CC BY
173
УДК 618.3-008.6:616.1-07
О.В. Радьков, В.В. Заварин, М.Н. Калинкин
анализ ассоциации полиморфизма вазоактивных генов с преэклампсией
Тверская государственная медицинская академия (Тверь)
Проведен анализ ассоциации полиморфизмов C825T гена субъединицы бета-3 гуанин-связывающего белка (GNB3) и. -786T/C и. Glu298Asp эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) с преэклампсией. Обследовано 124 беременных с преэклампсией и 112 здоровых беременных. Аллель 298Asp гена NOS3 и аллель 825Тгена GNB3 ассоциированы, с преэклампсией. Аллель 298Glu и генотип Glu/GIu гена NOS3, а также аллель 825Cгена GNB3 связаны со снижением, риска заболевания. При. преэклампсии установлено синергическое взаимодействие между полиморфными, локусами GNB3/C825T и. NOS3/(-786T/C), тогда как полиморфный локус NOS3/Glu298Asp оказывает, независимый эффект, в формировании, этого заболевания.
Ключевые слова: преэклампсия, ген GNB3, ген NOS3, мультилокусный анализ
ANALYsis of THE AssociATioN of THE vAsoAcTivE GENEs poLYMoRpmsM wiTH preeclampsia
O.V. Radkov, V.V. Zavarin, M.N. Kalinkin
Tver State Medical Academy, Tver
The association of GNB3 C825Tand NOS3-786T/C and Glu298Asp gene polymorphisms with preeclampsia was studied. A total of 124 pregnant women with preeclampsia and 112 healthy pregnant women were examined. Allele 298Asp of NOS3 gene and. allele 825T of GNB3 gene are associated, with preeclampsia. Allele 298Glu and. genotype Glu/Glu of NOS3 gene, and. allele 825C of GNB3 gene are associated, with reduced, risk of disease. In preeclampsia synergy between polymorphic loci GNB3/C825T and. NOS3/(-786T/C) is established, whereas the polymorphic locus NOS3/Glu298Asp has an independent effect in disease development.
Key words: preeclampsia, GNB3 gene, NOS3 gene, multilocus analysis
Преэклампсия является осложнением беременности с высокой материнской и перинатальной заболеваемостью и смертностью, в реализации которого участвует множество генетических и средовых факторов [12, 14]. Эндотелиальная дисфункция является ведущим фактором патогенеза преэклампсии [4], однако роль оксида азота (N0) в ее реализации при гестационном повышении артериального давления (АД) дискутабельна. Вместе с тем при преэклампсии уровень этого вазодилятатора снижается, что может быть ассоциировано с генетическим полиморфизмом эндотелиальной синтазы N0, кодируемой геном NOS3 [8, 9]. Гуанин-связывающие белки ^-белки) экспрессируются во всех клетках организма и играют главную роль в передаче сигналов от множества рецепторов с поверхности клетки. Минорный аллель 825T гена субъединицы бета-3 G-белка (GNB3) связан с образованием варианта протеина, обладающего повышенной биологической активностью, приводящей к усиленной сигнальной трансдукции [6, 13]. Полиморфизм C825T гена GNB3 ассоциируется с эндотелиальной дисфункцией [6], однако его связь с преэклампсией остается предметом дискуссий.
Необходимо отметить, что преэклампсия является мультифакториальным заболеванием с высоким коэффициентом наследуемости, для которого характерно отсутствие воспроизводимости результатов исследования монолокусных ассоциаций в различных популяциях. Объяснение данного феномена находят в явлении межгенных взаимодей-
ствий [3]. Мультилокусный анализ полиморфизмов генов, влияющих на функцию эндотелия, может выделить патогенетически значимые комбинации локусов, ассоциированных с преэклампсией, для прогнозирования этого осложнения беременности.
Целью исследования явилось проведение анализа ассоциации полиморфизма C825T гена GNB3, а также полиморфизмов -786T/C и Glu298Asp гена NOS3 с преэклампсией.
методика
Обследовано в III триместре 124 беременных с преэклампсией (основная группа) и 112 беременных с нормальным течением гестации (контрольная группа) из популяции русских, проживающих на территории Тверской области. Критерии включения в основную группу: клиническое АД > 140/90 мм рт. ст. и суточная про-теинурия > 0,3 г/л, впервые выявленные после 20 недели гестации [2]. Средний возраст в группах
— 27,6 ± 4,3 и 25,7 ± 3,5 года. По данным суточного мониторирования, среднесуточное систолическое АД в основной группе — 132,57 ± 2,78, в контрольной группе — 109,89 ± 1,53 мм рт. ст. (p = 0,046), среднесуточное диастолическое АД — 81,05 ± 1,99 и 65,45 ± 0,90 мм рт. ст. соответственно (p = 0,032).
