 <0,000
MMP12 Макрофагальная металлоэластаза chr11:102733459-102745764 NM_00242 8.155 <0,000
MMP13 Коллагеназа 3 chr11:102813720-102826463 NM_002427 2.260 <0,218
MMP14 Матриксная металлопротеиназа мембранного типа 1 chr14:23305741-23316808 NM_004995 0.897 <0,029
ролировалось с помощью системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Tec. Inc., США). Подготовка библиотек для секвенирова-ния проводилась с использованием набора Illumina's TruSeq RNA Sample Preparation Kit (Illumina, США). Количественный анализ библиотек выполнялся на флуориметре Qubit® 2.0 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, США), качество библиотек контролировалось с использованием системы капиллярного электрофореза Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Tec. Inc., США). Полногеномный профиль экспрессии в тканях бляшек определялся с помощью высокопроизводительного секвенирования на приборе HiSeq 2000 (Illumina, США).
Анализ данных секвенирования включал картирование данных на геном человека версии GRCh38 с помощью программы BWA 0.7.12, расчет RPKM (reads per kilobase per million mapped reads) для всех генов, присутствующих в аннотации используемой версии генома человека.
Для выявления транскриптов генов со статистически значимыми различиями в экспрессии между типами бляшек, использовали следующие параметры: FDR <0,05, более чем 8-кратные различия (-3<log2 fold_change <+3), экспрессия одного и того же гена в одном из типов бляшек на уровне более 50 RPKM. Сравнительный анализ белковых взаимодействий выполнялся при помощи программы STRING 10.5 (http://string-db.org).
Статистическую обработку результатов проводили в программе SPSS (13.0). Значения в таблицах представлены как M±m, где М — среднее арифметическое значение, m — ошибка среднего. Для оценки формы распределения признаков использовали тест Колмо-
горова-Смирнова, при р>0,05 распределение считалось нормальным. Достоверность различий между средними значениями оценивали с использованием ^критерия Стьюдента (для признаков с нормальным распределением) или критерия Манна-Уитни (для признаков с не нормальным распределением). Множественное сравнение между группами проводили методом дисперсионного анализа с использованием критерия ВопГеггош для нормального распределения и методом Краскела-Уоллиса для ненормального. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты
Было проведено транскриптомное профилирование двух типов бляшек — стабильной атеросклероти-ческой бляшки фиброзного вида и нестабильной ате-росклеротической бляшки дистрофически-некротического вида — у двух неродственных пациентов, с последующим анализом дифференциально экс-прессирующихся генов. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Пациент 1 (61 год) — стабильные атеросклероти-ческие бляшки фиброзного вида в трех образцах коронарных сосудов. По результатам гистологического исследования образцы представлены резко сте-нозирующими просвет сосуда бляшками (70-75%) из плотной соединительной ткани, состоящей из кол-лагеновых и эластических пучков волокон, с крупным формирующимся кальцификатом. Без клеточной активности. Стадия фиброза и кальциноза.
Пациент 2 (64 года) — нестабильные атеросклеро-тические бляшки дистрофически-некротического вида в трех образцах коронарных сосудов. По резуль-
Таблица 2
Содержание матриксных металлопротеиназ в атеросклеротических очагах разных стадий развития (М±т)
Гомогенаты Показатели 1. Липидное пятно/ полоска 2. Бляшка стабильная молодая 3. Бляшка стабильная фиброзная 4. Бляшка нестабильная * - р<0,05
Т1МР-1, нг/мг белка 203,4±20,1 92,5±8,8 1201 ±19,9 1172±11,3 1-2,3,4
ММР-1, пг/мг белка 91,45±276 104,6±21,4 111,33±23,7 208,6±41,8 4-1,2,3
ММР-3, нг/мг белка 4,0±0,4 4,6±0,5 3,2±0,3 1,9±0,2 2-4
ММР-7, нг/мг белка 1,53±01 1,74±01 1,69±01 2,31±0,2 4-1,2,3
ММР-9, нг/мг белка 2,6±0,4 2,9±0,4 3,8±0,4 6,2±0,6 4-1,2,3
татам гистологического исследования образцы представлены резко стенозирующими просвет сосуда бляшками (70-80%), с участками рыхлой и плотной фиброзной ткани с очаговыми некрозами и отложениями солей кальция, содержащими небольшие ядра из аморфных масс и пенистых клеток с умеренной мононуклеарной инфильтрацией. Толстая покрышка представлена плотной фиброзной тканью с разрывами. Интима сосуда умеренно утолщена за счет плотной фиброзной ткани с инфильтрацией пенистыми клетками и плотно соединена с покрышкой бляшки.
Разница в экспрессии между типами бляшек была отмечена в генах матриксных металлопротеиназ: ММР2, ММР3, ММР7, ММР8, ММР9, ММР12, ММР13 и ММР14.
