CC BY
11
УДК 575.86 ГРНТИ 34.03.17
АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА NODX У БАКТЕРИЙ ВИДА RHIZOBIUM _LEGUMINOSARUM, СИМБИОНТОВ БОБОВЫХ TRIFOLIUMИ VAVILOVIA._
DOI: 10.31618/ESU.2413-9335.2020.2.73.662 Аксенова Татьяна Сергеевна, Кимеклис Анастасия Кирилловна
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии,
196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3
АННОТАЦИЯ
Ризобии вида Rhizobium leguminosarum делятся на два биовара в соответствии с растением-хозяином, с которым они вступают в симбиоз: viciae - c бобовыми из трибы Fabeae, trifolii - с бобовыми рода Trifolium. При этом внутри биовара viciae выделяется обособленная группа симбионтов реликтового растения Vavilovia formosa, демонстрирующая анцестральные признаки геномов. В данном исследовании мы сравниваем выборки симбионтов Vavilovia и Trifolium с целью выявления общих закономерностей в строении симбиотических генов. Результаты показывают, что по ряду анцестральных признаков эти группы ризобий сходны между собой. Полученные данные позволяют предположить, что симбионты Vavilovia и Trifolium могут быть также похожи на общего предка вида R.leguminosarum, существовавшего до разделения вида на биовары viciae и trifolii.
ABSTRACT
Rhizobium leguminosarum species is divided into two biovars according to the host plant which they have the ability to nodulate: viciae with legumes from the tribe Fabeae, trifolii with legumes of the genus Trifolium. However, a separate group of symbionts of the relict plant Vavilovia formosa separates from biovar viciae, demonstrating ancestral features of genomes. In this study, we compare the selection of the Vavilovia and Trifolium symbionts in order to identify common patterns in the structure of symbiotic genes. The results show that, both these rhizobia groups share several ancestral features. The data obtained suggest that the symbionts Vavilovia and Trifolium can also show some resemblance to the common ancestor of the species R. leguminosarum, which existed before the division of the species into viciae and trifolii biovars.
Ключевые слова: Rhizobium leguminosarum, симбиоз, ризобии, эволюция ризобий, протосимбионт
Key words: Rhizobium leguminosarum, symbiosis, rhizobia, evolution of rhizobia, protosymbiont
Введение
Ризобии, азотофиксирующие симбионты бобовых, являются удобной моделью для изучения эволюционной симбиогенетики бактерий. Наиболее широко распространённые в умеренных широтах симбиотические азотфиксаторы -бактерии вида Rhizobium ^итШпо&агит (К1). Растения-хозяева ризобий вида Rl относятся к обширному семейству Fabaceae, и их симбионты разделяются по хозяйской специфичности на два биовара: bv. viciae (симбионты вики, гороха, чины, чечевицы и вавиловии) и bv. М/оШ (симбионты клевера) [1].
Недавно было показано, что по типу организации симбиотической части геномов, ризобии Rhizobium ^итШпо&агит bv. viciae можно разделить на две группы [2]. К первой группе относятся симбионты вавиловии красивой, растения, близкого к последнему общему предку всей трибы ЕаЬеае [3]. Ризобии, входящие в эту группу обладают комплексом анцестральных черт генома. Вторая группа - производная или эволюционно «продвинутая». При переходе из анцестральной формы в «продвинутую» происходит компактизация генома, структурная и функциональная, увеличение интенсивности азотофиксации и сужение хозяйской специфичности. Эти данные могут свидетельствовать о том, что ризобии, выделенные из V. /огто&а, близки к протосимбионту трибы ЕаЬеае R. leguminosarum bv. viciae.
В эволюции ризобий Rl имела место еще одна более ранняя дивергенция между R. leguminosarum bv. viciae и R. leguminosarum bv. trifolii, отправной точкой которой являлся протосимбионт всего вида R.. leguminosarum, существовавший до его разделения на биовары viciae и trifolii. В геномах штаммов симбионтов клевера также были найдены анцестральные признаки (в печати), выявленные у симбионтов вавиловии красивой, в то время как у большинства штаммов R. leguminosarum bv. viciae эти признаки утрачены [2]. Исходя из этих данных, можно предположить, что протосимбионт R. leguminosarum мог быть близок к ризобиям клевера.
