Научная статья на тему 'Анаэробное окисление метана в почвах и водных экосистемах'

Анаэробное окисление метана в почвах и водных экосистемах Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
403
78
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МЕТАН / АНАЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА / ДЕНИТРИФИКАЦИЯ / ТОРФЯНЫЕ ПОЧВЫ / METHANE / ANAEROBIC METHANE OXIDATION / DENITRIFICATION / PEAT SOILS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Поздняков Лев Анатольевич, Степанов Алексей Львович, Манучарова Наталия Александровна

Процесс анаэробного окисления метана уже более 30 лет изучается на примере донных морских осадков и пресноводных экосистем. В настоящей работе представлен обзор результатов этих исследований. Демонстрируется возможность протекания данного процесса не только в затопленных, но и в осушенных торфяных, а также в автоморфных дерново-подзолистых почвах. Поглощение метана последними продолжалось после создания анаэробных условий и внесения ингибитора метанмоноокисгеназы (ацетилена). Окисленные соединения (нитраты, сульфаты) стимулировали поглощение газа, восстановленные соединения азота (хлорид аммония) значимых изменений не вызывали. Инкубация с добавлением нитратов и сульфатов в атмосфере аргона и метана приводила к росту доли и численности в почве архей, что согласуется с данными, полученными для водных местообитаний.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Поздняков Лев Анатольевич, Степанов Алексей Львович, Манучарова Наталия Александровна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ANAEROBIC METHANE OXIDATION IN SOILS AND AQUATIC ECOSYSTEMS

The possibility of anaerobic methane oxidation in meliorated peat soils and automorphic sod-podsolic coil was showed. In anaerobic conditions and after acetylene (strong inhibitor of methane monooxygenase) introduction these soils continue methane absorption. This absorption was stimulated by oxidant (nitrate, sulphate) addition, while reducer (ammonium chloride) addition has no influence on it. Anaerobic incubation with methane and oxidant addition results in a growth of percentage and absolute number of archaea, that is conform to data collected during aquatic ecosystems investigation.

Текст научной работы на тему «Анаэробное окисление метана в почвах и водных экосистемах»

УДК 631.46

АНАЭРОБНОЕ ОКИСЛЕНИЕ МЕТАНА В ПОЧВАХ И ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ1

Л.А. Поздняков, А.Л. Степанов, Н.А. Манучарова

Процесс анаэробного окисления метана уже более 30 лет изучается на примере донных морских осадков и пресноводных экосистем. В настоящей работе представлен обзор результатов этих исследований. Демонстрируется возможность протекания данного процесса не только в затопленных, но и в осушенных торфяных, а также в автоморфных дерново-подзолистых почвах. Поглощение метана последними продолжалось после создания анаэробных условий и внесения ингибитора — метанмоноокисгеназы (ацетилена). Окисленные соединения (нитраты, сульфаты) стимулировали поглощение газа, восстановленные соединения азота (хлорид аммония) значимых изменений не вызывали. Инкубация с добавлением нитратов и сульфатов в атмосфере аргона и метана приводила к росту доли и численности в почве архей, что согласуется с данными, полученными для водных местообитаний.

Ключевые слова: метан, анаэробное окисление метана, денитрификация, торфяные почвы.

Введение

Процесс окисления метана в анаэробных условиях был открыт около 30 лет назад в донных морских отложениях и с тех пор изучался в основном на примере водных местообитаний. Для мирового океана к настоящему времени уже произведена количественная оценка роли анаэробного окисления метана в глобальном цикле этого парникового газа: называются суммарные цифры — от 75 до 300 Тг СЩ/год [20]. Уже эти значения не только многократно превосходят интенсивность итогового поступления метана из океана в атмосферу (около 10—15 Тг/год [22]), но и сопоставимы с общей его эмиссией (около 500—600 Тг/год [22]). Экспериментальных данных собрано еще недостаточно, поэтому к указанным цифрам следует отнестись осторожно, но сам порядок величин свидетельствует о значимости процесса в глобальном масштабе, что и определяет актуальность исследований в этой области. Тем не менее попыток оценить значение анаэробного окисления в наземных экосистемах пока вовсе не предпринималось. При рассмотрении баланса метана в почвах по-прежнему предполагается, что в анаэробных условиях имеет место лишь деятельность метаногенов, приводящая к выделению метана, а в аэробных — метанотрофов, заключающаяся в его поглощении.

