CC BY
62
УДК 9577.112.3
АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ORTHILIA SECUNDA (L.)
© Е.Н. Аёшина , Ж.А. Плынская, Н.А. Величко
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск, 660049 (Россия) E-Mail: nvn@sibstu.kts.ru
Работа посвящена изучению аминокислотного состава белков надземной части ортилии однобокой - Orthilia secunda (L.) в летний период с целью определения оптимальных сроков сбора растения.
Ключевые слова: Orthilia secunda (L), исследование, изменение, содержание белка, аминокислотный состав.
Введение
Ортилия однобокая Orthilia secunda (L.) - это многолетнее травянистое растение, представитель семейства грушанковых (Pyrolaceae), произрастающее преимущественно в западных районах Восточной Сибири до Байкала. Данный вид флоры Сибири является потенциальным источником ценных биологически активных веществ. Согласно литературным данным, ортилия однобокая содержит арбутин, гидрохинон, кумарины, витамин С, гидрохинон, смолы, флавоноиды, горькие вещества, сапонины, винную и лимонную кислоты, микроэлементы, такие как титан, медь, цинк, марганец [1]. По данным народной медицины ортилия однобокая обладает противовоспалительными свойствами и широко используется при лечении различных заболеваний [2, 3]. Однако сведения о химическом составе растения немногочисленны и не дают полной картины о механизмах воздействия на организм человека.
Таким образом, изучение динамики биологически активных веществ в период вегетации растения представляет научный и практический интерес. Растительные белки оказывают физиологическое воздействие на организм человека. Поскольку свойства белков определяются входящими в его структуру аминокислотами, представляет интерес изучения аминокислотного состава белка.
Экспериментальная часть
Материал для исследования собирался в летний период 2006 г. в таежной зоне Манского района Красноярского края. Общее содержание белка в исследуемых пробах определяли с помощью красителя амидо-черного 10В по методу [4].
Аминокислотный состав белков определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339 M(MIKROTECHNA, Чехия). Гидролиз белков и подготовку образцов для аминокислотного анализа проводили по следующей методике.
На аналитических весах брали навеску хорошо очищенных препаратов белка около 50 мг (± 1-2 мг). Одновременно в этих же препаратах определяли влажность и содержание азота. Навеску белка помещали в специальные ампулы и добавляли по 10 мл 6 н НС1. Если белка недостаточно, навески можно взять по 20-25 мг, но величина их должна быть примерно одинаковой. Ампулы запаивали и ставили в термостат с терморегулятором на 24 ч. Температуру в термостате поддерживали в пределах 103-105 °С. В течение этого времени содержимое ампул периодически встряхивали.
* Автор, с которым следует вести переписку.
После окончания гидролиза ампулы охлаждали, вскрывали, содержимое количественно переносили в фарфоровые чашки, для чего ампулы несколько раз ополаскивали небольшими порциями дистиллированной воды. Чашки с гидролизатом ставили на водяную баню в вытяжной шкаф, и содержимое выпаривали (с вентилятором) при температуре не более 50 °С. После выпаривания соляной кислоты в чашки добавляли немного дистиллированной воды и снова выпаривали досуха. Эту операцию повторяли 3-4 раза.
Соляную кислоту можно удалять и при комнатной температуре, выпаривая ее в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора или едким кали. После удаления НС1 в чашки добавляли воду и вновь упаривали досуха. Это повторяли 3-4 раза.
После полного удаления соляной кислоты чашки охлаждали и добавляли точно по 4 мл 10% изопропилового спирта (если навеска была 20-25 мг, приливали по 2 мл). Содержимое чашек тщательно перемешивали стеклянными палочками для полного растворения аминокислот. После этого содержимое чашек переносили в маленькие центрифужные пробирки (мыть чашки нельзя) и центрифугировали в течение 5-10 мин при 3-4 тыс. об/мин для осаждения гуминовых веществ. Чистые растворы аминокислот сливали в сухие маленькие пробирки, плотно закрывали пробками, замораживали в холодильнике и сохраняли для количественных определений. В замороженном состоянии в холодильнике растворы можно хранить в течение 2-3 недель. Затем содержимое пробирок переносили в выпарные чашки и упаривали досуха. После этого добавляли 1,8 мл буферного раствора, содержимое чашек переносили в кюветы для анализа на ААА-339.
Количественное определение аминокислот в гидролизатах проводили таким же методом, как и при определении содержания свободных аминокислот в растениях. Объем раствора, наносимого на одну хроматограмму, должен составлять 0,1 мл. Хроматографию проводили в трехкратной повторности.