Геномную ДНК выделяли из крови сорбентным методом с использованием набора «Diatom DNA Prep 100» (ООО «Лаборатория «Изоген», Россия). Однонуклеотидные полиморфизмы -786T/C (rs2070744) и Glu298Asp (rs1799983) гена NOS3, а также C825T
(rs5443) гена GNB3 типировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием наборов праймеров и аллель-специфических разрушаемых гибридизаци-онных зондов («Applied Biosystems», США). В качестве детектирующего амплификатора применяли систему регистрации ПЦР в реальном времени «ABI Prism 7500» («Applied Biosystems», США).
Статистический анализ данных выполнен с помощью online калькулятора на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http:// ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl). Распределение генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди — Вайнберга с помощью критерия X2, а также при сравнении с параболой DeFinetti. Различия по частоте аллелей и генотипов между группами оценены критерием X2 Пирсона. Для оценки ассоциации генотипов и аллелей с преэклампсией рассчитаны отношения шансов (odds ratio, OR) с 95% доверительным интервалом (confidence interval, CI). Анализ межгенных взаимодействий проведен методом сокращения многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) в среде открытой программы MDR v.2.0 beta8 (http://www.multifactordimensionalityred uction.org). Метод MDR был разработан для моделирования межгенных взаимодействий высокого порядка, которые невозможно оценить с помощью традиционно используемых в генетической эпидемиологии параметрических методов [10].
результаты
Распределение частот генотипов C825T гена GNB3 соответствовало закону Харди — Вайнберга (в группе контроля X2 = 0,21, р = 0,65; среди беременных с преэклампсией х2 = 0,40, р = 0,53). Отмечается ассоциация полиморфизма C825T гена GNB3 с преэклампсией (табл. 1). Так, вариантный аллель 825Т гена GNB3 ассоциирован с преэклампсией, т.к. его носительство увеличивает в 1,6 раза риск этого осложнения беременности. Напротив, аллель С изучаемого полиморфного маркера является «протективным» в отношении преэклампсии. Было показано, что вариант 825Т является аллелем риска преэклампсии независимо от состава исследуемой популяции [13]. Вместе с тем, связь этого генетического маркера с эндотелиальной дисфункцией при чистом варианте преэклампсии
не подтверждена, однако присутствует в случае присоединения HELLP синдрома [6]. Фенотипическими особенностями носителей аллеля 825Т гена GNB3, в отличие от гомозигот СС, могут быть более высокие показатели АД, избыточная масса тела, эндотелиальная дисфункция [6, 12]. Несмотря на это, в российской популяции именно с аллелем дикого типа 825С и генотипом СС установлена ассоциация ишемической болезни сердца [1].
Распределение частот генотипов полиморфизмов гена NOS3 также соответствовало закону Харди — Вайнберга, за исключением генотипов локуса NOS3/Glu298Asp в группе беременных с нормальным течением гестации. Для полиморфизма Glu298Asp в группе контроля х2 = 7,51 (р = 0,006), среди пациенток с преэклампсией X2 = 0,57 (р = 0,45), для полиморфизма -786T/C в аналогичных группах: х2 = 1,44 (р = 0,23) и X2 = 0,49 (р = 0,48) соответственно.
Статистически значимых различий по частоте генотипов и аллелей полиморфизма -786T/C гена NOS3 между группами беременных в нашем исследовании не установлено (табл. 2). Однако мутантный аллель -786Cгена NOS3 связан с проявлениями дисфункции эндотелия и преэклампсией в близкой к нашей восточноевропейской популяции, несмотря на то, что у носителей этого аллеля концентрация NO в плазме крови выше [9, 15].
