CC BY
18
Орипнальш досл^ження . JT—1'I'Jl JslJIJullsl
Original Researches 1нфектологш
УДК 616.36-002.12-097:575.174.015.3 DOI: 10.22141/2312-413Х.5.6.2017.122141
Усыченко Е.Н., Усыченко Е.М., Бажора Ю.И.
Одесский национальный медицинский университет, г. Одесса, Украина
Анализ ассоциации полиморфизма генов цитокинов IL-4, IL-10 и TNF с биохимическими и иммунологическими показателями у больных хроническим гепатитом С
For cite: Aktual'naa Infektologia. 2017;5(6):277-281. doi: 10.22141/2312-413x.5.6.2017.122141
Резюме. В статье представлены исследования генетического профиля (IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A) и TNFa (G308A)), клинических и биохимических показателей у 100 больных хроническим гепатитом С, проживающих в Одесском регионе. Проведен их корреляционный анализ с целью выявления возможных маркеров тяжести течения заболевания и его прогноза.
Ключевые слова: хронический гепатит С; прогрессирование заболевания; полиморфизм генов цитокинов
Введение
В настоящее время изучаются связи комбинации различных генов цитокинов с патогенетически значимыми количественными и качественными признаками заболевания. Однако данные о влиянии генотипа по полиморфным вариантам генов цитокинов на изменчивость показателей, значимых для прогрессирования хронического вирусного гепатита, немногочисленны. При этом в исследуемую группу нередко включаются больные как хроническим гепатитом С (ХГС), так и хроническим гепатитом В (ХГВ).
Вирусный гепатит С характеризуется увеличением удельного веса хронических форм, приростом показателей смертности населения от цирроза печени и гепа-тоцеллюлярной карциномы [1, 2].
Вирусный гепатит С является основной причиной формирования хронических заболеваний печени. Это связано с тем, что вирус гепатита С является уникальным адаптогеном, он способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые антигенные варианты, что способствует переходу острого гепатита С в хроническую форму в 70—80 % случаев [3—5].
В формировании различных вариантов течения и исходов гепатита С и В важнейшую роль играет состояние иммунной системы больного [6—8].
Среди многочисленных факторов, которые определяют характер взаимодействия возбудителя и макроорганизма, влияют на хронизацию HCV-инфекции, а
также модифицируют скорость фиброгенеза в печени, особая роль принадлежит генетическим факторам; считается, что полиморфизм генов цитокинов оказывает значительное влияние на характер течения хронического гепатита [9—11].
В исследованиях ряда авторов показано, что генетический статус человека по полиморфным вариантам ряда генов цитокинов является важнейшим фактором, определяющим такие патогенетические признаки течения хронических вирусных гепатитов, как количественное содержание цитокинов, а также уровень биохимических показателей крови [12—14].
Биохимические показатели крови, такие как уровень АлАт, АсАт, билирубина и его фракций, щелочная фосфатаза, служат для определения функционального состояния печени как в норме, так и при различной патологии. Синдром цитолиза оценивается путем определения активности в сыворотке крови печеночных ферментов АлАт и АсАт. Состояние пигментного обмена — по уровню билирубина и его фракций. Синтетическая функция характеризуется уровнем белка, альбу-мино-глобулиновым и протромбиновым индексом.
Функциональное состояние печени, как общеизвестно, определяется на основании оценки показателей синдрома цитолиза, пигментного обмена, синдрома холестаза, мезенхимально-воспалительного синдрома, синтетической функции печени, которую характеризует протромбиновый индекс.
© «Актуальная инфектология», 2017 © «Actual Infectology», 2017
© Издатель Заславский А.Ю., 2017 © Publisher Zaslavsky O.Yu., 2017
Для корреспонденции: Усыченко Е.Н., Одесский национальный медицинский университет, Валиховский переулок, 2, г. Одесса, 65082, Украина; e-mail: redact@i.ua
For correspondence: E.N. Usychenko, Odessa National Medical University, Valikhovskiy lane, 2, Odesa, 65082, Ukraine; e-mail: redact@i.ua
В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение индивидуального ответа организма больного на воздействие вируса гепатита С и В путем выявления возможной ассоциации полиморфных вариантов генов Ш-4, Ш-10 и TNFa с уровнем биохимических показателей.
