CC BY
57
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
© И. В. Тарковская ', О. С. Глотов 2, Е. Ю. Диткина 1, Е. С. Вашукова1, 2, А. С. Глотов 2, Р. В. Курилов 1, И. В. Пугачева1, О. Л. Белоног1, И. А. Махрова1, М. В. Асеев ^ 2, Т. Э. Иващенко 11 2, В. С. Баранов 2
1 ООО «БиоГлот», Санкт-Петербург;
2 ФГБУ НИИАГ Д. О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург,
С Методом ПДРФ-анализа изучен полиморфизм 36 генов, вовлеченных в метаболизм липидов, у 212 женщин в возрасте от 18 до 77 лет, проживающих на территории Северо-Западного региона России (города Санкт-Петербурга). Показана ассоциация полиморфизма некоторых изученных генов с индексом массы тела, обхватом талии, уровнями общего холестерина, холестерина липидов низкой и очень низкой плотности. На основании метода логистической регрессии разработана модель, позволяющая проводить первичную оценку изученных параметров у женщин (индекс массы тела, обхват талии, уровни общего холестерина, холестерина липидов низкой и очень низкой плотности) с помощью тестирования соответствующих генетических маркеров.
С Ключевые слова: полиморфизм генов; метаболизм липидов; ХС ЛПНП; ХС ЛПОНП; гены-кандидаты; ИМТ; ОТ; корреляция; регрессия.
Поступила в редакцию 29.10.2012 Принята к публикации 16.11.2012
УДК 575.17
анализ ассоциации полиморфизма генов метаболизма липидов с индексом массы тела, обхватом талии и параметрами липидограммы крови у женщин
ВВЕДЕНИЕ
Идентификация генов и аллелей, контролирующих сложные признаки, является одной из важных задач генетики человека. Анализ конкретных аллелей, контролирующих подобные признаки, широко применяется в генетике человека, в медицине и криминалистике (Баранов и др., 2009; Аульченко, 2010).
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), избыточная масса тела и ожирение являются главными причинами развития таких болезней как сахарный диабет 2-го типа (СД2), сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), онкологические заболевания и прочих. То, что распространенность ожирения выше в женской популяции, чем в мужской, хорошо известно и подтверждается большим числом исследований (Седлецкий, 2007; Дедов, Петеркова, 2006; Подзолкова, 2006; Чазова, 2010). Данный факт обусловлен особенностями эндокринной функции женского организма. Более того у женщин ожирение может происходить из-за некоторых физиологических состояний, таких как беременность, лактация и климакс.
С 1995 г. по рекомендации Международной группы по ожирению ВОЗ (IOTFWHO) оценка ожирения у взрослых пациентов производится путем подсчета индекса массы тела (ИМТ). В исследованиях Diabetes Prevention Programm (DPP) и Diabetes Prevention Stady (DPS) показано, что снижение массы тела на 7 % от исходной уменьшает частоту развития СД2 на 58 %. Другим критерием ожирения является объем талии (ОТ). ОТ > 90-го перцен-тиля указывает на ожирение центрального типа, которое является ведущим фактором риска развития метаболического синдрома (МС) и его осложнений: СД2 и атеросклероза (Рахимова, 2009; Поляков, 2009).
Также фактором риска развития этих заболеваний является нарушение метаболизма липидов. Повышенные уровни общего холестерина (ХС), холестерина липопротеинов низкой (ХСЛПНП) и очень низкой плотности (ХСЛПОНП) могут приводить к таким заболеваниям как ИБС, заболевания коронарных артерий или инсульт. Результаты крупных клинических и генетических исследований показали, что снижение плазменных уровней общего ХС и ХСЛПНП приводит к достоверному снижению риска возникновения ИБС и общей смертности (Preventionof Coronary Heart Diseasein Clinical Practice,1998).
На сегодняшний день роль наследственности в генезисе ожирения не вызывает сомнений (Седлецкий, 2007). Еще в 1962 году американский ученый Neel J. V. в своей теории «экономного генотипа» показал генетическую предрасположенность к ожирению (Neel, 1962).
Ожирение относится к группе мультифакториальных заболеваний (МФЗ), в развитии которых важную роль отводят наследственному фактору (Ройт-берг, 2007). Изучение данного типа заболеваний включает в себя комплексный подход — это и выявление генов-кандидатов, и геномный поиск с использованием множества полиморфных маркеров, исследования аллельных вариантов в генных сетях (Дедов, Шестакова, 2006; Баранов и др., 2009).
экологическая генетика человека
67
Таблица 1
клиническая характеристика исследуемой группы
Признак Min значение признака Max значение признака Среднее значение признака
ИМТ 16,7 47,3 25,3
Холестерин 2,5 9,3 5,4
ЛПНП 0,7 7,1 3,2
ЛПОНП 0,1 1,5 0,6
Обхват талии 57 120 79,7
В настоящий момент уже открыто множество генов, участвующих в развитии ожирения. Возможность выявления соответствующих генов, вероятно, позволит системой мероприятий предотвратить развитие тяжелых форм ожирения и связанных с ним осложнений у людей с наследственной предрасположенностью к МС на догоспитальном этапе, а также позволит выделить различные подтипы ожирения, связанные с СД, ССЗ (Walley, 2006).