Один из анцестральных признаков, характерных для всех симбионтов вавиловии и большинства симбионтов клевера, является наличие в nod-опероне гена nodX. Роль гена nodX для симбиоза с клевером не изучена, а его утрата у «продвинутых» штаммов R. leguminosarum bv. viciae связана с сужением хозяйской специфичности и с повышением уровня азотофиксации [4]. В связи с этим целью данного исследования было провести анализ аллельного разнообразия гена nodX у нескольких популяций симбионтов T. repens, T. praetense и V. formosa относительно аллельного разнообразия контрольного гена nodA, который является общим для всего вида R. leguminosarum. Полученные данные позволят приблизиться к пониманию
эволюционных отношений между этими группами симбионтов бобовых.
Материалы и методы
В работе были использованы последовательности генов пвйК и пойХ Я. [е^итгпаагит Ъу. Ы/оШ, симбионтов клевера, и Я. [е^итгпаагит Ъу. ушае, симбионтов вавиловии, и симбиотические регионы из предыдущих работ [5,6], а также референсные последовательности этих генов, доступные в вепБапк (список штаммов, использованных в работе, представлен в таблице 1).
Выравнивание нуклеотидных
последовательностей алгоритмом QustalW, выбор нуклеотидной модели и построение филогении проводились в программе Mega7 [7].
Результаты
Для реконструкции филогении были использованы последовательности генов пойК и
Для амплификации гена nodA использовали праймеры nodA-1
(TGCRGTGGAARNTRNNCTGGGAAA) и nodA-2 (GGNCCGTCRTCRAAWGTCARGTA) [5]; гена nodX - oMP199 (CCATGGGACCATCCAATGAAC) и oMP196 (TTAAGCGACGGAAAGCCTTC) [6]. Секвенирование проводили с помощью генетического анализатора ABI PRISM 3500xl (Applied Biosystems, США) в ЦКП "Геномные технологии и клеточная биология" ФГБНУ ВНИИСХМ.
Таблица 1.
пойХ Я. leguminosarum Ъу. М/оШ, симбионтов клевера, и Я. ^ытто8агит Ъу. ушае, симбионтов вавиловии, из предыдущих работ [8,9], а также референсные последовательности этих генов, доступные в GenBank (таб. 1).
Штаммы, использованные в работе.
Штамм Растение-хозяин Идентификатор записи в GenBank
Rl bv. viciae Vavilovia formosa KY930250- KY930273, MK676140- MK676161
Rl bv. viciae TOM Pisum sativum Afg AQUC01000001 -AQUC01000006
Rl bv. viciae Vc2 Vicia cracca ARDP01000001-ARDP01000143
Rl bv. trifolii CB782 Trifolium semipilosum NZ_CP007067, NZ_CP007070
Rl bv. trifolii CC275e Trifolium repens JRXL01000001-JRXL01000028
Rl bv. trifolii CC278f Trifolium nanum AJUI01000001 -AJUI01000052
Rl bv. trifolii CC283b Trifolium ambiguum AZXS01000001-AZXS01000109
Rl bv. trifolii Rt24.2 Trifolium pratense MAM001000001 -MAM001000179
Rl bv. trifolii SRDI565 Trifolium subterraneum AQUD01000001 -AQUD01000007
Rl bv. trifolii SRDI943 Trifolium subterranium AQUN01000001 -AQUN01000005
Rl bv. trifolii TA1 Trifolium spumosum AKIA01000001 -AKIA01000037
Rl bv. trifolii WSM1325 medditerian clovers NC_012850, NC_012848
Rl bv. trifolii WSM1689 Trifolium uniflorum NZ_CP007045, NZ_CP007048
Rl bv. trifolii WSM2304 Trifolium polymorphum NC_011369, NC_011368
Rl bv. trifolii WSM597 Trifolium pallidum AKHZ01000001 -AKHZ01000053
Rl bv. trifolii Trifolium praetense, Trifolium repens MN747670-MN747700, MN747572- MN747602
Rl bv. viciae 248 Vicia faba ARRT01000001 -ARRT01000007
Рисунок 1. Сравнение филогенй генов nodX и nodA.
Как видно из рисунка 1, для гена nod A характерно четкое распределение на отдельные кластеры штаммов R. leguminosarum bv. trifolii и R. leguminosarum bv. viciae. Для гена nodX такого разделения нет. Напротив, часть
последовательностей nodX R. leguminosarum bv. trifolii кластеризуются вместе с
последовательностями nodX симбионтов вавиловии.
Рисунок 2. Схема расположения sym-оперонов в sym-регионах. Синим цветом обозначены пой-опероны, зеленым - nif и желтым - fix. Шкала вверху рисунка - длина симбиотических регионов, п. о. [9].
