CC BY
102
—------- —
Анализ активационного профиля лимфоцитов у больных ХОБЛ в период ремиссии и обострения
И.Е. Зильбер1, Н.А. Распопина2, А.Е. Шуганов3, Ж.М. Салмаси3, А.Н. Казимирский3
Несмотря на огромное количество публикаций, посвященных изучению экспрессии поверхностных антигенов лимфоцитов периферической крови при ХОБЛ, до сих пор не разработан алгоритм, позволяющий однозначно интерпретировать получаемые результаты. Этим объясняется и большое количество вопросов, ответы на которые позволят определить не только характер и причины персистирующего воспаления, но и найти патогенетически обоснованное лечение при этом заболевании.
Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, причины воспаления, лечение
Цель исследования - провести анализ активационного профиля лимфоцитов у больных ХОБЛ в период ремиссии и обострения.
Материалы и методы
Исследование проводилось на пациентах 2-х групп:
1 группа - практически здоровые люди в возрасте от 16 до 56 лет (20 мужчин и 4 женщин), 2-я группа -40 мужчин и 12 женщин, страдающих ХОБЛ со 2 степенью тяжести в возрасте от 42 до 70 лет (средний возраст 56,4 ± 1,44 года) [1]. Все пациенты с ХОБЛ имели индекс курения не менее 20 пачка/лет, у них отсутствовали данные об атопии и бронхиальной астмы в анамнезе. Забор крови проводился в период обострения ХОБЛ до назначения ингаляционных глюкокортикостероидов (ИГКС) и/или антибиотиков и при клинически стабильном состоянии в течение последующих 4-х недель. Их 2 группы больных ХОБЛ выделена группа из 10 пациентов, которым были назначены ИГКС (бекламетазон 1000 мкг/сут) на 4 недели.
Оценка функции внешнего дыхания проводилась согласно протоколу «Стандартизация легочных функциональных тестов» Европейского Респираторного Общества с помощью спирометрии на аппарате компьютерного пневмотахографа «Custo Vit» (Австрия). Оценивались показатели: - FEV1, FEV1%, FVC, FVC, а также величина дыхательного сопротивления - ВДС (комплексный показатель бронхиальной обструкции, не зависящий от влияния способности пациента выполнять дыхательный маневр).
В соответствии с поставленной задачей исследования использовали метод непрямой иммунофлюоресценции для определения относительного и абсолютного содержания в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD56, CD72; мембранные иммуногло-
булины т^М и mIgG с помощью отечественных моноклональных антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Методы исследования и методика их определения описаны в предыдущих наших работах [2, 3]. Проводилось выделение лимфоцитов по методу Воуит в градиенте плотности фиколл-ве-рографии и оценка их жизнеспособности сразу после выделения из крови и подсчета их абсолютного числа в периферической крови [4].
Статистическая обработка полученных результатов с целью оценки достоверности регистрируемых изменений проводили при большой выборке с помощью критерия 1 Стьюдента, при малой выборке с ненормальным распределением, а также при сравнении попарно связанных вариант - с применением непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Расчёты проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ <^а-иэиеа».
Результаты
У больных ХОБЛ оценивали представительство в периферической крови трёх основных популяций лимфоцитов: Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и NK-клеток. Кроме популяционного состава лимфоцитов, нас интересовали и субпопуляции Т- и В-лимфоцитов.
При исследовании основных клеток-защитников в периферической крови Т-лимфоцитов и их субпопуляций при ХОБЛ в период обострения и ремиссии были получены следующие результаты (табл. 1).
Как видно из таблицы у больных ХОБЛ наблюдалось существенное увеличение содержания в крови цитотоксических лимфоцитов, независимо от стадии заболевания (р < 0,001). Однако количество Т-лимфоцитов CD3+ в стадию ремиссии снижено до 52,28 ± 2,27 % по сравнению со здоровыми людьми.
1 Зав. пульмонологическим отделением. МУЗ КБ № 2, 150010, г. Ярославль, ул. Попова, д. 24.
2 ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова. 119991, г. Москва, ул. Грубецкая, 8, стр. 2.