В первых же работах, посвященных анаэробному окислению метана, было показано, что этот процесс имеет полностью биологическую природу [39]. Изучение анаэробного окисления метана затруднено тем, что проводящие его организмы не удается выделить в чистые или бинарные культуры. Продуктивным оказалось создание и изучение обогащенных культур [1, 2, 17, 32, 34]. Кроме того, для

ряда культивируемых видов метаногенов (Methano-sarcina barkeri, M. acetivorans, Methanobacterium ther-moautotrophicum и др.) быша показана возможность окисления метана в анаэробных условиях [28, 39]. Однако незначительность скоростей этого процесса (на 2—3 порядка меньше интенсивности образования CH4 той же культурой) не позволяет связать наблюдаемые в природе масштабы анаэробного окисления метана с этими организмами. Сообщалось также о возможности соокисления следовых количеств метана чистыми культурами сульфатре-дукторов [19].

К настоящему времени достоверно известно о двух типах анаэробного окисления метана: сопряженного с сульфатредукцией и с денитрификацией. Первый процесс изучен более полно. Считается, что он проводится консорциумом некультивируемых архей групп ANME-1, ANME-2 и ANME-3, родственных различным порядкам метаногенов, прежде всего Methanosarcinales, и эубактерий-сульфатредук-торов, близких представителям родов Desulfosarci-na, Desulfococcus и Desulfolobus [26]. Функционирование консорциума возможно только в строго анаэробных условиях. Окисление метана служит данным организмам источником не только энергии, но и биомассы. Именно благодаря включению обедненного изотопом 13С метана холодных сипов в состав нуклеиновых кислот и липидов удалось установить классификационное положение окисляющих метан анаэробов [21]. Впоследствии были сконструированы специфические зонды и методом FISH доказано существование окисляющего метан консорциума [14, 33]. Биохимия процесса до конца не ясна. Несмотря на активные поиски [27, 32, 37], нерешенным остается вопрос о том, как связан меж-

1 Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-01233 и 07-04-00246.

ду собой метаболизм компонентов консорциума и какое вещество является межвидовым интермедиа-том. На его роль предлагаются водород, ацетат, метанол, формальдегид и др., но весомых доводов в пользу одного из них пока не получено. Не исключена возможность существования организмов, способных проводить процесс от начала до конца и не нуждающихся в агрегации с другими. В этой связи интересны сообщения об обнаружении сво-бодноживущих или образующих микроколонии клеток, прежде всего ЛКМБ-2, но также ЛКМБ-1 и ЛКМБ-З [15, 26, 33].

Использование нитратов и нитритов для анаэробного окисления метана было убедительно продемонстрировано лишь несколько лет назад [34]. Изначально постулировалось, что в этом случае процесс проводится также консорциумом ЛКМБ и некультивируемых эубактерий-денитрификаторов. Однако в ходе дальнейших исследований появились свидетельства, что открытая эубактерия способна окислять метан в анаэробных условиях самостоятельно [17].

Работы по анаэробному окислению метана в отличных от донных отложений природных и техногенных местообитаниях к настоящему времени единичны, хотя и демонстрируют широкую его распространенность. Показано протекание процесса в толще воды пресных озер, где были обнаружены клетки архей групп ЛКМБ-1 и ЛКМБ-2 [15]. Гидрохимические свидетельства анаэробного окисления метана получены для грунтовых вод вблизи мусорных свалок [16]. Есть сообщения об окислении метана в рубце желудка жвачных [23]. Протекание процесса зафиксировано в почвах рисовников [29, 30, 31]. Было показано стимулирующее воздействие на его интенсивность 804" и N0-; относительно Бе3+ и Мп02 полученные результаты противоречивы [25, 31]. Позже анаэробное окисление метана было продемонстрировано в торфяных болотных почвах [36]; авторы связывают его преимущественно с N03— хотя не исключают и участия других соединений, в том числе органических.

В соответствии с вышесказанным нашей целью было установление факта протекания анаэробного окисления метана в незатопленных почвах, пока не затронутых исследователями данного процесса, а также предварительная оценка величин его интенсивности.

