CC BY
5
УДК 543.553.8+544.653.2
Беспрозванная Р., Горончаровская И.В., Евсеев А.К., Царькова Т.Г., Крюков А.Ю., Шабанов А.К. АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИТА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ
Беспрозванная Рона, магистрант 2-го года обучения кафедры кафедры технологии неорганических веществ и электрохимических процессов, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20, e-mail: ronabes98@gmail.com
Горончаровская Ирина Владимировна, к.х.н., старший научный сотрудник отделения общей реанимации, ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», 129090, Москва, Большая Сухаревская площадь, дом 3
Евсеев Анатолий Константинович, д.х.н., ведущий научный сотрудник отделения общей реанимации, ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», 129090, Москва, Большая Сухаревская площадь, дом 3
Царькова Татьяна Григорьевна, к.х.н., профессор кафедры технологии неорганических веществ и электрохимических процессов, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Крюков Александр Юрьевич, к.х.н., доцент кафедры физической химии, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 Шабанов Аслан Курбанович, д.м.н., старший научный сотрудник отделения общей реанимации, ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ДЗМ», 129090, Москва, Большая Сухаревская площадь, дом 3
Статья посвящена исследованию возможностей определения нитрита в биологических средах амперометрическим методом с помощью композитного электрода на основе многостенных углеродных нанотрубок и полиметиленового голубого. Показано, что у здоровых людей и пациентов с воспалительной реакцией значительно различаются величины токов окисления нитрита в сыворотке крови. Выявлена обратная корреляция между полученными величинами и величинами суммарного содержания метаболитов оксида азота, измеренными спектрофотометрическим методом.
Ключевые слова: амперометрия, нитрит, углеродные нанотрубки, сыворотка крови, полиметиленовый голубой, сепсис
AMPEROMETRIC DETERMINATION OF NITRITE IN BIOLOGICAL MEDIA
Besprozvannaya R.1, Goroncharovskaya I.V.2, Evseev A.K.2, Tsarkova T.G.1, Kryukov A.Yu.1, Shabanov A.K.2 1D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia 2N.V. Sklifosovsky Research Institute for Emergency Medicine, Moscow, Russia
The article is devoted to the study of the possibilities of determining nitrite in biological media by the amperometric method using a composite electrode based on multi-walled carbon nanotubes and poly (methylene blue). It has been shown that in healthy persons and patients with an inflammatory reaction, the values of currents of nitrite oxidation in the blood serum differ significantly. An inverse correlation was found between the obtained values and the values of the content of nitric oxide metabolites measured by the spectrophotometric method. Keywords: amperometry, nitrite, carbon nanotubes, blood serum, polymethylene blue, sepsis
Введение
Оксид азота является важной молекулой в организме, выполняющей регуляторную и сигнальную функции. В частности, оксид азота играет значительную роль в патогенезе воспалительных состояний. Так, известно, что у пациентов в тяжелом состоянии с явлениями синдрома системной воспалительной реакции (сепсисом) увеличивается продуцирование оксида азота, которое приводит к негативным последствиям [1]. Поэтому немаловажным является отслеживание содержания оксида азота в биологических средах при различных патологических состояниях.
В настоящее время существует два пути определения оксида азота - прямое и непрямое определение. К непрямому пути относят определение метаболитов оксида азота, поскольку N0 является короткоживущей молекулой. Как правило, на практике для определения метаболитов
оксида азота используется спектрофотометрический метод с использованием реакции Грисса [1, 2]. Недостатком метода является его трудоемкость и длительность. Поэтому продолжает оставаться актуальным разработка альтернативных методов определения метаболитов оксида азота.
Ранее нами были показаны возможности пастового электрода на основе многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ), покрытых полиметиленовым голубым (ПМГ) для вольтамперометрического определения нитрита в водных и биологических средах [3]. В плазме крови в присутствии нитрита наблюдали аналогичный пик окисления нитрита, как и в модельных водных растворах, что позволило предположить, что данный композитный электрод пригоден для измерений в биологических средах.
Целью данной работы является исследование возможностей определения нитрита с помощью амперометрического метода в сыворотке крови.
Методика исследования
Суспензию МУНТ для модифицирования рабочего стеклоуглеродного электрода (СУЭ, d=3 мм) получали путем ультразвукового диспергирования 50 мг МУНТ (ООО «Глобал СО») в 10 мл 1% раствора додецилсульфата натрия в течение 30 минут. Далее полученную суспензию объемом 1 мкл наносили на предобработанную в растворе 0,5М H2SO4 поверхность СУЭ и высушивали на воздухе.
Поляризационные измерения проводили с помощью потенциостата IPC-Pro L (ЗАО «Кронас», Россия) в трехэлектродной электрохимической ячейке. В качестве электрода сравнения использовали хлоридсеребряный электрод (нас.), вспомогательного электрода - сетку из платинированного титана. Электрополимеризацию метиленового голубого проводили из раствора 0,02 М натрий-фосфатного буфера (рН=8), содержащего 2 мМ метиленового голубого и 0,1 М KCl в режиме циклической развертки от -400 до +1200 мВ со скоростью развертки потенциала 50 мВ/с в течение 30 циклов.