Генетические и физиологические основы липидного метаболизма хорошо изучены как на модельных объектах, так и на примере моногенных заболеваний. Не будет преувеличением сказать, что уровень липидов в крови человека — один из наиболее хорошо генетически изученных сложных количественных признаков человека (Friedlander et. al., 1997; Pillia et al., 2006). Более того, в отличие от большинства сложных количественных признаков человека для уровней липидов известен ряд генов, вариация которых объясняет существенную долю дисперсии признака в популяции, например аллели e2/3/4 гена APOE (Singand Davignon, 1985; Аульченко, 2010).
Важно отметить, что использование традиционных методов статистики для анализа фенотипических признаков человека при изучении большого числа генов не позволяет дать объективную оценку количественных признаков, и существуют серьезные ограничения по статистическим методам обработки данных при их анализе (Реброва, 2003). Поэтому одной из наиболее подходящих для анализа количественных фенотипических показателей является обобщенная линейная регрессионная модель (GLM), которая позволяет работать с непрерывными значениями.
Изучение генетических профилей человека еще далеко от завершения, есть значительный простор для дальнейшего анализа генетического полиморфизма и геномных профилей, влияющих на уровни липидов в сыворотке крови. В связи с этим использование линейной модели для поиска ассоциаций геномных полиморфизмов с уровнем липидов в крови в популяции человека и их прогноза является актуальным.
Поэтому целью данной работы являлся анализ ассоциации полиморфизма генов метаболизма липидов с ИМТ, ОТ и уровнями общего холестерина, холестерина липидов низкой и очень низкой плотности в крови у женщин и разработка общей модели предсказания данных фенотипических признаков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика группы
В группу вошли 212 женщин в возрасте от 18 до 77 лет, проживающие на территории Северо-Западного региона России. Средний возраст группы составил 40,9 ± 13,1 лет. Все участники исследования подписали информированное согласие на участие в НИР и заполнили анкеты, содержащие следующие данные: индивидуальную информационную карту с личными данными (место рождения, возраст, сведения о родственниках, образовании, работе, физической активности, питании, привычках и др.), антропометрические данные, сведения о распределении жира, болезнях и лекарствах, операциях и др. Кроме того, в рамках исследования был проведен анализ следующих биохимических показателей — уровень глюкозы, общий ХС, ТГ, ХСЛПВП, ХСЛПНП, ХСЛПОНП, инсулин, НОМА-Н в сыворотке крови натощак (в утренние часы).
НОМА-Н = (инсулин плазмы натощак (мкЕд/мл) х глюкоза плазмы натощак (ммоль/л))/22,5.
Клиническая характеристика исследуемой группы представлена в таблице 1.
Молекулярно-генетические исследования: анализ ДНК-полиморфизма
Образцы ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).
Методом ПЦР-ПДРФ анализа изучены 36 полиморфных ДНК-локусов:
ге3791675 EFEMP1, ге6763931 ZBTB38, ге1812175 ИИ1Р, ге6830062 ЬСОНЬ, ге4842838 ADAMTSL3, ге2554380 ADAMTSL3, ге1035569 С^И13, ге849140 JAZF1, ге5742694 I GFBP3, ге907806 IGF1R, ге572169 GИS-R, ге4800148 CABLES1, ге1904559 IFNG, ге731236 VDR3, ге2568958 NEGR1, ге7498665 SИ2B1,
rs4410646 GHR, rs2075356 GHRL, rs1800629 TNF-а, rs2716609 LPIN1, rs9340799 ESR1, rs10146997 NRXN3, rs545854 MSRA, rs987237 TFAP2B, rs2013751 CEL, rs174570 FAD s2/s3,
rs4938303 кластер АРОА1/АРОС3/АРОА4/АРОА5, rs5128 АРОА1/АРОС3/АРОА4/АРОА5, rs1800588 ПРО, rs3890182 АВСА1, ге16996148 СЖР, rs6754295 АРОВ, rs5888 SCARB1, ге34845087 11РЕ, rs10865710 PPARG, ге1801282 PPARG (табл. 2).