Объекты и методы исследования

Работу проводили на торфяных низинных освоенных почвах (классификация 1977 г.) поймы р. Яхромы (Дмитровский р-н Московской обл.). Торфо-образование здесь началось в доледниковое время, до формирования современного русла Яхромы и образования ее аллювиальных наносов. Торф отно-

сится к низинному и отчасти к переходному типам; древесному, травяно-древесному, осоковому, гипново-осоковому и гипновому видам [4, 9]. Его толща несет в себе линзы аллювия и озерных отложений. Обследовали агрополигон «Ближний» ДФ ВНИИМЗ, осушение которого было произведено в 1914 г. и где в настоящее время уровень грунтовых вод поддерживается в среднем в течение года на глубине 1—1,5 м [9]. Общая формула для профиля почв следующая: Апах (0—30 см) — озем-ленный торф без признаков растений-торфообразо-вателей, коричневого цвета с непрочной комковато-глыбистой структурой; Тпереход. (30—50 см) — оземленный, с незначительными остатками растений; Т1 (50—90 см) — среднеразложившийся торф; Т2 (ниже 90 см) — неразложившийся рыжий торф, быстро темнеющий на воздухе, с включениями крупной древесины.

По составу и свойствам почв агрополигон четко делится на прирусловой, центральный и притеррасный участки [4]. В притеррасной части поймы до осушения сформировалось ключевое болото, где аккумулировались вещества, привнесенные с водораздела (карбонаты, соединения железа), и даже сейчас местами происходит выход грунтовых вод на поверхность. Верхний горизонт почв этой части поймы высокозолен (45—85%) и имеет низкую кислотность — рНсол может достигать 7,7. В прирусловой части сформирована другая область аккумуляции минеральных веществ, зольность здесь достигает тех же значений. Центральная часть поймы, напротив, отличается низкой зольностью (10—30%).

Образцы отбирали из пахотного горизонта с глубины 10—30 см при помощи бура. Географические координаты определяли GPS-приемником Garmin GPS-72. Составление карт распределения величин вели при помощи программы Surfer 8.0 с методом интерполяции Kriging.

Учитывая неизученность анаэробного окисления метана в почвах с преобладанием окислительных условий, также была изучена дерново-средне-подзолистая окультуренная почва (классификация 1977 г.), вскрытая под залежью на территории УОПЭЦ МГУ им. М.В. Ломоносова «Чашниково». Был отобран один образец пахотного горизонта.

Производили измерения отклика поглощения метана на внесение в почву акцептора электрона, подобные таковым для затопленных почв [25, 31]. Использовали KNO3 и Na2SO4, для которых была доказана возможность окисления метана. В пени-циллиновых флаконах объемом 15 мл инкубировали образцы почвы массой 3 г. Количество добавляемого KNO3 составляло 0,4 мг/г, как по стандартной методике определения денитрификации ацетиленовым методом [5, 10]. Сульфат натрия вносили в эквивалентном количестве — 0,3 мг/г, полагая, что он будет восстановлен до сульфида, что ха-

рактерно для родственных анаэробным метанотро-фам организмов [6, 26]. Кроме того, добавляли хлорид аммония (0,21 мг/г) и глюкозы (2,5 мг/г). Почву насыщали водой до полной влагоемкости, флакон продували аргоном в течение минуты, затем в него вводили 1 мл ацетилена — ингибитора ММО [3], блокирующего восстановление N2O [5, 10]. Концентрация метана, создаваемая в газовой фазе флакона, составляла 600—900 ppm. Начальное содержание метана измеряли через сутки после внесения субстратов, конечное — через четверо суток инкубации при комнатной температуре.

Также измеряли отклик денитрификации, оцениваемой обычным ацетиленовым методом [5, 10], на добавление в газовую фазу флакона больших количеств (до 10%) метана. В данном случае время инкубации составляло одни сутки.

Концентрацию метана измеряли на хроматографе Chrom-41 с пламенно-ионизационным детектором. Наполнитель колонки — Spherosil, газ-носитель — аргон. Закись азота определяли на хроматографе модели 3700/4 завода «Хроматограф» с детектором по теплопроводности (катарометром) на колонке с адсорбентом Полисорб-1. В качестве газа-носителя служил гелий. Содержание кислорода измеряли на хроматографе Кристалл-5000.1 с детектором по теплопроводности. Объем анализируемой пробы во всех случаях составлял 0,5 см3.

Образцы дерново-подзолистой почвы с добавлением KNO3 и Na2SO4, прошедшие инкубацию по описанной выше методике, а также контрольный образец, подвергшийся перед инкубацией только увлажнению, были изучены методом FISH. Для гибридизации использовали набор рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, разработанных ранее для детекции представителей доменов Bacteria и Archaea (таблица). Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем СуЗ, осуществляла компания Синтол (Москва, Россия).