3 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
—------------—
е»с»с>^
Таблица 1. Популяц и обострение (в %' |ионный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных ХОБЛ в ремиссию
Популяции лимфоцитов Маркеры Лимфоцитов Здоровые доноры n = 24 Больные ХОБЛ n = 35
В стадии обострения n = 35 В стадии ремиссии n = 25
Т-лимфоциты CD3 65,20 ± 0,66 61,65 ± 2,95 52,28 ± 2,26**
CD4 36,48 ± 0,95 32,60 ± 0,71* 37,86 ± 2,61
CD8 25,90±0,50 36,23 ± 2,54*** 32,92 ± 1,96**
NK-клетки CD16 13,22 ± 0,43 25,24 ± 3,16*** 22,11 ± 1,07***
CD56 4,47 ± 0,09 22,18 ± 2,13*** 17,94 ± 1,99***
В-лимфоциты CD20 10,15 ± 0,16 26,35 ± 1,92*** 11,56 ± 0,61
CD72 10,10 ± 0,39 18,56 ± 2,34** 10,34 ± 1,40
mIgM 5,13 ± 0,18 29,14 ± 2,18*** 13,13 ± 0,99**
mIgG 6,54 ± 0,48 21,65 ± 1,15*** 12,88 ± 1,60**
Примечание: *p < 0,05 (по сравнению с донорами)
Таблица 2. Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных ХОБЛ в зависимости от наличия или отсутствия терапии ИГКС (бекламетазон)
Популяции лимфоцитов Маркеры Лимфоцитов Здоровые доноры n = 24 Больные ХОБЛ n = 10
До назначения ИГКС Через 4 недели применения ИГКС
Т-лимфоциты CD3 65,20 ± 0,66 52,8 ± 3,3 55,8 ± 4,0
CD4 36,48 ± 0,95 34,1 ± 4,6 31,1 ± 31
CD8 25,90 ± 0,50 28,6 ± 3,3 25,3 ± 31
NK-клетки CD16 13,22 ± 0,43 22,3 ± 1,2 18,4 ± 3,4
CD56 4,47 ± 0,09 20,1 ± 1,3 17,9 ± 4,1
В-лимфоциты CD20 10,15 ± 0,16 21,4 ± 2,1 17,9 ± 1,8
CD72 10,10 ± 0,39 17,1 ± 2,21 14,0 ± 2,54
mIgM 5,13 ± 0,18 23,4 ± 1,1 15,24±1,7*
mIgG 6,54±0,48 19,3 ± 2,7 10,4±2,17*
Примечание: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 (по сравнению с донорами)
При этом в крови больных ХОБЛ в стадии ремиссии выявляется высокое содержание Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD8+ (18,44 ± 4,02 %), и сохраняется повышение уровня цитотоксических лимфоцитов CD8+
При изучении содержания естественных натуральных киллеров в крови клеток (CD56+-лимфо-циты и CD16) (табл. 1) у больных ХОБЛ в период ремиссии было отмечено следующее: сохранялся высокий процент NK-клеток, хотя общее их количество и содержание каждой разновидности уменьшалось после купирования обострения болезни. Для идентификации В-лимфоцитов используются маркеры CD20 и CD72. Исследование содержания B-лимфоцитов в периферической крови больных ХОБЛ при обострении заболевании демонстрирует увеличение всех дифференцированных форм B-лимфоцитов. Их количество повышается более чем в 2 раза (р < 0,0001) по сравнению с данными, полученными у здоровых реципиентов. При этом содержание маркеров CD20+ и CD72+ В-лимфоцитов в крови больных ХОБЛ в стадию ремиссии практически не отличалось от показателей здоровых людей, хотя и были несколько выше.
Анализ содержания в периферической крови зрелых В-клеток, несущих поверхностные иммуноглобулины M и G, показал их существенное увеличе-
ние, независимо от стадии заболевания. При этом в период ремиссии это увеличение особенно выражено: mIgM/mIgG соответственно 5,1/6,5 % против 29,1/21,7 %. Всё это свидетельствует о высокой иммунологической активности В-клеточного звена иммунитета.
Десяти больным ХОБЛ был назначен ИГКС (бекламетазон 1000 мкг/сут) в среднем на 4 недели. Полученные данные представлены в таблице 2.
При анализе различий у больных ХОБЛ до и после 4 недельного применения ИГКС (беклометазон 1000 мкг/сут) отмечены следующие тенденции.