Таблица 2
Размеры ПЦР-продуктов, ферменты гидролиза, ожидаемые размеры фрагментов ДНК после анализа и соответствующие генотипы
Ген Номер rs Замена Эндонуклеаза Ожидаемые размеры фрагментов ДНК
EFEMP1 rs3791675 G>A Alu I G/G 198 + 33нп G/A 231 + 198 + 33 нп A/A 231 нп
ZBTB38 rs6763931 G>A BstDE I G/G 179 нп G/A 162 + 27 нп A/A 179+162 + 27 нп
HHIP rs1812175 A>G Taq I A/A 250 нп A/G 250 + 224 + 26 нп G/G 224 + 26 нп
LCORL rs6830062 A>G BamH I A/A 196 нп A/G 196+138 + 58 нп G/G 138 + 58 нп
ADAMTSL3 rs4842838 G>T Hind III G/G 289 нп G/T 289 + 267 + 22 нп T/T 267 + 22 нп
ADAMTSL3 rs2554380 T>C BstNS I T/T 205 + 69 нп T/C 274 + 205 + 69 нп C/C 274 нп
CDH13 rs1035569 A>G Hinf I A/A 210 нп A/G 210+187 + 29 нп G/G 187 + 29 нп
JAZF1 rs849140 A>G Fsp4H I A/A 219 нп A/G 219+140 + 79 нп G/G 140 + 79 нп
IGFBP3 rs5742694 T >G Fok I T/T 200 нп T/G 200+143 + 57 нп A/A 143 + 57 нп
IGF1R rs907806 A>G Bsc4 I A/A 246 нп A/G 246 + 222 + 24 нп G/G 222 + 24 нп
GHS-R rs572169 G>A BspAC I G/G 114 + 96нп G/A 211 + 114 + 96 нп A/A 211 нп
CABLES1 rs4800148 G>A Acl I G/G 185 + 89нп G/A 274+ 185 + 89 нп A/A 274 нп
IFNG rs1904559 G>A Ags I G/G 141 нп G/A 141 +95 + 46 нп A/A 95 + 46 нп
VDR3 rs731236 T>C Taq I T/T 292 нп T/C 292+ 190+ 102нп C/C 190+102 нп
NEGR1 rs2568958 C>T Bst4C I C/C 140 + 22нп C/T 162+140 + 22 нп T/T 162 нп
SH2B1 rs7498665 A>G BstMW I A/A 154 нп A/G 154+132 + 22 нп G/G 132 + 22 нп
GHR rs4410646 A>C Bse1 I C/C 150 + 68нп C/A 218+ 150 + 68 нп A/A 218 нп
GHRL rs2075356 A>G Acu I A/A 179 нп A/G 179+ 126 + 53 нп G/G 126+53 нп
TNF-a rs1800629 G>A Bsp19 I G/G 208 + 20нп G/A 228 + 208 + 20 нп A/A 228 нп
LPIN1 rs2716609 T>C Hae III T/T 247 нп T/C 247+151+96 нп C/C 151+96 нп
Таблица 2 (Продолжение)
Ген Номер rs Замена Эндонуклеаза Ожидаемые размеры фрагментов ДНК
ESR1 rs9340799 A>G Xbal A/A 228+19нп A/G 47 + 228+19 нп G/G 247 нп
NRXN3 rs10146997 A>G Rsa I A/A 156 + 99 нп A/G 156 + 99 + 77 + 27 нп G/G 156 + 77 + 27 нп
MSRA rs545854 G>C Bst6 I G/G 141 нп G/C 141+77 + 67 нп C/C 77 + 67 нп
TFAP2B rs987237 A>G Fae I A/A 173+72нп A/G 245+173 + 72 нп G/G 245 нп
CEL rs2013751 A>G Acc36 I A/A 119+93нп A/G 212+119 + 93 нп G/G 212 нп
FAD s2/s3 rs174570 C>T Bse8 I C/C 212 нп C/T 212+109+ 103нп T/T 109+ 103 нп
APOA1 APOC3 APOA4 APOA5 rs4938303 G>A Mbo II G/G 271 нп G/A 271 + 149+122 нп A/A 149+122 нп
APOA1 APOC3 APOA4 APOA5 rs5128 C>G EcoICR I C/C 212 нп C/G 212+135 + 71 нп G/G 135 + 71 нп
UPC rs1800588 C>T Fae I C/C 235 нп C/T 235+ 164 + 71 нп T/T 164 + 71 нп
ABCA1 rs3890182 G>A Ags I G/G 166 нп G/A 166+91+75 нп A/A 91+75 нп
CILP rs16996148 G>T Fae I G/G 122нп G/T 122 + 97 + 25 нп T/T 97 + 25 нп
APOB rs6754295 A>C Bsc4 I A/A 219 нп A/C 219+ 199 + 20 нп C/C 199 + 20 нп
SCARB1 rs5888 C>T BstDE I C/C 143 нп C/T 143+122 + 21 нп T/T 122 + 21 нп
LIPE rs34845087 C>G Fsp4H I C/C 121 + 50 + 15нп C/G 171 + 121+50+15 нп G/G 171 + 15 нп
PPARG rs10865710 C>G Fae I C/C 155+88нп C/G 242+ 155 + 88 нп G/G 242 нп
PPARG rs1801282 C>G BstFN I C/C 399 нп C/G 399 + 369 + 30 нп G/G 369 + 30 нп
Для идентификации всех анализируемых SNP подобраны специфические эндонуклеазы рестрикции и соответствующие олигонуклеотиды для проведения ПЦР. Размеры ПЦР-продуктов, а также использованные для гидролиза эндонуклеазы и размеры ДНК-фрагментов после гидролиза также представлены в таблице 2.
Реакционная смесь (25 мкл) ПЦР содержала 0,4 пмо-ля каждого праймера (исходная концентрация раствора праймеров 10 рто1/и1), 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,6), 166 мМ ^Н4)^04, 0,01 % Тритон Х-100, 1,5 мМ Mga2, 0,2 мМ каждого из dNTP («Силекс», Россия) и 2,5 ед. акт. Tаq-полимеразы («Силекс», Россия), 100 нг—200 нг ДНК.