Для отделения клеток от почвенных частиц 1 г почвы разводили в 10 мл стерильной воды и обрабатывали ультразвуком (2 мин., частота 22 кГц). Для осаждения крупных частиц суспензию несколь-

ко раз центрифугировали по 10 мин.: сначала трижды при 1000 об/мин. (удаляя осадок), а затем при 10 000 об/мин. Полученный осадок ресуспендиро-вали стерильной дистиллированной водой до объема 2 мл. Клетки фиксировали с использованием формальдегида, для чего на водяной бане растворяли 0,4 г параформальдегида в 10 мл фосфатного буфера (pH 7). Осажденные за 5 мин. при 10 000 об/мин. клетки ресуспендировали в 0,5 мл фосфатного буфера (NaCl — 8,0 г, КС1 — 0,2 г, Na2HPO4 — 1,44 г, NaH2PO4 — 0,2 г, H2O — 1 л, рН 7,0) и добавляли 1,5 мл 4%-го раствора формальдегида в фосфатном буфере. После этого их инкубировали при комнатной температуре на качалке в течение 1,5 ч. Затем фиксированные клетки осаждали при 8000 об/мин. в течение 2 мин., двукратно промывали фосфатным буфером и ресуспендировали в смеси этанола и фосфатного буфера (1:1). До анализа образцы хранили при t —20°. Для гибридизации с зондами 1 мл суспензии фиксированного образца наносили на прожелатинен-ные стекла с окошками, разделенными тефлоновым покрытием. Нанесенные на стекла фиксированные препараты клеток обрабатывали раствором лизоци-ма (10 мг в 1 мл 0,05 М ЭДТА и 0,1 М TRIS HCl, 1:1, рН 8,0) для увеличения проницаемости клеточных стенок бактерий. Препараты выдерживали в течение суток при комнатной температуре. Затем стекла последовательно промывали в серии растворов этанола (50, 80, 96%) и высушивали. Саму гибридизацию препаратов с флуоресцентно-мечеными зондами проводили в соответствии с общепринятой методикой [38] при температуре 46°. Условия гибридизации, использованные для различных зондов, приведены в таблице.

Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Mikroskop Axio-skop 2 plus. Численность целевых популяций микроорганизмов в образцах определяли путем учета количества гибридизованных с зондами клеток в 80 полях зрения микроскопа на одной ячейке с последующим пересчетом на 1 г почвы.

Описание использованных нуклеотидных зондов

Зонд Целевая группа организмов Целевой участок 16S pPHK Нуклеотидная последовательность зонда (5'—3') Формамид, %* NaCl, мM** Ссылка

EUB338 I EUB338 II ЕШЗЗ8Ш Bacteria Bacteria (Planctomycetales) Bacteria (Verrucomicrobiales) 338—355 GCT GCC ТСС CGT AGG AGT GCA GCC ACC CGT AGG TGT GCT GCC ACC CGT AGG TGT 20 225 [13]

ARCH915 ARC344 Archaea 915—934 344—363 GTG СТС ССС CGC САА ТТС СТ TCG CGC CTG CTG CIC ССС GT 30 112 [35, 38]

* Концентрация формамида в гибридизационном буфере; ** концентрация NaCl в буфере для промывки.

Результаты и их обсуждение

Влияние добавления акцепторов электрона на анаэробное окисление метана изучали на примере образца почвы центральной части поймы. В контрольном варианте окисление метана происходило со скоростью 22 нмоль/г • сут. Добавление нитратов и сульфатов привело к увеличению поглощения метана по сравнению с контролем на треть (рис. 1). Можно выдвинуть следующие объяснения данного прироста: стимулирование анаэробных ме-танотрофов увеличением доступности акцепторов электрона; стимулирование метанотрофов улучшением условий минерального питания; увеличение соокисления метана при росте анаэробов на иных субстратах; активность аэробных метанотрофов, использующих остаточный кислород во флаконах.