При сравнении состава и организации симбиотических регионов (рис. 2) R. leguminosarum bv. trifolii и R. leguminosarum bv. viciae видна очевидная схожесть этих регионов у симбионтов клевера и симбионтов вавиловии, для которых характерна избыточность межгенных расстояний и похожее расположение nod-, nif- иfx-оперонов.
Обсуждение
Несмотря на то, что ризобии вавиловии и клевера не обладают возможностью к перекрестной инокуляции своих растений-хозяев, они обладают рядом общих сходных черт, одним из которых является наличие гена nodX в nod-опероне. Для более глубокого анализа этого сходства мы изучили полиморфизм аллелей гена nodX у выборки ризобий вавиловии и клевера.
В предыдущих работах было показано, что симбионты вавиловии диверсифицированы от симбионтов клевера как по генам домашнего хозяйства, так и по симбиотическим генам [8]. В нашей работе мы наблюдаем такую же диверсификацию для симбиотического гена nodA. Для гена nodX мы видим противоположную картину: некоторые последовательности nodX штаммов симбионтов клевера и симбионтов вавиловии кластеризуются вместе, а разделение на отдельные кластеры не выражено.
Ранее для гена nodX было показано, что что он необходим для симбиоза R. leguminosarum bv. viciae с дикорастущими "афганскими" ("древними") линиями гороха (Pisum sativum) [10]. Для ризобий R. leguminosarum bv. trifolii, симбионтов клевера, и R. leguminosarum bv. viciae, симбионтов вавиловии, характерно присутствие гена nodX в акцессорном геноме, что рассматривается как анцестральный признак [2, 8,
9].
Помимо наличия схожих аллелей гена nodX, у симбионтов клевера и вавиловии обнаруживаются общие анцестральные признаки в строении симбиотического региона генома. Это является еще одним доказательством того, что симбионты вавиловии и клевера могут быть близки к общему предку вида Rl, существовавшего до разделения вида на биовары viciae и trifolii.
Работа поддержана грантами РФФИ № 1834-00839 (содержание и работа с коллекцией симбионтов T. repens и T. pratense) и № 18-31600124 (содержание и работа с коллекцией симбионтов V. formosa).
Список литературы
1. Jordan D.C. Rhizobiaceae. In bergey's manual of systematic bacteriology. Baltimore, MD, 1984.
2. Chirak E. R., Kimeklis A. K., Karasev E. S., et al. Search for ancestral features in genomes of rhizobium leguminosarum bv. viciae strains isolated from the relict legume Vavilovia formosa. Genes. 2019; 10(12): 990. https://doi.org/10.3390/genes10120990
3. Mikic A., Smykal P., Kenicer G., et al., The bicentenary of the research on 'beautiful' vavilovia (Vavilovia formosa), a legume crop wild relative with taxonomic and agronomic potential., Bot. J. Linn. Soc. 2013; 172(4): 524-531. https://doi.org/10.1111/boj.12060
4. Provorov N., Tikhonovich I. Genetic resources for improving nitrogen fixation in legume-rhizobia symbiosis. Genetic Resources and Crop Evolution. 2003; 50: 89-99.
https://doi.org/10.1023/A:1022957429160
5. Haukka, K.; Lindstrom, K.; Young, J.P. Three phylogenetic groups of nodA and nifH genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolates from leguminous trees growing in Africa and Latin America. Appl. Environ. Microbiol. 1998; 64: 419-426.
6. Ovtsyna, A.O.; Rademaker, G.-J.; Esser, E.; Weinman, J.; Rolfe, B.G.; Tikhonovich, I.A.; Lugtenberg, B.J.J.; Thomas-Oates, J.E.; Spaink, H.P. Comparison of Characteristics of the nodX Genes from Various Rhizobium leguminosarum Strains. MPMI 1999; 12: 252-258. https://doi.org/doi:10.1094/MPMI.1999.12.3.252
7. Stecher G, Kumar S, Tamura K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Mol Biol Evol. 2016; 33(7): 18701874. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
8. Kimeklis, A. K., Chirak, E. R., Kuznetsova et al. Rhizobia Isolated from the Relict Legume Vavilovia formosa Represent a Genetically Specific Group within Rhizobium
leguminosarum biovar viciae. Genes. 2019; 10(12): 991. https://doi.org/10.3390/genes10120991
9. Аксенова Т.С. , Чирак Е.Р. , Онищук О.П. и др. Выявление анцестральных характеристик генома у Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. В печати.
1.10. Ma SW, Iyer VN. New Field Isolates of Rhizobium leguminosarum Biovar Viciae That Nodulate the Primitive Pea Cultivar Afghanistan in Addition to Modern Cultivars. Appl Environ Microbiol. 1990; 56(7): 2206-12.