Для амплификации исследуемых фрагментов использовали следующий температурный режим ПЦР:
после предварительной денатурации ДНК (5 минут при 95 оС) проводили 35 циклов амплификации в режиме: 94 оС — 30 с, 60 оС — 30 с, 72 оС — 1 мин, далее заключительный этап синтеза при 72 оС — 5 мин.
ПЦР продукты подвергали гидролизу эндонуклеа-зами рестрикции (табл. 2) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя («СибЭнзим», г. Новосибирск).
Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью электрофоретического разделения в 6%-м неденатурирующем полиакриламидном геле, который далее окрашивали в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) с последующей визуализацией ДНК на аппарате Praktika (ФРГ) в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue (LKB, Великобритания).
Статистическая обработка результатов Индекс массы тела рассчитывали по формуле:
I =
m h2
где: т — масса тела в килограммах, h — рост в метрах.
Для анализа корреляции между генами и признаками применен метод ранговой корреляции по Кендаллу (т). Данный метод позволяет сравнивать качественные порядковые признаки между собой (генотипы) и качественные порядковые признаки (генотипы) с количественными (ИМТ, уровень ХС и т. д.) (Реброва, 2003).
Для построения модели предсказания количественных признаков (ИМТ, ОБ, ХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПОНП) применяли логистическую регрессию. В качестве исходных параметров модели использовались данные об аллелях индивидуумов по рассматриваемым SNP: гомозиготы по аллели, имеющей большую частоту (в исследуемой популяции), получали код «0», гете-розиготы — код «1», гомозиготы по аллели, имеющей меньшую частоту — код «2».
Формула для линейной регрессионной модели в общем виде:
Г = в0 + I в.х. = в0 + в, х, + в Х2 +...+ в„Хп
]
где У — это значение предсказываемого признака, в0 — свободный член, х. — параметр, соответствующий j-му SNP у индивидуума, может принимать значения {0, 1, 2}, в. — соответствующий регрессионный коэффициент при параметре х. (т. е. соответствующий j-му SNP).
Далее методом пошагового включения/удаления параметров (stepwise algorithm) в случае каждого признака была определена наиболее точная модель и, соответственно, наиболее значимые параметры (SNP). В качестве критерия точности модели использовали информационный критерий Акайке (AIC), который может быть выражен в виде:
AIC = 2k + n(ln(RSS))
где k — число параметров модели, n — число индивидуумов, по которым строится модель, а RSS = Ё е2 (residual sum of squares — остаточная сумма квадратов), где е. разность реального и предсказанного моделью значения рассматриваемой^ признака у i-го индивидуума. Средняя ошибка =l/n ^ Ё е.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Частоты аллелей по проанализированным 36 генам, вовлеченным в метаболизм липидов, у 212 женщин, проживающих на территории Северо-Западного региона России (города Санкт-Петербурга) представлены в таблице 3.
При сравнении частот аллелей вышеперечисленных генов между группой жителей Санкт-Петербурга и «усредненной» европейской популяцией, представленной в базе NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/SNP), популяционные идентификаторы: «НарМар-СЕи», «САиСЗ», «AFD_EUR_PANEL»), статистические значимые отличия были выявле-
Частоты генотипов и аллелей по всем исследуемым генам в группе женщин N = 212
Таблица 3
Гены Номер rs Генотипы и их частоты Аллели и их частоты
EFEMP1 rs3791675 A/A G/A G/G A G
0,123 0,401 0,476 0,323 0,677
ZBTB38 rs6763931 A/A G/A G/G A G
rs1812175 0,156 0,557 0,288 0,434 0,566
HHIP rs1812175 A/A A/G G/G A G
0,033 0,208 0,759 0,137 0,863
LCORL rs6830062 A/A A/G G/G A G
0,759 0,208 0,033 0,863 0,137
ADAMTSL3 rs4842838 G/G G/T T/T G T
0,208 0,486 0,307 0,45 0,55
ADAMTSL3 rs2554380 C/C T/C T/T C T
0,071 0,311 0,618 0,226 0,774
CDH13 rs1035569 A/A A/G G/G A G
0,462 0,415 0,123 0,67 0,33
A/A A/G G/G A G
JAZF1 rs849140 0,156 0,533 0,311 0,422 0,578
IGFBP3 rs5742694 G/G T/G T/T G T