Полиморфизм Glu298Asp гена NOS3 ассоциирован с преэклампсией. Так, гетерозиготный генотип увеличивает риск преэклампсии в 2,45 раза, а но-сительство аллеля 298Asp — в 1,92 раза. Напротив, присутствие аллеля 298Glu или генотипа Glu/Glu ассоциируется с уменьшением вероятности геста-ционного повышения АД. Кроме того, носительство гаплотипа «Asp298 — 786C-4b» гена NOS3 связано с двукратным увеличением риска преэклампсии при сравнении с гаплотипом «Glu298 — 786T-4b» [8]. Однако утверждению о связи полиморфизма Glu298Asp гена NOS3 с преэклампсией противоречат весьма обширные мультипопуляционные исследования типа «случай — контроль» [7, 14]. С другой стороны, носительство «протективного» аллеля 298Glu ассоциировано с увеличением уровня NO плазме, что, вероятно, может защищать от развития преэклампсии [9].
Проведено моделирование межгенных взаимодействий исследованных полиморфизмов при преэклампсии методом MDR, позволившее выбрать
Таблица 1
Частота генотипов и аллелей полиморфизма C825T гена GNB3 в контрольной группе беременных и группе
пациенток с преэклампсией
Генотипы и аллели Контроль (п = 112) Преэклампсия (п = 124) Критерий X2 (р) OR (95% CI)
Генотип СС 73 (65,2 %) 68 (54,8 %) 0,65 (0,38-1,10)
Генотип СТ 36 (32,1 %) 45 (36,3 %) 5,15 (0,08) 1,20 (0,70-2,06)
Генотип ТТ 3 (2,7 %) 11 (8,9 %) 3,54 (0,96-13,02)
Аллель С 181 (73,0 %) 181 (81,3 %) 4,53 (0,03) 0,62 (0,40-0,97)
Аллель Т 67 (27,0 %) 42 (18,8 %) 1,60 (1,04-2,48)
Таблица 2
Частота генотипов и аллелей полиморфизмов -786T/C и Glu298Asp гена NOS3 в контрольной группе беременных и группе пациенток с преэклампсией
Генотипы и аллели Контроль (n = 112) Преэклампсия (n = 124) Критерий х2 (р) OR (95% CI)
Полиморфизм -786T/C
Генотип ТТ 37 (33,0 %) 32 (25,8 %) 3,75 (0,15) 0,71 (0,40-1,24)
Генотип ТС 62 (55,4 %) 67 (54,0 %) 0,95 (0,57-1,58)
Генотип СС 13 (11,6 %) 25 (20,2 %) 1,92 (0,93-3,97)
Аллель Т 136 (60,7 %) 131 (52,8 %) 2,98 (0,08) 0,72 (0,50-1,04)
Аллель С 88 (39,3 %) 117 (47,2 %) 1,38 (0,96-1,99)
Полиморфизм Glu298Asp
Генотип Glu/Glu 91 (81,3 %) 81 (65,3 %) 8,02 (0,02) 0,43 (0,24-0,79)
Генотип Glu/Asp 16 (14,3 %) 36 (29,0 %) 2,45 (1,27-4,73)
Генотип Asp/Asp 5 (4,5 %) 7 (5,6 %) 1,28 (0,39-4,16)
Аллель Glu 198 (88,4 %) 198 (79,8 %) 6,38 (0,01) 0,52 (0,31-0,87)
Аллель Asp 26 (11,6 %) 50 (20,2 %) 1,92 (1,15-3,21)
комбинации полиморфных локусов, которые имеют наибольшую патогенетическую значимость для развития этого осложнения беременности. Статистически значимой оказалась трехлокусная модель GNB3/C825T х NOS3/Glu298Asp х NOS3/(-786T/C), которая обладает 100% воспроизводимостью (Crossvalidation Consistency) и 84,6% точностью предсказания (Testing Balanced Accuracy) (p = 0,025).
Методом MDR установлено, что наибольшая доля энтропии в отношении статуса «случай — контроль» связана с локусом NOS3/Glu298Asp и равна 14,12 %. Локусы GNB3/C825T и NOS3/(-786T/C) объясняют только 1,31 % и 0,79 % энтропии соответственно. Данные результаты согласуются с результатами монолокусного анализа ассоциаций для локуса NOS3/Glu298Asp. В то же время межгенные взаимодействия пар локусов GNB3/C825T х NOS3/ Glu298Asp и NOS3/(-786T/C) х NOS3/Glu298Asp являются довольно слабыми (0,05 % и 0,56 % энтропии соответственно). Напротив, на долю комбинации локусов GNB3/C825Tх NOS3/(-786T/C) приходится 9,15 % фенотипической энтропии, что демонстрирует выраженный синергический эффект обоих полиморфизмов. На рисунке представлена дендрограмма кластерного анализа результатов моделирования межгенных взаимодействий методом MDR при гестозе. Результаты нашего исследования согласуются с данными о нелинейных эпистатических взаимодействиях полиморфных генов, участвующих в регуляции артериального давления [5, 11].