Т - популяция: тенденция к повышению CD3, снижению CD4 и CD8 в группе пациентов ХОБЛ, получавших ИГКС. Отношение CD4, CD8 имеет тенденция к росту.
NK - популяция: тенденция к снижению СD16 и СD56.
В - популяция: тенденция к снижению всех показателей, статистически достоверное снижение процента клеток, несущих mIgM и mIgG.
Хотя применение бекламетазона 1000 мкг/сут в течении 4 недель сопровождалось, на ряду с улучшением клинической симптоматики, положительными иммунологическими сдвигами, но эти изменения за исключением (mIgM и mIgG) были статистически не достоверными.
журнал «Земский Врач» № 1(11)-2012
43
Обсуждение результатов
ХОБЛ - хроническое экологически опосредованное воспалительное заболевание респираторной системы с поражением воздухоносных путей и лёгочной паренхимы с развитием эмфиземы, проявляющееся частично обратимой бронхиальной обструкцией, характеризующееся прогрессированием и нарастающими явлениями хронической дыхательной недостаточности. В основу понимания патогенеза заболевания легло так называемое «аномальное» воспаление. Эксперты GOLD последние годы констатируют, что исследование клеточных и молекулярных механизмов воспаления для поиска лекарственных средств, способных тормозить хроническое воспаление, лежащее в основе ХОБЛ, - одно из важнейших направлений исследований по этой проблеме.
Как известно, популяция Т-лимфоцитов (CD3) представлена различными клонами. CD3-антиген является составной частью мембрано-ассоциированной структуры антигенспецифического Т-клеточного рецептора (^R/CD3), обеспечивающей запуск процессов антигензависимой активации Т-клетки [5]. Другие субсистемы Т-лимфоцитов осуществляют две основные функции - регуляторную и эффекторную. Регуляторные клетки (СD4+-лимфоциты) обеспечивают развитие иммунного ответа другими клетками, регулируют его дальнейшее течение. Они стимулируют клетки иммунной системы через продуцируемые лим-фокины. Кроме того, без их помощи не может реализоваться большинство функций В-лимфоцитов. Согласно нашим данным, количество этих клеток у больных ХОБЛ и в период ремиссии и при обострении не превышает установленной нормы (табл. 1).
Другая субпопуляция Т-лимфоцитов - эффектор-ные Т-лимфоциты (CD8+-лимфоциты) осуществляют эффект иммунологической реакции чаще всего в форме цитолиза клеточных структур, к антигенам которых возникла иммунологическая реакция. CD8+-лимфоциты - основные клетки, оказывающие цитотоксическое действие. И этот процесс у больных ХОБЛ в нашем исследовании высок, не зависимо от стадии болезни.
В норме соотношение CD8+/СD4+-лимфоцитов равно 1:1,9/1:2,4. Однако по нашим данным у больных ХОБЛ это соотношение нарушено, и если количественное содержание СD4+ и при обострении и в период ремиссии соответствует норме, то количество CD8+ в период ремиссии болезни на 14 % и 15,6 % соответственно больше (табл. 1).
Обе эти разновидности Т-лимфоцитов дифференцируются из общих предшественников в мозговом слое тимуса и обладают одинаковыми рецепторами для антигенов с той лишь разницей, что рецептор CD4+-лимфоцита воспринимает антиген от представляющей клетки в комплексе с антигеном МНС II класса, а рецептор СD8+-лимфоцита - в комплексе с антигеном МНС I класса. Поскольку антигены МНС
(главного комплекса тканевой совместимости) II класса имеются лишь на ДНК, а антигены I класса практически на всех клетках, CD8+-лимфоциты вступают во взаимодействие с любыми клетками организма. Основной функцией СD8+-лимфоцитов является цитотоксичность, вследствие чего они играют ведущую роль в противовирусном, противоопухолевом и трансплантационном иммунитете [5, 6]. Следовательно, при ХОБЛ преобладает цитотоксический механизм. При этом не следует забывать, что цитотоксические свойства СD8+-лимфоциты приобретают в ходе диф-ференцировки после контакта с антигеном.