0,061 0,363 0,575 0,243 0,757
IGF1R rs907806 A/A A/G G/G A G
0,783 0,203 0,014 0,884 0,116
Таблица 3 (Продолжение)
Гены Номер rs Генотипы и их частоты Аллели и их частоты
GHS-R rs572169 A/A G/A G/G A G
0,080 0,434 0,486 0,297 0,703
CABLES1 rs4800148 A/A G/A G/G A G
0,580 0,377 0,042 0,769 0,231
IFNG rs1904559 A/A G/A G/G A G
0,028 0,231 0,741 0,144 0,856
VDR3 rs731236 C/C T/C T/T C T
0,146 0,458 0,396 0,375 0,625
NEGR1 rs2568958 C/C C/T T/T C T
0,104 0,467 0,429 0,337 0,663
SH2B1 rs7498665 A/A A/G G/G A G
0,396 0,448 0,156 0,62 0,378
GHR rs4410646 A/A C/A C/C A C
0,783 0,212 0,005 0,889 0,111
GHRL rs2075356 A/A A/G G/G A G
0,849 0,137 0,014 0,917 0,083
TNF-а rs1800629 A/A G/A G/G A G
0,019 0,212 0,769 0,125 0,875
LPIN1 rs2716609 C/C T/C T/T C T
0,028 0,255 0,717 0,156 0,844
ESR1 rs9340799 A/A A/G G/G A G
0,392 0,491 0,118 0,637 0,363
NRXN3 rs10146997 A/A A/G G/G A G
0,566 0,401 0,033 0,767 0,233
MSRA rs545854 C/C G/C G/G C G
0,755 0,226 0,019 0,868 0,132
TFAP2B rs987237 A/A A/G G/G A G
0,552 0,349 0,099 0,726 0,274
CEL rs2013751 A/A A/G G/G A G
0,335 0,528 0,137 0,599 0,401
FAD s2/s3 rs174570 C/C C/T T/T C T
0,632 0,354 0,014 0,809 0,191
APOA1/APOC3/ APOA4/APOA5 rs4938303 A/A G/A G/G A G
0,453 0,434 0,113 0,67 0,33
APOA1/APOC3/ APOA4/APOA5 rs5128 C/C C/G G/G C G
0,792 0,189 0,019 0,887 0,113
LIPC rs1800588 C/C C/T T/T C T
0,571 0,368 0,061 0,755 0,245
ABCA1 rs3890182 A/A G/A G/G A G
0,009 0,170 0,821 0,094 0,906
CILP rs16996148 G/G G/T T/T G T
0,882 0,118 0,000 0,941 0,059
APOB rs6754295 A/A A/C C/C A C
0,594 0,349 0,057 0,769 0,231
SCARB1 rs5888 C/C C/T T/T C T
0,340 0,476 0,184 0,578 0,422
LIPE rs34845087 C/C C/G G/G C G
0,840 0,151 0,009 0,915 0,085
PPARG rs10865710 C/C C/G G/G C G
0,458 0,458 0,085 0,686 0,314
PPARG rs1801282 C/C G/C G/G C G
0,684 0,302 0,014 0,835 0,165
ны только для маркера rs4842838 гена ADAMTSL3. Данные отличия скорее всего обусловлены большим числом проанализированных жителей Европы по сравнению с нашей выборкой (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/SNP/snp_viewTable.cgi?pop=1371). Распределение соответствующих генотипов по всем генам в исследуемой группе соответствовало распределению Харди-Вайнберга (p > 0,05).
В настоящий момент описано более 100 генов-кандидатов, полиморфизм которых показал положительную ассоциацию с признаками ИМТ, ОТ, ХС, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП. Однако сравнительно мало известно о совместном вкладе генов в фенотип этих признаков. Использование традиционных методов статистики (F-критерий, Хи-квадрат, корреляционный анализ и др.) в прогнозировании количественных фенотипических признаков человека на основании исследования большого числа генов не позволяет создавать эффективные модели по их предсказанию. Это связано с тем, что большинство из них не учитывает при множественных сравнениях эпистати-ческие взаимодействия между генами, а также не позволяет оценивать полученные генетические данные в связи с другими параметрами. Проведя анализ имеющихся ме-
Модели предсказания ИМТ, ОТ, уровней ХС, ХС ЛПН на основе исследуемых генетических маркеров
тодов обработки данных для исследования количественных фенотипических показателей, нами был выбран метод логистической регрессии, эффективно работающей с непрерывными значениями (количественными признаками) (Xu et al., 2010).
При построении модели предсказания для анализируемых признаков мы использовали анкетные данные индивидов (ИМТ, ОТ), биохимические параметры (ХС, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП) и данные об их генотипах по 36 вышеперечисленным маркерам. Проведен анализ моделей с различными параметрами для определения наи более точной модели, позволяющей предсказывать ряд параметров человека с учетом его генетических особенностей. В таблице 4 представлены параметры моделей, наиболее четко описывающие ряд признаков у женщин. Формулы для их расчета представлены в разделе «статистическая обработка результатов».