Модельные измерения нитрита проводили в растворе NaNO2 в натрий-фосфатном буфере (рН=7,4) в диапазоне концентраций от 2,5 10-7 М до 1-10-3 М.
В качестве объекта исследования выступали сыворотки крови здоровых людей (N=20) и пациентов с явлениями синдрома системной воспалительной реакции (N=26). Для сравнения были определены величины метаболитов оксида азота (NOx) в исследуемых сыворотках с помощью стандартного спектрофотометрического метода [4].
Результаты
Вольтамперометрический анализ нитрита натрия в водных средах на композитном электроде СУЭ/МУНТ/ПМГ показал, что анодное окисление протекает с максимумом при потенциале +810 мВ. Для увеличения чувствительности измерений было решено провести амперометрический анализ нитрита (Рис. 1).
Рис. 1 Хроноамперограмма композитного электрода СУЭ/МУНТ/ПМГ при добавлении различных концентраций нитрита (от 25 мкмоль/л до 1 ммоль/л) в буферный раствор (рН=7,4) при
постоянном перемешивании при потенциале +810 мВ.
Наблюдали отклик тока (при потенциале +810 мВ) при введении раствора нитрита натрия в буферный раствор при постоянном перемешивании. Как можно видеть из Рис. 2, ток окисления увеличивался вместе с каждым последующим введением нитрита натрия в раствор. Линейная зависимость тока окисления от концентрации нитрита была обнаружена в диапазоне концентраций от 25 мкмоль/л. до 1 ммоль/л.
к
14 12 1» t а
s < б
R! = 0,9464
О 0.2 0,4 0,6 0.» 1 1,2
С N а М):, ммоль/л
Рис 2. Калибровочная зависимость величины тока при потенциале +810 мВ от концентрации нитрита в сыворотке крови.
Далее были проведены эксперименты по измерению содержания нитрита, как метаболита оксида азота, в биологических образцах. В буферный раствор при постоянном перемешивании и при потенциале +810 мВ вносили сыворотку крови в соотношении 20:1 и фиксировали изменение тока окисления. Было выявлено, что полученные данные значительно отличаются у здоровых людей и у пациентов с воспалительной реакцией (Рис. 3). 2'5 гД1, мкА
1,5
0,5
0
i V*
0
20
40
120
МО
60 80 100 !\()\, мкмоль/л
Рис 3.Зависимость величины тока окисления
нитрита от содержания в сыворотке крови
метаболитов оксида азота: ▲ - доноры, • -
пациенты с сепсисом.
Так, медианное значение тока окисления у здоровых людей составило 0,41 (0,33; 0,55) мкА, в то время как у пациентов с сепсисом 0,79 (0,61; 1,28) мкА. Также была обнаружена обратная зависимость тока окисления нитрита в сыворотке крови от суммарного содержания метаболитов оксида азота КОх, измеренного спектрофотометрическим
методом. Обратный характер зависимости, вероятно, может быть связан с изменением соотношения в сыворотке крови N02"/N0з" [5].
Заключение
Показана возможность амперометрического определения содержания нитрита в водных средах и в сыворотке крови с помощью композитного электрода СУЭ/МУНТ/ПМГ. В водных средах обнаружена линейная зависимость величины тока окисления от концентрации нитрита в растворе в диапазоне концентраций от 25 мкмоль/л до 1 ммоль/л (Я2 = 0,9964). При исследовании биологических образцов было обнаружено, что у пациентов с воспалительной реакцией величина тока окисления практически вдвое выше, чем у здоровых людей (0,79 мкА против 0,41 мкА). Также выявлена обратная зависимость тока окисления нитрита от суммарного содержания в сыворотке крови метаболитов оксида азота. Таким образом, амперометрический метод может быть использован для оценки содержания нитрита в биологических средах, как одного из метаболитов оксида азота.
Список литературы
1. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний. Москва: Медпрактика-М, 2004. 179 с.
2. Голиков П.П., Николаева Н.Ю. Метод определения нитрита/нитрата (NOx) в сыворотке крови // Биомедицинская химия. - 2004. - Т. 5. - С. 79-85.
3. Беспрозванная Р., Царькова Т.Г., Горончаровская И.В., Евсеев А.К., Крюков А.Ю., Шабанов А.К. Электрохимическое окисление нитрита на модицифицрованном пастовом электроде на основе углеродных нанотрубок // Успехи в химии и химической технологии. - 2020. - Т. XXXIV, № 4. - С. 138-140.
4. Клычникова Е.В., Тазина Е.В., Смирнов С.В., Спиридонова Т.Г., Жиркова Е.А., Борисов В.С., Годков М.А. Взаимосвязь биохимических показателей окислительного стресса, эндогенной интоксикации и регуляции сосудистого тонуса у больных с ожоговой травмой // Анестезиология и реаниматология. - 2015. - Т. 60. - № 1. - С. 45-49.
5. Kawashima H., Inage Y., Ogihara M., Kashiwagi Y., Takekuma K., Hoshika A., Mori T., Watanabe Y. Serum and cerebrospinal fluid nitrite/nitrate levels in patients with rotavirus gastroenteritis induced convulsion // Life Sciences. -2004. - V.74. - P. 1397-1405.