Итак, у пациентов с ХОБЛ наблюдалось существенное увеличение содержания в крови цитотокси-ческих лимфоцитов (р < 0,001) на фоне более низкого, чем у здоровых людей общего содержания Т-лим-фоцитов (52,28 ± 2,27 %) по сравнению со здоровыми реципиентами. При этом в крови больных ХОБЛ, несмотря на стадию ремиссии, происходит активная дифференцировка Т-лимфоцитов-CD3 на CD4+CD8+ (табл. 2) что, по-видимому, является отражением чрезмерной стимуляции Т-клеточного звена иммунной системы и свидетельствует о неспецифическом, т. е. неинфекционном воспалительном процессе у этих пациентов.
Резкое увеличение содержания NK-клеток при ХОБЛ связано с тем, что ИЛ-1 и TNF-a усиливают их пролиферацию [7, 8], а синтез именно этих ци-токинов существенно повышен при ХОБЛ.
Значимое увеличение числа этих клеток у больных ХОБЛ свидетельствует об активном иммунологическом процессе не только в период обострения, но и ремиссии. Возможно высокий процент содержания NK-клеток может быть косвенным подтверждением того, что в поддержании воспалительной реакции имеет значение инфекция дыхательных путей, потому что различные микробные продукты индуцируют нарастание активности NK-клеток [9]. И хотя NK-клетки могут взаимодействовать с определенными типами нормальных клеток, в первую очередь они лизируют клетки, инфицированные вирусами, тем более что инфицированные клетки более чувствительны к лизису естественными киллерами, чем неинфицированные [10-11].
Учитывая высокий уровень NK-клеток при ХОБЛ можно предположить, что немаловажную роль в поддержании воспаления играет микробная персисти-рующая инфекция дыхательных путей и избыточная продукция INF-y в том числе и самими NK-клетками. Секреция IFN-y NK-клетками также может вносить вклад в воспалительный Th1 ответ [12-14].
У больных ХОБЛ, согласно нашим данным, в период ремиссии общее количество В-лимфоцитов соответствует норме, однако в период обострения отмечается выраженная активация этих клеток. При этом почти в 2 раза увеличивается количество клеток, несущих мембранный гликопептид CD72, биологи-
е»с»с>^
ческая роль которого заключается в активации зрелых В-лимфоцитов и в регуляции иммунного ответа при недостаточности его у новообразованных В-лим-фоцитов [15, 16].
Существенное повышение содержания в крови лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные иммуноглобулины, позволяет в свою очередь утверждать, что у больных ХОБЛ В-клеточная активация является отражением постоянно поддерживаемого процесса антигенной стимуляции с хроническим течением.
При этом в период обострения это увеличение особенно выражено: mIgM/mIgG соответственно 29,14 ±2,18 и 21,65 ±1,15. Всё это свидетельствует о высокой иммунологической активности В-клеточ-ного звена, отвечающего за продукцию и секрецию в кровоток антител, являющихся иммунной памятью организма.
При выборе больных для исследования мы исключили всех пациентов с указанием на наличие какой-либо атопии. Следовательно, повышение В-лимфо-цитов отражает сам факт активного воспаления, несвязанного с атопией, и подобно воспалению при аутоиммунном процессе.
При ХОБЛ, независимо от стадии заболевания, наблюдается резкое повышение содержания в крови обеих субпопуляций NK-клеток. В стадии обострения мы наблюдали также и однонаправленное изменение всех субпопуляций В-лимфоцитов в сторону увеличения. И если лимфоциты CD20, CD72 в период ремиссии покидали кровеносное русло, то количество зрелых В-лимфоцитов - антителопродуцентов и клеток иммунологической памяти сохранялось и превышало в
2 раза уровень подобных у здоровых реципиентов. Анализ клеточного состава и их соотношение, клинические данные обследованных пациентов позволяют предположить, что ведущим механизмом воспаления при ХОБЛ является аутоиммунных механизм, постоянно поддерживаемый персистирующей инфекцией дыхательных путей и воздействием факторов внешней среды (например: курением).
Оценка роли и эффективности применения ИГКС при ХОБЛ на уровне клеток иммунной системы нуждается в дальнейшем изучении. Требуется мониторинг иммунологических показателей на большей группе больных и более продолжительной терапии ИГКС с учётом тяжести и динамики клинических проявлений ХОБЛ.
