CC BY
91
АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ АНГИОГЕННЫХ ФАКТОРОВ У ПАЦИЕНТОК С НЕУДАЧНЫМИ ПОПЫТКАМИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ*
М.В. Белокурова, О.Б. Панина, Г.М. Савельева
Кафедра акушерства и гинекологии Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Россия, 119192, Москва, Ломоносовский пр., 31-5
Л.М. Самоходская, О.Н. Садекова, В.А. Ткачук
Кафедра биохимии и молекулярной медицины Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Россия, 119192, Москва, Ломоносовский пр., 31-5
М.П. Крамаренко
Центр планирования семьи и репродукции г.Москвы Россия, 117209, Москва, Севастопольский пр., 24А
Цель исследования: определение значимости аллельных вариантов генов ангиогенеза в нарушении процессов имплантации у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО по поводу бесплодия неясного генеза или трубно-перитонеального бесплодия.
Материалы и методы: в исследование включено 85 пациенток (основная группа), которым было произведено от 2 до 5 неудачных попыток ЭКО. В группу сравнения вошли 70 женщин с реализованной репродуктивной функцией. Данным пациенткам было проведено исследование полиморфизма генов ангиогенеза VEGF -1154 G/A, его рецептора KDR 1719 A/T и KDR-604 T/C, а также ангиопоэтина-2 735G/A методом ПЦР-ПДРФ.
Результаты: у пациенток с многократными неэффективными попытками ЭКО выявлен дисбаланс ангиогенных факторов, который выражается в увеличении частот встречаемости ал-лельных вариантов генов VEGF и ангиопоэтина-2. Выявленные генетические особенности исследуемых пациенток могут указывать на значение данных полиморфизмов генов VEGF -1154 G/A и ангиопоэтина 735G/A в успешности имплантации.
Выводы: при обследовании пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО целесообразно уделять внимание молекулярно-генетическим исследованиям для выявления предрасположенности пациентки к нарушению имплантации и, возможно, проведения предгравидар-ной подготовки
Ключевые слова: бесплодие неясного генеза, трубно-перитонеальное бесплодие, ЭКО, имплантация, генетические полиморфизмы, ангиогенез, VEGF, KDR, ангиопоэтин-2.
Повышение эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий, которая в настоящее время не превышает 30-40%, является одной из основных задач современной репродуктологии [2]. Среди причин неэффективности попыток экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) наибольшее значение придается плохому качеству эмбрионов, патологии эндометрия (хронический эндометрит, гиперплазия или полип эндометрия), наличию гидро-сальпинксов, нарушению свертываемости крови, а также изменению кариотипа
* Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного контракта № 16.512.11.2030 от 14.02.2011 с Министерством образования и науки РФ.
супругов [1, 2, 5, 8]. Однако нередко причина ненаступления беременности после ЭКО остается неясной.
Ряд исследователей рассматривает в качестве возможной причины неэффективности ЭКО нарушение имплантации эмбриона [4, 5, 9]. Известно, что в пролиферативную фазу менструального цикла происходит интенсивное развитие сосудистой сети эндометрия, что обеспечивает его подготовку к имплантации плодного яйца [2, 5, 6, 11]. Соответственно нарушение процессов ангиоге-неза в этот период может играть важную роль в патогенезе бесплодия [13].
Одним из основных ангиогенных факторов является сосудисто-эпителиальный фактор роста (VEGF), играющий ключевую роль в процессе ангиогенеза в эндометрии [2, 4]. Биологическое действие VEGF реализуется путем связывания с двумя типами рецепторов, однако именно VEGFR2 (KDR/flk-1) является более значимым, поскольку он опосредует основные эффекты VEGF, включая стимуляцию процессов ангиогенеза, сосудистой проницаемости и клеточной пролиферации [14]. Другой группой ангиогенных факторов, присутствующих в эндометрии, являются ангиопоэтины (ангиопоэтин-1 и ангиопоэтин-2). Ангиопоэтин-1 представляет собой ростовой фактор, ответственный за развитие кровеносных сосудов. Ангиопоэтин-2 основной ростовой фактор, участвующий в ремоделировании сосудов. Ангиопоэтин-2 вызывает уменьшение взаимодействия эндотелиальных клеток с внеклеточным матрик-сом и друг с другом, что стимулирует активность VEGF. Совместная экспрессия антиопоэтина-2 и VEGF приводит к усилению процессов ангиогенеза [11].
Изменение процессов ангиогенеза в эндометрии может привести к нарушению циклической трансформации эндометрия и, следовательно, нарушению имплантации. Дальнейшее изучение процессов ангиогенеза, происходящих в эндометрии в период имплантации, является одним из перспективных направлений для понимания причин ненаступления беременности и возможности их коррекции.
Целью настоящего исследования явилось определение значимости аллель-ных вариантов генов ангиогенных факторов в нарушении процессов имплантации у пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО по поводу бесплодия неясного генеза или трубно-перитонеального бесплодия.
Материал и методы исследования.