Введение во флаконы ацетилена, являющегося суицидальным ингибитором обеих форм ключевого фермента аэробной метанотрофии — метанмоно-оксигеназы [3], позволяет ожидать полного подавления активности аэробных метанотрофов. Предполагается, что анаэробные метанотрофы используют иную ферментную систему, не подверженную воздействию ацетилена. Важнейшую роль в ней играют ферменты метаногенеза, катализирующие реакции в обратном направлении, что подтверждается подавлением активности процесса 2-бромэтансуль-фоновой кислотой и молибдатом натрия (ингибиторы метаногенеза и сульфатредукции соответственно) [39], а также обнаружением у архей групп ANME-генов метил-СоМ-редуктазы (шсгЛ) и других [18]. Это показано для анаэробного окисления метана, сопряженного с сульфатредукцией; в случае использования соединений азота имеет место пока неизвестный иной механизм, не предусматривающий участия не только метанмонооксигеназы, но и метил-СоМ-редуктазы [17].

Измерения показали, что при использованной нами методике остаточная концентрация О2 в газовой фазе флакона составляла 0,05—0,40%, причем какой-либо зависимости полученных результатов от содержания кислорода не обнаружено. Указанные величины не являются препятствием для развития анаэробов в почве, где анаэробные микрозоны присутствуют даже при инкубации образца в атмосферном воздухе [11, 12]. Напротив, развитие аэробных метанотрофов в данных условиях затруднено. По литературным данным, оптимальное содержание кислорода составляет 15—17% для одних видов и 30—45% для других; при содержании менее 1% показано лимитирование кислородом роста Ме№у1ососсш еарзыШш [2].

В пользу того, что нитраты выступают в нашем случае именно акцептором электрона, говорит увеличение интенсивности денитрификации с 50,0 до 68,6 нмоль ^О/г • сут. при добавлении в газовую фазу флакона метана. Вариант опыта с добав-

Рис. 1. Поглощение метана в анаэробных условиях торфяной почвой: а — без добавления глюкозы, б — с добавлением глюкозы

лением восстановленного соединения азота (N^0) не продемонстрировал ни существенного увеличения, ни подавления поглощения метана. Для большего числа аэробных метанотрофов доступными источниками азота являются как нитраты, так и соли аммония, и в нашем опыте концентрация N^0 не достигала величин, при которых он и другие соединения аммония препятствуют развитию аэробных метанотрофов [2, 24]. Кроме того, при измерении аэробного поглощения метана (без вытеснения воздуха аргоном и добавления ацетилена) мы не наблюдали стимулирования этого процесса внесением нитратов. Добавление глюкозы в контрольный вариант и вариант с хлоридом аммония не вызывало изменений в интенсивности поглощения метана (рис. 1), однако в вариантах с внесением KNOз и №2804 прирост поглощения метана оказывался заметно меньшим, чем без глюкозы.

Можно заключить, что в нашем случае поглощение метана проводится именно специфическими автотрофными анаэробными организмами, по всей видимости, конкурирующими с гетеротрофами за акцептор электрона.

После установления принципиальной возможности анаэробного окисления метана в осушенных торфяных почвах была произведена оценка пространственного распределения потенциальной активности процесса на участке «Ближний». Использовали два показателя — общее поглощение метана в контроле и отклик почвенного микробного сообщества на внесение нитратов как более значимого акцептора электронов в торфяных почвах. Поглощение метана в контроле принимало значения от 6,8 до 35,7 нмоль/г • сут. (в среднем 18,7 нмоль/г • сут.), отклик во всех образцах оказался положительным и составил 0,3—8,6 нмоль/г • сут. (в среднем 3,8 нмоль/г • сут.). Какой-либо зависимости прироста поглощения метана от контрольных значений для того же образца не выявлено, он составлял относительно контроля от 2,3 до 65,7% (в среднем 26%). Эти величины в осушенных торфяных почвах оказались на несколько порядков

Рис. 2. Распределение в пахотном горизонте почв участка «Ближний»: а — величин поглощения метана в контроле, б — прироста

поглощения метана при добавлении К>Ю3

меньше, чем данные, полученные 8. Kumaraswamy с соавт. [25] по близкой методике для затоплен ных почв рисовников: 40 мкмоль/г • сут. в контрольном варианте и 170 мкмоль/г • сут. при добавлении КК03. По данным К.А. 8тето с соавт. [36], для нескольких неосушенных торфяных почв значение средней скорости анаэробного окисления метана составило 17 нмоль/г • сут., что соответствует ~ 1,5 мкмоль/г • сут.