Литература
1. Global Initiative for Chronic Obstruction Lung Disease. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease / Updated 2007. (www.goldcopd.com).
2. Порядин Г В., Солмаси Ж.М., Зильбер И.Е. и др. Особенности поверхностного фенотипа лимфоцитов при ХОБЛ. Х Международный конгресс. «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». С 304. 20-23 мая. 2009. г. Казань.
3. Порядин Г В., Солмаси Ж.М. Макарков А.И. Механизмы регуляции экспрессии поверхностных структур дифференцированного лимфоцита. Им-мунологияю-1997. №3. с. 4-8.
4. Фримель Г Иммунологические методы. Перевод с нем. яз. М. «Медицина». 1987. 472 с.
5. Harnett M., Rigley.K. Thy role of G-proteins versus protein tyrosine kinases in the regulation of lymphocyte activation.// Immunol. Today. 1992. V 13. № 12. P 482-486.
6. Erust P., Gonzaler A.V., Brassard P. et al Inhaled corticosteroid use in chronic obstructive pulmonary disease and the risk of hoapitalization for pneumonia. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 2007; 176; 162-166.
7. Palyutin Sh. Ch.,. Yakusevitch V.V, Zilber I.E «Consumption of antiasthmatic drugs in Yaroslavl (Russia) in 1999-2004 years», Basic&Clinical Pharmacology & Toxicology, Volume 97, Supplement I, 2005. 287. p. 78.
8. Palyutin Sh. Ch., Yakusevitch V.V., Zilber I.E. «Prevalence of smoking between adults patient with bronchial asthma (Yaroslavl-study)», World Asthma Meeting, WAM 2007 «Briging various aspects of asthma», 22-25 June 2007, Final program & Abstract book, TP-094, p. 146.
9. Титов Л.П., Карпов И.А. Противовирусный иммунитет: молекулярно-клеточные механизмы, закономерности развития и иммунопатология // Белорус. мед. журн. 2008. № 3. С. 28-35.
10. Miadonna A. et al. Inhibitory effect of the HI antagonist loratadine on histamine release from human basophils // Int. Arch. Allergy Immunol. 2004. № 105. P 12-17.
11. Claman H.V., James H.H., Maier T. Natural suppressor cell systems // 6th Int. Cong. Immunol. 2006. P. 1035-1039.
12. Бокша В.Г Нарушение дыхательной функции при бронхолегочных и сердечно-сосудистых заболеваниях. Киев, 1991. 200 с.
13. Katchar K, Soderstrom K., Wahlstrom J.,. Eklund , Характеристики естественных киллеров и CD56+ T-клеток у пациентов с саркоидозом. Eur Respir J 2005; 26: 77-85.
14. Jadab A.R., Moher M., Browman G.P, Booker L., Sigonis C., Fuentes M. et all. Systematic reviews and meta-analyses on treatment of asthma: critical evaluation BMJ 2000; 320: 537-40.
15. Ven Kataraman C., Lu PJ., Buhl A.M., Chen C.S., Cambier J.C., Bondada S. CD72- mediated B cell activation involves recruitment of CD19 and activation of phosphatidylinositol 3-kinase // Eur. J. Immunol. 1998-V 28. № 10. P 30033016.
16. Wu H.J., Ven Kataraman C., Estus S., Dong C., Davis R.J., Flavell R.A., Bondada S. Positive Signaling Through CD72 Induces Mitogen - Activated Protein Kinase Activation and Synergizes with B Cell Receptor Signals to Induce X-Linked Immunodeficiency B Cell Prolferation.//J.Immunol. 2001. № 167. P 1263-1273.
The analysis of an activation profile of lymphocytes at patients chronic obstructive illness of lungs in remission and an aggravation
I.E. Zilber, N.A. Raspopina, A.E. Shuganov, G.N. Salmaci, A.N. Kazimirsky
There are many publications devoted to studying of an expression of superficial antigenes of lymphocytes of peripheral blood at chronic obstructive illness of lungs but till now the algorithm allowing unequivocally to interpret received results isn't developed. Therefore there are many questions on mechanisms of development of disease and treatment tactics.
Key words: dironic obstructive illness of lungs, the reasons of an inflammation, treatment.
журнал ««Земский Врач» № 1(11)-2012
45