Учитывая, что анализ данных об ассоциации полиморфизма генов цитокинов с биохимическими показателями у больных ХГС нередко противоречив и зависит от этнической группы, представляется целесообразным провести анализ ассоциации комбинации генов цитокинов Ш-4 (С589Т), Ш-10 ^1082А) и TNFa ^308А) среди лиц, проживающих в Одесском регионе, с клинической симптоматикой заболевания и основными биохимическими показателями.
Целью исследования является корреляционный анализ полиморфизма генов Ш-4 (С589Т), Ш-10 ^1082А) и TNFa ^308А) у больных ХГС с биохимическими и иммунологическими показателями, а также степенью фиброза у больных ХГС.
Материалы и методы
Обследовано 100 пациентов с ХГС, возраст которых варьировал от 18 до 62 лет. Средний возраст пациентов составил 42,00 ± 3,08 года. Пациенты, включенные в данное исследование, находятся на диспансерном учете в гепатоцентре КП «Одесская городская клиническая инфекционная больница». Все пациенты, включенные в исследование, проживают в Одесском регионе, в группах исследования лиц мужского пола было 44 %, а лиц женского пола — 56 %. Длительность болезни не превышает 10 лет.
Группа контроля представлена 30 практически здоровыми людьми, их средний возраст составляет 32,00 ± 1,05 года. Количество женщин и мужчин было одинаковым (15 человек).
При постановке диагноза хронического гепатита С учитывали данные анамнеза и клинические показатели (слабость, повышенная утомляемость, снижение работоспособности, недомогание, потливость, кожный зуд, снижение или отсутствие аппетита, тошнота, чувство тяжести в правом подреберье, неустойчивый стул, желтуха, проявления геморрагического синдрома, гепатомегалия, спленомегалия). У всех больных исследовали общий анализ крови, общий анализ мочи, концентрацию общего билирубина в сыворотке крови и его фракций, активность АЛТ, концентрацию общего белка и его фракций, протромбиновый индекс, щелочную фосфатазу (ЩФ).
Для подтверждения диагноза хронического гепатита С были использованы основные серологические
маркеры (анти-HCV-IgM, качественное и количественное определение РНК HCV с помощью полиме-разной цепной реакции (ПЦР), а также генотипа вируса).
Оценку морфологических изменений в печени (степень активности и выраженность фибротических изменений) проводили по шкале МЕТАУЖ с использованием неинвазивного метода Fibrotest
Молекулярно-генетические исследования включали определение полиморфных вариантов генов Ш-4 (С589Т), т-10 ^1082А), ТОТа ^308А). Полиморфизм изучался при помощи амплификации соответствующих участков генома методом ПЦР. Исследования проводились на базе Немецкого диагностического центра им. св. Павла (г. Одесса).
Определение субпопуляций Т- и В-лимфоцитов ^3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+) проводилось им-мунофлюоресцентным методом с помощью набора моноклональных и поликлональных антител для установления дифференциальных антигенов лимфоцитов человека с использованием иммунофлюоресцентного микроскопа «Евростар».
Результаты иммунологических исследований приведены в виде среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (± т). С целью выявления корреляционных зависимостей между отдельными показателями был применен коэффициент корреляции Спирмена.
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли с помощью критерия X2 Пирсона. Частоты аллелей и генотипов в группах сравнивали с применением критерия х2 Пирсона с поправкой Йетса на непрерывность при числе степеней свободы, равном 1.
Результаты и обсуждение
Клиническое течение ХГС в группе обследованных больных характеризовалось отсутствием цикличности заболевания. Астеновегетативный синдром наблюдался у всех больных (100 %), диспептический — у 86 пациентов (86 %), артралгический — у 41 (41 %). Желтуха наблюдалась редко (11 %), была слабовыраженной и непродолжительной. У большинства больных была обнаружена гепатомегалия (92 %), реже — спленомегалия (45 %).
Анализ биохимических показателей у больных ХГС с разной степенью активности процесса свидетельствует о том, что у большинства обследованных (92 %) уровень общего билирубина оставался в пределах нормы. У больных с умеренной активностью средний уровень общего билирубина составил 21,2 ± 1,4 мкмоль/л.