Измеренная нами ранее [8] потенциальная активность метанообразования зависела от положения на кварталах — участках, перпендикулярных руслу Яхромы и различающихся способом сельскохозяйственного использования. По этой же причине поквартальное распределение сформировалось для валового содержания азота [7]. В то же время для потенциального уровня дыхания почвы была обнаружена связь с положением во всех — прирусловой, центральной, притеррасной — частях поймы. Распределение поглощения метана в контроле и его прироста при добавлении нитратов оказалось неоднозначным (рис. 2). При этом наивысших значений прирост поглощения метана достигает на II и III кварталах (нумерация с юго-востока на северо-запад), где метанообразование наименее активное; а наименьших — на I и IV, где оно максимально. Не исключено, что и деятельность анаэробных метанотрофов внесла свой вклад в наблюдаемое варьирование выделения метана почвой. Роль анаэробного окисления метана в балансе этого парникового газа в наземных биогеоценозах еще предстоит выяснить.

Учитывая отсутствие работ, посвященных анаэробному окислению метана в автоморфных почвах, нами был исследован образец дерново-подзолистой почвы водораздела той же почвенно-климати-ческой зоны. Для него также оказались характерны прирост поглощения метана в анаэробных условиях

при добавлении нитратов и сульфатов, нивелирующиеся под действием глюкозы (рис. 3), а также увеличение денитрификации при введении в газовую фазу метана с 62 до 74 нмоль К20/г • сут. Основные отличия могут быть сведены к следующему: во-первых, малое поглощение метана в контроле, сопоставимое со значениями, наблюдаемыми в обогащенных минеральными наносами почвах прирусловой части яхромской поймы; во-вторых, относительный прирост поглощения метана при добавлении нитратов превышал здесь все аналогичные значения, рассчитанные для торфяных почв, достигая 2,6 раза. Абсолютный прирост при этом соответствовал средним значениям для торфяных почв. Исходя из вышесказанного, проводящие процесс микроорганизмы присутствуют и в дерново-подзолистых почвах, функционируя в анаэробных зонах агрегатов и окисляя биогенный метан. Однако здесь метан является менее важным субстратом для анаэробов, чем в осушенных торфяных почвах; меньшее число организмов проводят анаэробное окис-

а б

^ контроль Щ] аммоний I | нитраты ^ сульфаты

Рис. 3. Поглощение метана в анаэробных условиях дерново-подзолистой почвой: а — без добавления глюкозы, б — с добавлением глюкозы

Контроль Метан Метан

и нитраты и сульфаты

6,9% 21,3% 36,4%

Рис. 4. Изменение численности (вверху) и доли (внизу) в почвенном прокариотном сообществе бактерий и архей при добавлении субстратов анаэробного окисления метана

ление метана в обычных условиях, значительно увеличивается их активность при устранении лимитирования по азоту. В связи с этим от дерново-подзолистых почв можно ожидать более резких изменений в структуре микробного сообщества при помещении их в условия, благоприятные для анаэробного окисления метана, чем от торфяных почв. Отличия сообщества, сформировавшегося после вызванной таким образом сукцессии, будут в большей степени обусловлены развитием анаэробных мета-нотрофов. Такая сукцессия была нами запущена и изучена методом FISH.

В образцах, инкубировавшихся четыре дня в атмосфере аргона и метана с добавлением KNO3 и Na2SÜ4, наблюдалось снижение абсолютной численности учитываемых клеток бактерий в 1,8—3,1 раза по сравнению с контролем при одновременном возрастании численности архей в 2,1—2,5 раза (рис. 4). Это вызывало изменение в структуре прокариотно-го сообщества почвы. Если в контроле доля архей не превышала 7%, то в варианте с нитратами она достигала 20%, а в варианте с сульфатами — бо-

лее 35%. Эти данные согласуются с представлениями о структуре микробного комплекса анаэробного окисления метана, сформировавшимся при изучении донных отложений. В состав консорциума, производящего окисление метана при помощи сульфатов, входит в среднем 100 клеток архей групп ANME и 200 эубактерий-сульфатредукторов [14]. При использовании в качестве акцептора электронов нитратов и нитритов соотношение эубактерий и архей оказалось шире и установилось равным 8:1 [34], а через продолжительное время культивации археи оказались вовсе элиминированы [17]. В нашем исследовании в образце с нитратами сохранялась заметно большая популяция эубактерий по сравнению с сульфатами.