Известно, что эффективность данных моделей можно оценить на основании скорректированного коэффициента детерминации (adjusted R2), который позволяет сравнивать между собой модели, учитывающие разное число факторов (McCullagh P., Nelder J., 1989). Коэффициент детерминации является одним из основных кри-
Таблица 4
и ХС ЛПОНП (до 9 генов)
Параметры/ гены Значение коэффициента p-value Параметры/ гены Значение коэффициента p-value Параметры/ гены Значение коэффициента p-value
ИМТ Общий ХС ХСЛПНП
Свободный член уравнения 24,09 <2e-16 Свободный член уравнения 4,98 <2e-16 Свободный член уравнения 2,82 <2e-16
ZBTB38 0,93 0,106 LCORL -0,23 0,163 JAZF1 0,25 0,024
HHIP 1,32 0,071 JAZF1 0,29 0,022 IGF1R -0,23 0,154
IGFBP3 1,06 0,089 GHS_R 0,28 0,031 GHS_R 0,21 0,067
IFNG 2,06 0,005 GHR -0,36 0,071 GHR -0,46 0,008
NEGRI -1,00 0,083 TFAP2B 0,24 0,058 TFAP2B 0,17 0,117
NRXN3 1,30 0,055 APOA 0,17 0,164 APOA 0,18 0,106
CEL -1,18 0,040 ABCA1 -0,37 0,073
Скорректированный коэффициент детерминации (adjusted R-squared) 0,065 Скорректированный коэффициент детерминации (adjusted R-squared) 0,065 Скорректированный коэффициент детерминации (adjusted R-squared) 0,06
Средняя ошибка (кг/м2) 4,1 Средняя ошибка (ммоль/литр) 0,95 Средняя ошибка (ммоль/литр) 0,83
Таблица 4 (Продолжение)
Параметры / гены Значение коэффициента p-value Параметры / гены Значение коэффициента p-value
ХСЛПОНП ОТ
Свободный член уравнения 0,54 <2e-16 Свободный член уравнения 78,77 <2e-16
ADAMTSL3 0,06 0,072 ZBTB38 2,31 0,098
ADAMTSL3 -0,06 0,099 HHIP 2,99 0,090
JAZF1 0,05 0,083 IFNG 4,32 0,015
IGFBP3 -0,06 0,065 NEGRI -2,93 0,035
IGF1R -0,08 0,056 LPIN1 -2,73 0,116
VDR3 0,08 0,005 NRXN3 2,84 0,081
GHR -0,07 0,106 CEL -2,04 0,138
NRXN3 0,05 0,134 - - -
TFAP2B -0,05 0,070 - - -
CEL -0,06 0,055 - - -
Скорректированный коэффициент детерминации (adjusted R-squared) 0,101 Скорректированный коэффициент детерминации (adjusted R-squared) 0,059
Средняя ошибка (ммоль/литр) 0,21 Средняя ошибка (см) 10,33
териев, по которым проводится оценка эффективности модели. Его значение изменяется в интервале [0;1]. Данный критерий показывает, насколько полно учитываемые факторы и их комбинации, присутствующие в прогностической модели, описывают изменение значений признака. При значении коэффициента 0 — модель считается неэффективной. Основу оценки эффективности модели составляет анализ наблюдаемых и прогнозируемых значений. Расхождение между этими значениями называется ошибкой прогноза. Поскольку значение ошибки прогноза непосредственно зависит от конкретной выборки по которой строится модель (получение списка значимых параметров (из всех рассматриваемых) и значений коэффициентов для них), то и сама ошибка прогноза является случайной величиной. Для анализа степени влияния слагаемых ошибки на ее значение и применяют коэффициент детерминации Н2, который, по сути, и отображает общий вклад параметров в изучаемый признак.
Как видно из таблицы 4, наиболее высокие показатели коэффициента детерминации получены для параметра ХС ЛПОНП (Н2 = 0.101). Более того, для этого показателя выявлена наименьшая ошибка прогноза значения (+ 0,21 ммоль/литр) по сравнению с ошибкой уровней общего ХС (± 0,95 ммоль/литр) и ЛПНП (± 0,83 ммоль/литр). Полученный нами результат
свидетельствует о большей генетической детерминированности ЛПОНП по сравнению с другими показателями.
Таким образом, используя предложенную нами модель на основании анализа генов: ZBTB38, HHIP, IGFBP3, IFNG, NEGRI, NRXN3, CEL, у индивидов женского пола, можно предсказывать ИМТ с ошибкой + 4,1 кг/м2. Модель предсказания значения объема талии включает вышеперечисленные гены для ИМТ и дополнительно ген LPIN1 (ошибка прогноза ± 10,33 см).
Модели предсказания значения уровня общего ХС строятся на основании анализа генов: LCORL, JAZF1, GHS-R, GHR, TFAP2B, APOA, ABCA1, с ошибкой ± 0,95 ммоль/л; значения ЛПНП на основании анализа генов: JAZF1, IGF1R, GHS-R, GHR, TFAP2B, APOA, с ошибкой + 0,83 ммоль/л; значения ЛПОНП на основании анализа генов: ADAMTSL3 (оба rs), JAZF1, IGFBP3, IGF1R, VDR3, GHR, NRXN3, TFAP2B, CEL, с ошибкой + 0,21 ммоль/л.
Важно отметить, что в моделях фигурируют гены, связь которых с анализируемыми показателями можно объяснить с точки зрения их функции, так и гены, связь которых с изучаемыми параметрами объяснить пока достаточно сложно.