Таблица 1. Характеристики исследованных полиморфизмов
Ген Полиморфизм Название праймера Нуклеотидная последовательность
С589Т ^2243250 5'-TAAACTTGGGAGAACATGGT-3'
^-10 G1082A ^1800896 5'-ССТ АТС ССТ АСТ ТСС ССТ-3'
TNFа G308A ^1800620 5'-AGG САА TAG GTT ТО AGG GC-3'
278
Ак1гга1'паа р-^ 2312-413Х, е-^ 2312-4148
Ш. 5, N0. 7, 2017
В большинстве случаев отмечалось повышение активности трансаминаз, среднее значение составило: АлАт — 1,39 ± 0,7 ммоль/л/час, АсАт — 1,25 ± 0,8 ммоль/л/час. Тимоловая проба повышалась в среднем до 5,8 ± 0,9 единицы. Индекс де Рити-са (соотношение АсАт и АлАт) в среднем составил 0,87 ± 0,64. Содержание общего белка у больных ХГС составило 74,12 ± 0,72 г/л, альбуминов — в среднем 43,74 ± 0,66 г/л, а глобулинов — 30,38 ± 0,18 г/л, альбу-мино-глобулиновый индекс составил 1,44 ± 0,02. Содержание щелочной фосфатазы оставалось в пределах нормы (91,20 ± 6,72 ед/л). Протромбиновый индекс равнялся в среднем 97,05 ± 0,48 %.
При анализе динамики основных клинических синдромов установлено, что у больных ХГС со степенью
Таблица 2. Иммунологические показатели у больных ХГС и здоровых лиц (M ± m)
Показатель Больные ХГС, n = 100 Здоровые лица, n = 30
CD3+, % 32,29 ± 4,66* 71,81 ± 4,50
CD4+, % 27,97 ± 4,49* 41,22 ± 4,92
CD8+, % 24,07 ± 4,28* 20,51 ± 4,04
CD16+, % 7,89 ± 2,70* 14,14 ± 3,48
CD19+, % 15,29 ± 3,60* 10,83 ± 3,12
Примечание: * — разница показателей достоверна в сравнении с показателями здоровых людей (Р < 0,05).
Рисунок 1. Распределение частоты встречаемости генотипов ^-4 (С589Т) у больных ХГС и здоровых лиц
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
GG GA AA
48
53
Здоровые
Больные ХГС
Рисунок 2. Распределение частоты встречаемости генотипов 10 (1082G/A) у больных ХГС и здоровых лиц
фиброза F0-F1 наблюдалось менее выраженное изменение общего состояния, чем у больных со степенью фиброза F2-F3. Изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у больных ХГС до начала лечения установило достоверно низкую экспрессию CD3+, CD4+, CD16+ и увеличение количества клеток, экспрессирующих антигены CD8+ и CD19+, по сравнению с показателями здоровых лиц (р < 0,05). При этом значительное снижение количества CD4+ наблюдалось у 65 % больных; снижение CD16+ — у 46,97 % обследованных больных ХГС (табл. 2).
При исследовании аллельного полиморфизма ГЬ-10 ^1082А), Ш-4 (С589Т) и ТОТа ^308А) выявлены существенные различия в контрольной и исследуемой группах больных.
У здоровых лиц значительно преобладал гомозиготный генотип СС Ш-4 (С589Т) (рис. 1). У больных ХГС также отмечалось его преобладание, но в значительно меньшей степени (р < 0,05, х2 = 4,77). Кроме того, у больных ХГС значительно чаще встречался гетерозиготный генотип СТ т-4 (С589Т) (р < 0,05, х2 = 6,78). У здоровых лиц частота аллели С составила 0,9; аллели Т — 0,1. У больных — соответственно 0,81 и 0,19.