Заключение

Впервые показана возможность протекания анаэробного окисления метана с использованием как сульфатов, так и нитратов в незатопленных почвах с преобладанием окислительных условий, в том числе автоморфных. В таких почвах процесс может протекать внутри анаэробных микрозон агрегатов и вносить свой вклад в перехватывание эмитируемого почвой метана на наиболее ранней стадии, еще до того, как он окажется в зоне действия аэробов. Сопряжение анаэробного окисления метана с метанообразованием может быть весьма тесным. Абсолютный прирост поглощения метана в анаэробных условиях при добавлении нитратов (используемых в качестве окислителя) достигает наивысших значений в тех же участках поймы, где потенциальная активность метанообразования была минимальной, и наоборот. При создании благоприятных для развития анаэробных метанотрофов условий интенсивно развиваются археи, особенно в случае окисления метана при помощи сульфатов.

Авторы выражают благодарность И.К. Кравченко (ИНМИ РАН) за помощь в работе и ценные замечания.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Галъченко В.Ф. К вопросу об анаэробном окислении метана // Микробиология. 2004. Т. 73, № 5.

2. Галъченко В.Ф. Метанотрофные бактерии. М., 2001.

3. Гвоздев Р.И, Акентъева Н.П. Современные представления о структуре и функции метанмонооксигена-зы / Биохимия и физиология метилотрофов. Пущино, 1987.

4. Ковалев Н.Г, Поздняков А.И, Мусекаев Д.А, Позднякова Л.А. Торф, торфяные почвы, удобрения. М., 1998.

5. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.

6. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. М., 1997.

7. Отчет о научно-исследовательской работе ЦТБОС за 1973 год: разработка экологических аспектов сельскохозяйственного использования торфяников и торфяных болот. Т. 2. Дмитров, 1973.

8. Поздняков Л.А. Оценка биологической активности торфяных почв по удельному электрическому сопротивлению // Почвоведение. 2008. № 10.

9. Скрынныкова И.Н. Почвенные процессы в торфяных окультуренных почвах. М., 1961.

10. Степанов А.Л, Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М., 2002.

11. Степанов А.Л, Манучарова Н.А. Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах. М., 2006.

12. Степанов А.Л, Манучарова Н.А., Полянская Л.М. Продуцирование закиси азота бактериями в почвенных агрегатах // Почвоведение. 1997. № 8.

13. Amann R.I., Krunholz L, Stahl D.A. Fluorescent-oli-gonucleotide probing of whole cells for determinative, phylo-genetic and environmental studies in microbiology //J. Bac-teriol. 1990. Vol. 172.

14. Boetius A., Ravenschlag K, Schubert C.J. et al. A marine microbial consortium apparently mediating anaerobic oxidation of methane // Nature. 2000. Vol. 407.

15. Eller G., Kanel L, Kruger M. Cooccurrence of Aerobic and Anaerobic Methane Oxidation in the Water Column of Lake Plubsee // Applied and Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 12.

16. Ethan L. Grossman, Luis A. Cifuentes, Isabelle M. Cozzarelli. Anaerobic Methane Oxidation in a Landfill-Leac-hate Plume // Environ. Sci. Technol. 2002. Vol. 36(11).

17. Ettwig K.F., Shima S, K.T. van de Pas-Schoonen et al. Denitrifying bacteria anaerobically oxidize methane in the absence of Archaea // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10(11).

18. Hallam S.J., Putnam N., Preston C.M. et al. Reverse Methanogenesis: Testing the Hypothesis with Environmental Genomics // Sci. 2004. Vol. 305.

19. Harder J. Anaerobic methane oxidation by bacteria employing 14C-methane uncontaminated with 14C-carbon monooxide // Mar. Geol. 1997. N 137.

20. Hinrichs K.U., Boetius A. The anaerobic oxidation of methane: new insights in microbial ecology and biogeo-chemistry. In: G. Wefer, D. Billett, D. Hebbeln et al. (ed.). Ocean margin systems. Berlin, 2002.

21. Hinrichs K.U., Hayes J.M., Sylva S.P. et al. Methane-consuming archaebacteria in marine sediments // Nature. 1999. N 398.

22. IPCC Third Assessment Report: Climate Change 2001. Working Group I: The Scientific Basis, Chapter 4 http://www.ipcc.ch/ipccreports/tar/wg1/127.htm

23. Kajikawa H, Valdes C., Hillman K. et al. Methane oxidation and its coupled electron-sink reactions in ruminal fluid // Letters in Applied Microbiol. 2003. Vol. 36.

24. Kravchenko I.K. Methane oxidation in boreal peat soils treated with various nitrogen compounds // Plant and Soil. 2002. N 242.