Наблюдалось 8-кратное статистически значимое увеличение уровня экспрессии ММР9 (р<0,001) в нестабильных атеросклеротических бляшках дистрофически-некротического вида.
Для ММР1, экспрессия которой ранее была показана в атеросклеротических бляшках [14], нами не было выявлено достоверных различий в уровне транскрипции между двумя изученными типами бляшек (р=0,565). Анализ транскриптов показал присутствие обеих из известных изоформ гена ММР1.
Не было получено статистически значимых различий в изменении уровнях экспрессии генов ММР3 (р=0,253), ММР13 (р=0,218).
Уровень экспрессии менее 50 ЯРКМ и менее чем 8-кратные различия получены для генов ММР2, ММР7, ММР8, ММР12 и ММР14. Уровень экспрессии ММР2, ММР7, ММР8, ММР12 в нестабильной бляшке в 2, 21, 11 и 8 раз, соответственно, выше, чем в стабильной. Для ММР2 выявлены все пять известных изоформ, различающиеся местом старта транскрипции. Для ММР14, напротив, выявлен сниженный уровень экспрессии в нестабильной бляшке по сравнению со стабильной.
Результаты ИФА-анализа изменения активности деструктивных ММР-1, 3, 7, 9 и их тканевого ингибитора Т1МР-1 при формировании атеросклеротиче-ского очага в зависимости от стадии липидного пятна/полоски до нестабильной бляшки в гомогена-
тах фрагментов интима/медии для 144 образцов представлены в таблице 2.
Уровень Т1МР-1 в стабильных молодых и фиброзных бляшках, и в нестабильных бляшках был ниже, чем в липидных пятнах (в 2,2, 1,7 и 1,7 раза), не достигая при этом уровня статистической значимости. Т1МР-1, являясь ингибитором ММР-1, ММР-3, ММР-9 и связываясь с активным каталитическим центром ММР, блокирует их активность, образуя нековалентные комплексы (например, комплекс Т1МР-1/ММР-3) [14]. Сниженное содержание Т1МР-1 в сформированных атеросклеротических бляшках (и стабильных, и нестабильных) свидетельствует о потенциально повышенной ферментативной активности в них деструктивных ММР.
Исследование содержания ММР-7, которая, кроме собственной активности еще является активатором про-ММР-9, а также содержания самой ММР-9, выявило их повышение в нестабильных бляшках в сравнении с липидными пятнами (в 1,5 и 2,4 раза) и молодыми стабильными бляшками (в 1,4 и 2,1 раза). Таким образом, по мере развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки в нем снижается активность Т1МР-1 и повышаются уровни ММР-7 и ММР-9, что отражает наиболее выраженные процессы деструкции соединительнотканного матрикса в нестабильной бляшке, в ее фиброзной покрышке, что приводит к ее истончению, иссечению, надрыву/разрыву.
Обсуждение
В данном исследовании выявлена повышенная экспрессия гена ММР9 в нестабильной атеросклеро-тической бляшке. Высокая концентрация ММР-9 наблюдалась у пациентов с выраженными изменениями структуры бляшек, гистологически доказанным разрывом бляшки, внутрибляшечными кровоизлияниями, спонтанной эмболизацией по сравнению с бляшками у пациентов с менее выраженной симптоматикой атеросклероза [2, 6, 7]. Таким образом, полученные ранее данные изменения концентрации белка ММР-9 в процессе дестабилизации бляшки были нами подтверждены при транскриптомном профилировании на материале атеросклеротических
бляшек. ММР-9 может быть рассмотрена как наиболее перспективный маркер процесса дестабилизации бляшки.
Результаты, полученные для генов ММР2, ММР7, ММР8, ММР12, ММР13 и ММР14 могут быть обусловлены индивидуальными различиями обследованных пациентов и требуют дальнейшего изучения транс -криптов данных генов на расширенной выборке пациентов.
Результаты ИФА позволили выявить особенности, характерные для нестабильной бляшки: повышение уровней деструктивных металлопроте-иназ MMP-7 и MMP-9 и снижение уровня их ингибитора TIMP-1. В результате инфильтрации покрышки атеросклеротической бляшки макрофагами и Т-лимфоцитами увеличивается продукция в ней воспалительных цитокинов, ингибирующих пролиферацию ГМК и синтез ими коллагена, а также индуцирующих апоптоз ГМК и протеоли-тическую активность макрофагов. В результате макрофаги и ГМК начинают секретировать проте-олитические MMP, разрушающие коллагены и эла-
Литература
1. Roth GA, Johnson C, Abajobir A, Abd-Allah F, et al. Global, Regional, and National Burden of Cardiovascular Diseases for 10 Causes, 1990 to 2015. J Am Coll Cardiol. 2017 Jul 4;70(1):1-25. doi:10.1016/j.jacc.2017.04.052.