У здоровых лиц преобладал гомозиготный генотип СС т-10 (1082G/A) (р < 0,05, х2 = 9,33). При исследовании полиморфизма ГЬ-10 (1082G/A) у больных ХГС установлено преобладание гетерозиготной аллели (комбинация GА у 53 % больных) (р < 0,05, х2 = 6,44). У здоровых лиц частота аллели G составила 0,6; аллели А — 0,4. У больных — соответственно 0,46 и 0,54 (рис. 2)
При изучении аллельного полиморфизма TNFa ^308А) в контрольной группе выявлено преобладание гомозиготного типа генотипа GG TNFa ^308А) у 91 % (р < 0,05, х2 = 50,88). У больных ХГС отмечалось преобладание гетерозиготной аллели GA (77 %) (р < 0,05, х2 = 47,88). У здоровых лиц частота аллели G составила 0,93; аллели А — 0,07. У больных — соответственно 0,58 и 0,42 (рис. 3).
Для оценки ассоциации активности воспалительного процесса, степени изменений печеночной ткани, показателей клеточного иммунитета и аллельного полиморфизма генов все больные были разделены на три
Рисунок 3. Распределение частоты встречаемости генотипов TNFa (G308A) у больных ХГС и здоровых лиц
группы: с отсутствующим или минимальным фиброзом ^0^1) — 46 %, умеренным фиброзом ^2) — 31 % и с выраженным фиброзом ^3) — 23 %.
Взаимосвязь фиброза печеночной ткани, показателей клеточного иммунитета и аллельного полиморфизма исследуемых генотипов оценивали при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена.
Установлено наличие следующих корреляционных связей:
— прямая корреляционная связь между генотипами Ш-4 и содержанием CD3+, р < 0,05 (большее содержание CD3+ отмечается у носителей генотипа СС, меньшее — у носителей генотипа ТТ);
— прямая корреляционная связь между генотипами Ш-4 и активностью АлАт и АсАт, р < 0,01 (меньшая активность АлАт и АсАт отмечается у носителей генотипа СС, большая активность — у носителей генотипа ТТ);
— обратная корреляционная связь между генотипами TNFa и активностью АлАт и АсАт, р < 0,01 (меньшая активность АлАт и АсАт отмечается у носителей генотипа GG, большая — у носителей генотипа АА);
— обратная корреляционная связь между содержанием CD3+ и активностью АлАт и АсАт (низкое содержание CD3+-клеток соответствует более высокой активности трансаминаз), р < 0,05.
Выраженность некровоспалительного процесса в печеночной ткани была более значительной при быстром прогрессировании фиброза. Можно предположить, что комбинации генотипов СС Ш-4 и GG TNFa обладают противовоспалительной активностью, так как они доминируют у больных со степенью фиброза F0-F1 и менее выраженным дисбалансом иммунного статуса. Возможно, комбинации генотипов ТТ Ш-4 и АА TNFa ассоциируются с профиброгенным эффектом, так как они обнаружены у пациентов с фиброзом F2-F3.
Таким образом, при ХГС носители генотипов ТТ Ш-4 и АА TNFa характеризуются более высоким уровнем повреждения гепатоцитов и степенью выраженности мезенхимального воспаления.
Наличие взаимосвязи активности трансаминаз, иммунологических показателей и определенных генотипов Ш-4 и TNFa позволяет использовать полученную информацию как один из критериев активности воспалительного процесса в печени. Выраженность изменений показателей клеточного иммунитета является дополнительным критерием степени морфологических нарушений в печеночной ткани.
Выводы
Полученные данные могут помочь практическому врачу-клиницисту в прогнозировании течения ХГС, что непосредственно взаимосвязано с индивидуальным планом ведения пациента с хроническим гепатитом С.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.
References
1. Ivashkin VT, Iushchuk ND, Kozhevnikova GM, Maevs-kaia MV, Maev IV. Recommendations for diagnostics and treatment of adults patients with hepatitis C. Rossiiskii zhurnal gas-troenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2013;23(2):41-70. (in Russian).
2. Kozko VN, Antsyferova NV, Solomennyk AO, Kopiychenko Yal. Clinical and epidemiological characteristics of chronic form of HCV-infection. Hepatology. 2012;4(18):77-83. (in Ukrainian).
3. Ivashkin VT. Immune homeostasis and immune liver diseases. Rossiiskii zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2009;19(3):4-12. (in Russian).
4. Kanda T, Yokosuka O, Omata M. Hepatitis C virus and hepatocellular carcinoma. Biology (Basel). 2013 Mar; 2(1):304-316. doi: 10.3390/biology2010304.