Исходя из полученных результатов, регрессионные модели позволяют проводить первичную оценку ан-
Таблица 5
Значимые результаты корреляционного анализа между генами и параметрами в группе женщин
Ген Параметр Kendall
Таи Z p-value
Общая группа
JAZF1 ЛПНП 0,104 1,915 0,055
ЛПОНП 0,112 1,978 0,048
GHS-R ХС 0,109 1,978 0,048
ОТ 0,111 2,013 0,044 *
IFNG ИМТ 0,165 2,965 0.003
ОТ 0,14 2,494 0,013
VDR3 ЛПОНП 0,146 2,571 0,01
NEGRI ОТ -0,121 -2,2 0,028
GHR ЛПНП -0,127 -2,223 0,026
* несовпадения с моделью
кетных данные индивидов (ИМТ, ОТ) и биохимических параметров (ХС, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП) как количественных признаков. Разработанные модели возможно применять как для оценки риска развития заболевания, прогноза течения, так и для использования в криминалистике с целью первичной идентификации личности.
Для верификации данных, полученных с помощью регрессионных моделей мы использовали метод корреляционного анализа. Для изучения корреляции между генами и анализируемыми признаками был применен метод ранговой корреляции по Кендаллу (т). Данный метод позволяет сравнивать качественные порядковые признаки между собой (генотипы) и качественные порядковые признаки (генотипы) с количественными (Реброва, 2003).
Корреляционный анализ по Кендаллу частично подтвердил ассоциацию между генотипами проанализированных генов и ИМТ, ОТ, уровнями ХС, ХС ЛПНП и ХС ЛПОНП, которые были выявлены с помощью регрессионной линейной модели (табл. 5).
Следует так же отметить, что метод линейной регрессии позволил установить ряд новых связей, не выявленных при использовании метода корреляционного анализа.
Таким образом, гены, выявленные с помощью регрессионной модели и верифицированные корреляционным анализом, безусловно участвуют в определении фенотипических и биохимических особенностей индивидуума. Для некоторых показателей (в группе
женщин) скорректированный коэффициент детерминации (adjustedR2) более 0,1, что свидетельствует о достаточно большой роли генетической компоненты в определении изучаемых признаков. Однако еда, режим питания, физическая активность, стресс, вредные привычки, экология, лекарства — все это может сыграть большую роль в жизни и перекрыть влияние генетических факторов. Полученные результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях, направленных на изучение полиморфизма генов для идентификации личности с помощью ДНК-анализа, и являются важным шагом для развития прикладной генетики в судебной практике.
Работа поддержана государственным контрактом Минобрнауки России № 16.512.11.2035.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аульченко Ю. С., 2010. Разработка и применение методов полногеномного анализа генетических ассоциаций сложных признаков: дис... д-ра биол. наук . Новосибирск. 291 с.
2. Баранов В. С., Иващенко Т. Э, Баранова Е. В., 2009. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПб.: Изд-во Н-Л. С.528.
3. Дедов И.И., Петеркова В. А., 2006. Руководство по детской эндокринологии. М.: Универсум Пабли-шинг. С. 600.
4. Дедов И. И., Шестакова М. В., 2006. Сахарный диабет и артериальная гипертензия. М.: Медицинское информационное агентство. 344 с.
5. Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Д., 1984. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 480 с.
6. Подзолкова Н. М, Кузнецова И. В., Глазкова О. Л., 2006. Ожирение и репродуктивная функция женщины: Учебное пособие. М. 28 с.
7. Поляков В. К., Аверьянов А. П., Болотова Н. В., 2009. Нормативы индекса массы тела и обхвата талии: их роль в диагностике ожирения у детей школьного возраста // Педиатрия. Т. 88, № 6. С. 17-20.
8. Рахимова Г. Н, Азимова Ш. Ш, 2009. Оценка частоты метаболического синдрома среду детей и подростков с ожирением согласно новым критериям Международной Диабетической Ассоциации // Педиатрия. Т. 88, № 6. С. 14-17.
9. Реброва О.Ю, 2002, 2003, 2006. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica. М.: МедиаСфера. С. 312.
10. Ройтберг Г.Е., 2007. Метаболический синдром. М.: МЕДпресс-информ. С. 224.
11. СедлецкийЮ.И., 2007. Современные методы лечения ожирения: Руководство для врачей. СПб.: ЭЛ-БИ-СПб. С. 416.
12. Чазова И. У., Ильина Е. В., Терещенко С. Н., 2010. Поражение сердечно-сосудистой системы на фоне терапии лекарственными средствами, влияющими на аппетит и массу тела // Системные гипертензии. № 1. С. 47-51.
13. Friedlander Y., Austin M.A, Newman B., Edwards K. et al., 1997. Heritability of longitudinal changes in coronary-heart-disease risk factors in women twins / Am. J. Hum. Genet. N 60. P. 1502-1512.
14. McCullagh P., Nelder J., 1989. Generalized Linear Models. Second Edition. Chapman&Hall. CRC. 512 p.
15. Neel J. V., 1962. Diabetes Mellitus: A "Thrifty" Genotype Rendered Detrimental by "Progress"? // Am. J. Hum. Genet. Vol. 14, N 4. P. 353-362.
16. Pillia G., ChenW., Scuteri A., OrruM. et al., 2006. Heritability of cardiovascular and personality traits in 6,148 Sardinians // PLoS Genet. Р. 2.