В исследование было включено 85 пациенток, составивших основную группу (средний возраст 33±4,5 лет), которым было произведено от 2 до 5 неудачных попыток ЭКО, из них 44 пациенткам - по поводу первичного бесплодия неясного генеза и 41 - по поводу трубно-перитонеального бесплодия.
Критериями включения в исследование для основной группы были: возраст до 38 лет, нормальный овариальный резерв (умеренный или выраженный фолликулярный аппарат по данным УЗИ, нормальные показатели уровней ФСГ, антимюллеровского гормона, ингибина Б), нормальное состояние эндометрия по данным УЗИ (на 2-5-й день менструального цикла М-эхо линейное, во вторую фазу менструального цикла - 9-15 мм, трехслойное), а также удовлетворительное качество эмбрионов. Для пациенток с бесплодием неясного генеза до-
полнительным критерием включения также было отсутствие патологии при исследовании супружеской пары, а для пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием - отсутствие маточных труб или доказанная их непроходимость по данным гистеросальпингографии, фертилоскопии или лапароскопии.
Критериями исключения были: снижение овариального резерва, клинически значимый эндометриоз, хронический эндометрит, патология эндометрия, пороки развития матки, мужской фактор бесплодия в паре, а также неудовлетворительное качество эмбрионов при ЭКО.
Качество эмбрионов определялось эмбриологами. Для оценки эмбрионов на 3-и сутки использовалась классификация, в соответствии с которой эмбрионы оценивали по количеству клеток, на что указывает цифра, и по качеству. При оценке качества использовали буквенное обозначение от А до D, где «A» обозначает наиболее качественный, «D» - наименее качественный эмбрион. При оценке качества эмбриона учитывали параметры: 1) регулярность размеров и форма бластомеров, 2) наличие и степень фрагментации, 3) наличие многоядерных бластомеров, 4) наличие и степень вакуолизации бластомеров. Таким образом, на 3-и сутки качество эмбрионов считалось удовлетворительным при условии, что он состоял из 6-10 бластомеров группы А или В. Для оценки эмбрионов на 5-е сутки использовалась общепринятая классификация бластоцист по Д. Гарднеру [10]. Таким образом, на 5-е сутки эмбрион представлял собой бластоцисту группы А или В (от В1 до В5).
В группу сравнения вошли 75 женщин (средний возраст 32±5,6 лет). Критериями включения в контрольную группу были: возраст до 38 лет, отсутствие бесплодия в анамнезе, физиологическое течение одной и более беременностей, завершившихся рождением здорового ребенка (take home baby).
Средний возраст менархе, характер менструального цикла у всех исследуемых пациенток как основной, так и контрольной группы были сопоставимы и соответствовали физиологическим параметрам. В то же время у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в анамнезе чаще встречались воспалительные заболевания придатков матки, а также внематочные беременности.
В программу обследования было включено исследование полиморфизма генов сосудисто-эпителиального фактора роста VEGF-1154 G/A, его рецептора KDR 1719 A/T и KDR-604 T/C, а также ангиопоэтина-2 735G/A. Для генетического исследования выполнялась экстракция геномной ДНК на сорбенте из лимфоцитов периферической цельной крови при помощи коммерческого набора «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Москва).
Определение аллельных вариантов генов проводили методом ПЦР-ПДРФ при помощи амплификатора «Mastercycler gradient» («Eppendorf», Германия) с последующей рестрикцией полученных ампликонов эндонуклеазой согласно рекомендациям фирмы-изготовителя («Fermentas», США). Для электрофореза и визуализации результатов продукты амплификации и рестрикции разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном водным раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл). Результаты анализа фиксировали с помощью системы видео-гель-документации «Versa Doc RG 3000» («Bio-Rad», США).
При статистической обработке полученных данных на первом этапе было проведено сравнение результатов в основной и контрольной группах, далее результаты в каждой из двух подгрупп основной группы сравнивались с группой контроля, а затем друг с другом.
Достоверность значений определялась в программе STATISTICA при подсчете значения р по точному двустороннему тесту Фишера. Все лица, включенные в исследование, дали письменное информированное согласие на участие в нем.
Результаты и обсуждение.
При изучении полиморфизма -1154 G/A гена VEGF было выявлено статистически достоверное (р<0,05) снижение частоты встречаемости генотипа GG (34,2%), а также увеличение встречаемости вариантного генотипа AA (38,0%) в основной группе по сравнению с группой контроля (соответственно 58,1%, 12,9%) (рис.1). Сравнение частоты встречаемости аллелей G и A также показало статистически достоверное (р<0,05) повышение встречаемости аллели A в основной группе (51,9%) по сравнению с группой контроля (27,4%). У носителей вариантного генотипа АА шанс развития бесплодия в 4,14 раз выше, чем у носителей генотипа GG (OR=4,14). Аналогичные данные были получены при сравнении каждой из подгрупп с группой контроля.