5. Kucheryavy YuA, Stukova NYu, Ahtayeva ML. Chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma - links in one and the same chain. Klinicheskie perspektivy gastroenterologii, gepatologii. 2012;5:3-11. (in Russian).
6. Lobzln YuV, Nikitin VYu, Sukhina LA, Tsigan VN, Mitin YuA. Immunopathogenesis of viral hepatitis С Immunological markers of the disease progression. Journal of microbiology, epidemiology andimmunobiology. 2007;6:75-84. (in Russian).
7. Goncharova IA, Gamal Abd El-Aziz Nasr H, Beloborodova EV, Ozhegova DS, Puzyrev VP. Polymorphism of gene modifiers of immune response in liver diseases of different etiologies. Medical genetics. 2010;9(12):20-24. (in Russian).
8. Moroz LV, Jacyk IV. Immunogenetic profile in patients with chronic hepatitis C. Hepatology. 2011;12(2):28-33. (in Ukrainian).
9. Nikolaeva LI, Kolotvin AV, Samokhodskaya LM, et al. Analysis of the influence of genetic factors of hepatitis c virus and gene polymorphism in infected patients on the development of liver fibrosis. Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni . 2012;5:7-13. (in Russian).
10. Samokhodskaya LM, Ignatova TM, Abdullayev SM, et al. Prognostic value of combination of allelic variants of cytokine and he-mochromatosis genes in patients with chronic hepatitis С. Rossiiskii zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2007;17(2):50-56. (in Russian).
11. Avdoshina VV, Konenkov VI, Beloborodova EI, Novitsky VV, Ryazantseva NV, Zima AP. Alleles distribution of polymorphic promoter region c-590t in inter-leukin-4 genes and q-576r and ile-50val regions in il-4 receptor gene il-4ra in patients with HCV-infection. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2007;1:43-46. (in Russian).
12. Goncharova IA, Beloborodova EV, Friedin MB, Beloborodova EI, Chernogoruk GE, Puzyrev VP. Genetic factors determining predisposition to chronic course of virus hepatitis and fibrosis in liver. Molecular Biology. 2008;42(2):238-241. (in Russian).
13. Afzal MS, Tahir S, Salman A, et al. Analysis of inter-leukin-10 gene polymorphisms and hepatitis C susceptibility in Pakistan. J Infect Dev Ctries. 2011 Jul 4;5(6):473-9. PMID: 21727647.
14. Semyonova NA, Ryazantseva NV, Novitsky VV, Bychkov VA, Chechina OYe. Role of IL6 -174C/G gene polymorphism in development of chronic HCV infection. Bulletin of Siberian Medicine. 2010;9(5):93-97. (in Russian).
Получено 11.09.2017 ■
Усиченко К.Н., Усиченко К.М., Бажора Ю.1.
Одеський нацюнальний медичний унверситет, м. Одеса,
УкраУна
AHöAi3 асоцiацií полiморфiзму reHiB цитокiнiв IL-4, IL-10 i TNF з бiохiмiчними й iмуноAогiчними показниками у хворих на хронiчний гепатит С
Резюме. У статй поданi досладження генетичного проф1лю (IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A) i TNFa (G308A)), клiнiчних i бiохiмiчних показниюв у 100 хворих на хротчний гепатит С, якi проживають в Одеському регюш. Проведено ix кореля-цiйний аналiз з метою виявлення можливих маркерiв тяжко-стi перебпу захворювання та його прогнозу K™40Bi слова: xронiчний гепатит С; прогресування захворювання; полiморфiзм генiв цитоюн1в
E.N. Usychenko, E.M. Usychenko, Yu.I. Bazhora Odessa National Medical University, Odesa, Ukraine
The analysis of association of polymorphism of IL-4, IL-10 and TNF cytokine genes with biochemical and immunological indicators in patients with chronic hepatitis C
Abstract. The article presents studies of the genetic profile (IL-4 (C589T), IL-10 (G1082A) and TNF-a (G308A)), clinical and biochemical indices in 100 patients with chronic hepatitis C living in the Odesa region. Possible markers of the severity of disease course and its prognosis were detected.
Keywords: chronic hepatitis C; disease progression; polymorphism of cytokine genes