17. Prevention of Coronary Heart Disease in Clinical Practice. Recommendations of the Second Joint Task Force of the European and other Societies on Coronary Prevention, 1998 // Eur. Heart. J. N 19. P. 1434-1503.
18. Sing C., Davignon J., 1985. Role of the apolipoprotein E polymorphism in determining normal plasma lipid and lipoprotein variation // Am. J. Hum. Genet. Vol. 37. P. 268-285.
19. Walley A. J., Blakemore A.I., Froguel P., 2006. Genetics of obesity and the prediction of risk for health // Hum. Mol. Genet. Vol. 15, N 2. P. 124-130.
20. Xu S, Hu Z, 2010. Generalized Linear Model for Interval Mapping of Quantitative Trait Loci // Theor. Appl. Genet. Vol. 121. N 1. P. 47-63.
21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP.
22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ viewTable.cgi?pop=1371.
ANALYSIS oF ASSoCIATIoN of LIPID METABoLISM GENES polymorphism wITH BMI,
waist circumference and blood lipidogram PARAMETERS IN woMEN
Tarkovskaya I. V., Glotov O. S., Ditkina E. Y., Vashukova E. S., Glotov A. S., KurilovI R. V., Pugacheva I. V., Belonog O. L., Makhrova I. V., Aseyev M. V., Ivashchenko T. E., Baranov V. S.
C summary: Using the PCR-RFLP method we have studied polymorphism of 36 genes involved in lipid metabolism in 212 women, residents of the North-west Region of Russia (St. Petersburg), aged 18 to 77. we found an association of polymorphism in several candidate genes with body mass index, waist circumference, total cholesterol level, low density lipoprotein cholesterol level and very low density lipoprotein cholesterol level. we propose a logistic regression model for a primary assessment of these parameters in women based on corresponding genetic markers tests.
C KEY woRDS: gene polymorphism; lipid metabolism; LDL; VLDL; candidate genes; BMI; WC; correlation; regression.
C Информация об авторах
тарковская Ирина Васильевна — лаборант. ООО «БиоГлот». 197341, Санкт-Петербург, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А.
Глотов олег Сергеевич — к. б. н., с. н. с., н. с., Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. ООО «БиоГлот». 197341, Санкт-Петербург, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. E-mail: olglotov@mail.ru.
Tarkovskaya Irina vasilyevna — laboratory, LLC BioGlot. Kolomyazhs-kiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia.
Glotov oleg Sergeyevich — candidate of biological scientist, senior scientist, laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. Scientist of LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. E-mail: olglotov@mail.ru.
C Информация об авторах
Диткина Екатерина Юрьевна — н. с., ООО «БиоГлот». 197341, Санкт-Петербург, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. Вашукова Елена Сергеевна — биолог, н. с., Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. ООО «БиоГлот». 197341, Санкт-Петербург, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. E-mail: iagmail@ott.ru.
Глотов Андрей Сергеевич — к. б. н., с. н. с., н. с., Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, СПб, Менделеевская линия, д. 3. ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. E-mail: iagmail@ott.ru. Курилов Роман Владимирович — н. с., ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А.
Пугачева Ирина Владимировна — н. с., ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. Белоног Ольга Львовна — н. с., ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коло-мяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А.
Махрова Ирина Александровна — н. с., к. м. н., ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. .
Асеев Михаил Владимирович — к. б. н., с. н. с., н. с., Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, СПб, Менделеевская линия, д. 3. ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. E-mail: iagmail@ott.ru. Иващенко Татьяна Эдуардовна — д. б. н., в. н. с., н. с., профессор, Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, СПб, Менделеевская линия, д. 3. ООО «БиоГлот». 197341, СПб, Коломяжский пр., д. 28, к. 2, пом. 31-Н, лит. А. E-mail: iagmail@ott.ru.
Баранов Владислав Сергеевич — д. м. н., член-корр. РАМН, профессор, зав. лаб., Федеральное бюджетное учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта Северо-Западного отделения РАМН, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний. 199034, СПб, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: iagmail@ott.ru
Ditkina Ekaterina Yuryevna — research, LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. Vashukova Elena Sergeyevna — biolog, laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. Scientist of LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru.
Glotov Andrey Sergeyevich — candidate of biological scientist, senior scientist, laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. Scientist of LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru.
Kurilov Roman Vladimirovich — research, LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. Pugacheva Irina Vladimirovna — researcher, LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. Belonog Olga Lvovna — research, LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. Makhrova Irina Aleksandrovna — Ph.D, research, LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia.
Aseyev Mikhail Vladimirovich — candidate of biological scientist, senior scientist, laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. Scientist of LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru
Ivashchenko Tatyana Eduardovna — professor, doctor of biological sciences, laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. Senior scientist of of LLC BioGlot. Kolomyazhskiy Ave., 28, R. 2, of. 31-H, lit. A, Saint-Petersburg, 197341, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru
Baranov Vladislav Sergeyevich — professor, doctor of biological sciences, head of the laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases. D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS. Mendeleyev Line, 3, Saint-Petersburg, 199034, Russia. E-mail: iagmail@ott.ru