25. Kumaraswamy S., Ramakrishnan B., Sethunathan N. Methane Production and Oxidation in an Anoxic Rice Soil as Influenced by Inorganic Redox Species //J. Environ. Quality. 2001. Vol. 30.

26. Losekann T., Knittel K., Nadalig T. et al. Diversity and Abundance of Aerobic and Anaerobic Methane Oxidizers

at the Haakon Mosby Mud Volcano, Barents Sea // Applied and Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 10.

27. Moran J.J., Beal E.J., Vrentas J.M. et al. Methyl sulfides as intermediates in the anaerobic oxidation of methane // Environ. Microbiol. 2008. N 10(1).

28. Moran J.J, House C.H., Freeman K.H., Ferry J.G. Trace methane oxidation studied in several Euryarchaeota under diverse conditions // Archaea. 2005. Vol 1.

29. Murase J., Kimura M. Methane Production and Its Fate in Paddy Fields: IV. Sources of Microorganisms and Substrates Responsible for Anaerobic Methane Oxidation in Subsoil // Soil Sci. Plant. Nutr. 1994. 40(1).

30. Murase J., Kimura M. Methane Production and Its Fate in Paddy Fields: VI. Anaerobic Oxidation of Methane in Plow Layer Soil // Soil Sci. Plant. Nutr. 1994. 40(3).

31. Murase J., Kimura M. Methane Production and Its Fate in Paddy Fields: VII. Electron Acceptors Responsible for Anaerobic Methane Oxidation // Soil Sci. Plant. Nutr. 1994. 40(4).

32. Nauhaus K., Boetius A., Kruger M, Widdel F. In vitro demonstration of anaerobic oxidation of methane coupled to sulphate reduction in sediment from a marine gas hydrate area // Environ. Microbiol. 2002. N 4.

33. Orphan V.J., House C.H., Hinrichs K.-U. et al. Methane-Consuming Archaea Revealed by Directly Coupled Iso-topic and Phylogenetic Analysis // Sci. 2001. Vol. 293.

34. Raghoebarsing A.A., Pol A., van de Pas-Schoonen K.T. et al. A microbial consortium couples anaerobic methane oxidation to denitrification // Nature. 2006. Vol. 440.

35. Raskin L., Stromley J.M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Group-specific 16S rRNA hybridization probes to describe natural communities of methanogens // Applied and Environ. Microbiol. 1994. Vol. 95.

36. Smemo K.A., Yavitt J.B. Evidence for Anaerobic CH4 Oxidation in Freshwater Peatlands // Geomicrobiol. J. 2007. Vol. 24.

37. Sorensen K.B., Finster K., Ramsing N.B. Thermodynamic and Kinetic Requirements in Anaerobic Methane Oxidizing Consortia Exclude Hydrogen, Acetate, and Methanol as Possible Electron Shuttles // Microbiol. Ecol. 2001. Vol. 42.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

38. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Wiley; N.Y., 1991.

39. Zehnder A.J.B., Brok T.D. Anaerobic Methane Oxidation: Occurrence and Ecology // Applied and Environ. Mic-robiol. 1980. Vol. 39, N 1.

Поступила в редакцию 13.09.2010

ANAEROBIC METHANE OXIDATION IN SOILS AND AQUATIC ECOSYSTEMS L.A. Pozdnyakov, A.L. Stepanov, N.A. Manucharova

The possibility of anaerobic methane oxidation in meliorated peat soils and automorphic sod-podsolic coil was showed. In anaerobic conditions and after acetylene (strong inhibitor of methane monooxygenase) introduction these soils continue methane absorption. This absorption was stimulated by oxidant (nitrate, sulphate) addition, while reducer (ammonium chloride) addition has no influence on it. Anaerobic incubation with methane and oxidant addition results in a growth

of percentage and absolute number of archaea, that is conform to data collected during aquatic ecosystems investigation.

Key words: methane, anaerobic methane oxidation, denitrification, peat soils.

Сведения об авторах. Поздняков Лев Анатольевич, аспирант каф. биологии почв. Тел.: (495)939-34-05; e-mail: APL-223@mail.ru. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв. Тел.: (495)939-34-05; e-mail: Stepanov_aleksey@mail.ru. Манучарова Наталия Александровна, канд. биол. наук, доцент каф. биологии почв. Тел.: (495)939-34-05; e-mail: manucharova@mail.ru.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.