2. Johnson JL. Metalloproteinases in atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 2017;816:93-106. doi:101016/j.ejphar.2017.09.007.
3. Bourboulia D, Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): Positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Seminars in Cancer Biology. 2010;3:161-8. doi: 101016/j. semcancer.2010.05.002.
4. Loffek S, Schilling O, Franzke C-W. Biological role of matrix metalloproteinases: a critical balance. European Respiratory Journal. 2011;38:191-208. doi:101183/09031936.00146510.
5. Brew K, Nagase H. The tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): an ancient family with structural and functional diversity. Biochimica et Biophysica Acta. 2010;1803(1):55-71. doi:101016/j.bbamcr.2010.01.003.
6. Newby AC. Metalloproteinase production from macrophages — a perfect storm leading to atherosclerotic plaque rupture and myocardial infarction. Experimental physiology. 2016;1:1327-37. doi:101113/EP085567.
7. de Nooijer R, Verkleij CJ, von der Thuesen JH, et al. Lesional overexpression of matrix metalloproteinase-9 promotes intraplaque hemorrhage in advanced lesions, but not at earlier stages of atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2006;26:340-6. doi:101l161/01ATV.0000197795.56960.64.
8. Abbas A, Aukrust P, Russell D, et.al. Matrix metalloproteinase 7 is associated with symptomatic lesions and adverse events in patients with carotid atherosclerosis. PLoS One. 2014;9(1):e84935. doi:101371/journal.pone.0084935.
стин покрышки бляшки, что приводит к ее истончению/иссечению, изъязвлению, тромбозу и соответствующим клиническим проявлениям острого коронарного синдрома [11, 15].
Заключение
Для гена ММР9 получены статистически значимые различия уровня экспрессии в стабильной атеро-склеротической бляшке фиброзного вида и нестабильной атеросклеротической бляшки дистрофически-некротического вида.
При проведении иммуноферментного анализа выявлено, что в липидных пятнах и молодых стабильных атеромах коронарных артерий повышена концентрация матриксной металлопротеиназы 3 типа (ММР-3) и снижена активность тканевого ингибитора металлопротеиназ (Т1МР-1). В нестабильных бляшках со склонностью к изъязвлению/разрыву повышены концентрации ММР-1, ММР-7, ММР-9.
Конфликт интересов. Работа выполнена при поддержке РФФИ (№ 17-04-02120) и ГЗ 0324-2018-0001.
9. Lenglet S, Mach F, Montecucco F. Role of matrix metalloproteinase-8 in atherosclerosis. Mediators of Inflammation. 2013;2013:659282. doi:101155/2013/659282.
10. Quillard T, Tesmenitsky Y, Croce K, et al. Selective inhibition of matrix metalloproteinase-13 increases collagen content of established mouse atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2011;31 (11 ):2464-72. doi:101161/ ATVBAHA.111.231563.
11. Johnson JL, Jenkins NP, Huang WC, et al. Relationship of MMP-14 and TIMP-3 expression with macrophage activation and human atherosclerotic plaque vulnerability. Mediators Inflamm. 2014;2014:276457. doi:10.1155/2014/276457.
12. Mahdessian H, Perisic Matic L, Lengquist M, et al. Integrative studies implicate matrix metalloproteinase-12 as a culprit gene for large-artery atherosclerotic stroke. Journal of Internal Medicine. 2017;282(5):429-44. doi:10.1111/joim.12655.
13. Ragino YuI, Volkov AM, Chernyavskyi AM. Stages of atherosclerotic plaque development and unstable plaque types: pathophysiologic and histologic characteristics. Russ J Cardiol. 2013; 18(5):88-95. (In Russ). Рагино Ю.И., Волков А. М., Чернявский А. М. Стадии развития атеросклеротического очага и типы нестабильных бляшек: патофизиологическая и гистологическая характеристика. Российский кардиологический журнал. 2013;18(5):88-95. doi:1015829/1560-4071-2013-5.
14. Lin J, Kakkar V, Lu X. Impact of matrix metalloproteinases on atherosclerosis. Curr Drug Targets. 2014 Apr;15(4):442-53. doi:10.2174/1389450115666140211115805.
15. Ragino YuI, Chernyavsky AM, Volkov AM, Voevoda MI. Factors and mechanisms of instability of atherosclerotic plaque. Novosibirsk: Science. 2008, 41-49 p. (In Russ). Рагино Ю. И., Чернявский А. М., Волков А. М., Воевода М. И. Факторы и механизмы нестабильности атеросклеротической бляшки. Новосибирск: Наука. 2008, 41-49 с. ISBN 978-5-02-023256-3.