- NOS3/Glu298Asp
I GNB3/C826T
рис. 1. Дендрограмма межгенных взаимодействий локусов GNB3/C825T, NOS3/(-786T/C) и NOS3/Glu298Asp при преэклампсии.
заключение
Таким образом, аллели 298Asp гена NOS3 и 825T гена GNB3 ассоциированы с гестозом. Аллель 298Glu и генотип Glu/Glu гена NOS3, а также аллель 825C гена GNB3 связаны со снижением риска заболевания, в то время как полиморфный локус NOS3/Glu298Asp оказывает выраженный независимый эффект в формировании преэклампсии, локус NOS3/-786T/C вносит вклад в фенотипическую реализацию этого осложнения беременности преимущественно за счет синергического взаимодействия с полиморфным локусом GNB3/C825T.
литература
1. Ассоциация полиморфного маркера С825Т гена GNB3 с ишемической болезнью сердца / А.Г. Никитин и др. // Генетика. — 2007. — Т. 43, № 8. - С. 1129-1133.
2. Преэклампсия / под ред. Г.Т. Сухих, Л.Е. Мурашко. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 576 с.
3. A flexible computational framework for detecting, characterizing, and interpreting statistical patterns of epistasis in genetic studies of human disease susceptibility / J.H. Moore et al. // J. Theor. Biol. — 2006. — Vol. 241. — P. 252 — 261.
4. Abnormal endothelium-dependent microvas-cular reactivity in recently preeclamptic women / J. Blaauw et al. // Obstet. Gynecol. — 2005. — Vol. 105, N 3. — Р. 626 — 632.
5. Angiotensinogen gene haplotype and hypertension: interaction with ACE gene I allele / C.T. Tsai et al. // Hypertension. — 2003. — Vol. 41, N 1. — P. 9—15.
6. C825T polymorphism in the human G protein beta 3 subunit gene and preeclampsia: a case control study / M.W. Jansen et al. // Hypertens. Pregnancy. — 2004. — Vol. 23, N 2. — P. 211—218.
7. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism (Glu298Asp) and development of preeclampsia:
a case-control study and a meta-analysis / C.K. Yu et al. // BMC Pregnancy Childbirth. — 2006. — Vol. 16. - P. 6-7.
8. Endothelial NO synthase genotype and risk of preeclampsia: a multicenter case-control study / N.C. Serrano et al. // Hypertension. — 2004. — Vol. 44.
- P. 702 — 707.
9. Effects of eNOS polymorphisms on nitric oxide formation in healthy pregnancy and in preeclampsia / V.C. Sandrim et al. // Mol. Hum. Reprod. — 2010. — Vol. 16, N 7. — P. 506 — 510.
10. Moore J.H., Williams S.W. New strategies for identifying gene — gene interactions in hypertension // Ann. Med. — 2002. — Vol. 34. — P. 88 — 95.
11. Multilocus analysis of hypertension: a hierarchical approach / S.M. Williams et al. // Hum. Hered. — 2004. — Vol. 57, N 1. — P. 28 — 38.
12. Nakayama T., Yamamoto T. Comparison between essential hypertension and pregnancy-induced hypertension: a genetic perspective // Endocrine J. —
2009. - Vol. 56, N 8. - P. 921 -934.
13. Role of C825T polymorphism of GNbeta3 gene in preeclampsia / X. Tang et al. // Hypertens. Pregnancy. - 2006. - Vol. 25, N 2. - P. 93-101.
14. Role of inflammatory cytokines and eNOS gene polymorphism in pathophysiology of preeclampsia / A. Singh et al. // Am. J. Reprod. Immunol. -
2010. - Vol. 63, N 3. - P. 244-251.
15. The significance of -786T > C polymorphism of endothelial NO synthase (eNOS) gene in severe preeclampsia / A. Seremak-Mrozikiewicz et al. // J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. - 2011. - Vol. 24, N 3. - P. 432-436.
сведения об авторах
Радьков Олег Валентинович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии Тверской государственной медицинской академии
Заварин Владислав Владимирович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической физиологии Тверской государственной медицинской академии (170100, г Тверь, ул. Советская, 4; тел.: 8 (4822) 32-17-79; e-mail: [email protected]) Калинкин Михаил Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, ректор Тверской государственной медицинской академии