В результате кислотного гидролиза аспарагин и глутамин превращаются в соответствующие дикар-боновые аминокислоты и аммиак. Для определения амидов в белках в тех же растворах аминокислот, полученных после удаления соляной кислоты и растворения в изопропиловом спирте, устанавливали содержание аммиака микродиффузионным методом. Расчеты проводили с учетом навески белка и разбавления (в 4 или 2 мл изопропилового спирта).
Результаты определений аминокислотного состава выражали в граммах аминокислот на 100 г белка или в процентах азота каждой аминокислоты от общего азота белка [5].
Обсуждение результатов
На рисунке приведена динамика общего содержания белков в надземной части ортилии однобокой. Из диаграммы видно значительное повышение содержания белка к августу. Данная зависимость обусловлена подготовкой растения к зиме, которая сопровождается усилением синтеза белков в живых тканях [6, 7].
Основными структурными элементами белков являются аминокислоты. Известно, что во многом аминокислоты определяют биологические свойства белков. Результаты анализа аминокислотного состава белка представлены в таблице.
и 5
ш 5
° 2
Г1 ^
о о -I-------------1--------------1--------------1 Гистограмма общего содержания белка
июнь июль август в надземной части ортилии однобокой
7
6
4
3
Аминокислотный состав белков надземной части ортилии однобокой
№ Наименование аминокислоты Содержание, % к сумме кислот
июнь июль август
1 Аспарагиновая кислота 18,42 19,04 18,25
2 Треонин 6,11 4,82 4,68
3 Серин 7,00 4,89 7,02
4 Глутаминовая кислота 11,35 9,25 13,05
5 Пролин 2,62 0,99 0,75
6 Глицин 14,93 15,64 11,60
7 Аланин 14,62 11,59 10,11
8 Валин 1,92 2,55 3,42
9 Метионин 0,96 1,13 0,16
10 Изолейцин 1,64 1,77 2,97
11 Лейцин 7,10 8,30 11,04
12 Тирозин 3,16 6,38 2,91
13 Фенилаланин 2,03 3,10 2,57
14 Гистидин 2,95 5,11 1,55
15 Лизин 4,02 4,25 7,78
16 Аргинин 27,0 16,5 40,0
В составе белка обнаружено 16 аминокислот. В наибольшем количестве присутствуют аргинин, аспарагиновая кислота и глицин. Обращает на себя внимание антибатный характер изменения их содержания: количество аргинина увеличивается на фоне снижения содержания аспарагиновой кислоты и глицина, и наоборот.
В исследуемый период в значительных количествах содержится глутаминовая кислота, аланин. Содержание глутаминовой кислоты и аргинина в июле понизилось и значительно возросло к августу. Вероятно, это может быть обусловлено понижением среднесуточных температур в августе и ранними заморозками.
Аминокислотный состав надземной части ортилии однобокой представлен всем спектром незаменимых аминокислот. Обращает на себя внимание значительное содержание незаменимых аминокислот, таких как лейцин, треонин, лизин. Биологическая ценность белка составляет 24% в июне, 36% июле, 31% августе.
Выводы
Таким образом, в результате проведенных исследований была изучена динамика суммарного содержания белка в летний период. Наибольшее суммарное содержание белка было установлено в августе. Определен аминокислотный состав белка и установлены значительные количественные изменения в содержании аминокислот в зависимости от времени сбора.
Список литературы
1. Телятьев В.В. Целебные клады. Иркутск, 1991. 400 с.
2. Блинова К.Ф., Вандышев В.В., Комарова М.Н. и др. Растения для нас. СПб, 1996. 653 с.
3. Минаева В.Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск, 1991. 431 с.
4. Бузун Г.А., Джемухадзе К.Н., Милешко Л.Д. Определение белков в растениях с помощью амидо-черного //
Физиология растений. 1982. Т. 29. №1. С. 198-204.
5. Плешков Б.П. Практикум по биохимии растений. М., 1985. 255 с.
6. Сезонные структурные метаболические ритмы и адаптация древесных растений / под ред. Э.Н. Адлера и др. Уфа, 1977. 151 с.
7. Алексеев В.Г., Беленкова Т.Д., Щербокова Т.М. Криобелки и адаптация растений Севера к низким температурам // Физиология растений. 1987. Т. 34. №6. С. 1140-1148.
Поступило в редакцию 12 марта 2008 г.