70
со-
Р
и
S M1
Рис.1. Частота встречаемости различных генотипов VEGF-1154 G/A у пациентов основной и контрольной групп
Известно, что полиморфизм промотерной области -1154 G/A приводит к снижению экспрессии VEGF, не оказывая влияния на структуру самого белка. Полученные результаты соотносятся с данными Goodman C. et al., которые показали взаимосвязь гомозиготного носительства аллели -1154А с неудачной имплантацией эмбриона в рамках программ искусственного оплодотворения [10]. Кроме того, ряд исследователей показал снижение экспрессии VEGF в эндометрии женщин с бесплодием неясного генеза и неудачными попытками ЭКО [2, 13], что соответствует полученным результатам. Помимо этого, по данным ряда авторов, носительство этой аллели связано также с повышенным риском развития привычного невынашивания беременности [7, 9]. Таким образом, аллельный полиморфизм G(-1154)A гена VEGF может играть роль в формировании бесплодия и быть причиной неудачных попыток ЭКО.
При сравнении частот встречаемости генотипов гена KDR -604 Т/С и 1719 А/Т, а также их аллелей не было получено статистически достоверных различий между основной группой и группой контроля. Аналогичные результаты были получены при сравнении группы с бесплодием неясного генеза и группой контроля, а также группы с трубно-перитонеальным бесплодием и группой контроля.
Известно, что аллельный полиморфизм -604 Т/С гена KDR ассоциирован с изменением уровня его транскрипции. Замена аллели Т на С в положении -604 приводит к значительному снижению уровня продукции рецептора KDR [14]. Аллельный полиморфизм гена KDR 1719 А/Т расположен в 11 экзоне, который является одним из ключевых элементов, кодирующих домен связывания рецептора с VEGF. Возникновение мутаций в этом экзоне может приводить к экспрессии мутантного рецептора, который, в свою очередь, обладает сниженной способностью к связыванию с VEGF. Так, замена аллели А на Т в положении 1719 приводит к незначительному, однако статистически достоверному снижению связывающей способности рецептора KDR и VEGF [14]. Выявленное в настоящем исследовании отсутствие достоверных различий между основной группой и группой контроля может свидетельствовать об отсутствии прямой взаимосвязи между изменением уровня продукции рецептора KDR, его способности к связыванию с VEGF и наступлением беременности.
При анализе полиморфизма 735G/A гена ангиопоэтина-2 было выявлено статистически достоверное (р<0,05) повышение частоты встречаемости вариантного генотипа АА (11,1%) в основной группе по сравнению с группой контроля (соответственно 3,2%) (рис. 2). У носителей вариантного генотипа АА шанс развития бесплодия в 4,09 раз выше, чем у носителей генотипа GG (OR=4,09). Однако при сравнении частоты встречаемости гетерозиготного генотипа GA, генотипа GG, а также аллелей G и А не было выявлено достоверных отличий между основной и контрольной группой. При сравнении подгрупп основной группы с контролем были получены аналогичные результаты.
GO # Z SO г-и о " 40 j Î 30 1-U (Л ,1 и ■ основная группа ■ группа контроля
1 ■ ■ GA 11.1* *Р <0,05 АА
Рис.2. Частота встречаемости различных генотипов ангиопоэтина 735G/A у пациентов основной и контрольной групп
Ген ангиопоэтина-2 обладает высоким уровнем полиморфности. Точечная замена гуанина на аденин (G/A) в положении 735 является наиболее распро-
страненным полиморфизмом данного гена, при котором нарушается экспрессия белка и таким образом оказывается влияние на процессы ангиогенеза [14].
Изучение различий между подгруппами основной группы показало, что в случае VEGF была выявлена тенденция к более частой встречаемости вариантного генотипа ТТ (38,6%) в подгруппе с бесплодием неясного генеза по сравнению с группой с трубно-перитонеальным бесплодием (29,3%). Однако полученные отличия статистически не достоверны.
При аналогичном анализе генотипов KDR не было выявлено достоверных отличий между подгруппами с трубно-перитонеальным бесплодием и бесплодием неясного генеза как в случае полиморфизма 1719 А/Т, так и в случае полиморфизма -604 Т/С.
Сравнение встречаемости генотипов ангиопоэтина-2 между подгруппами основной группы выявило тенденцию к более высокой частоте встречаемости генотипа АА (13,6%) в подгруппе с бесплодием неясного генеза по сравнению с группой с трубно-перитонеальным бесплодием (7,3%). Полученные результаты также статистически не достоверны.
Таким образом, выявленные тенденции могут указывать на возможно более частое нарушение ангиогенеза у пациенток с бесплодием неясного генеза по сравнению с пациентками с трубно-перитонеальным бесплодием.
Помимо этого, необходимо отметить тот факт, что из всех пациентов основной группы сочетание аллельных полиморфизмов по двум генам наблюдалось у 30 пациенток (35,3%), по трем генам - у 33 пациенток (38,8%), по всем четырем - у 8 пациенток (9,4%). Наличие вариантной аллели только в одном гене у пациенток основной группы было выявлено у 12 женщин (14,1%), отсутствие вариантных аллелей в исследуемых полиморфизмах было выявлено у 2 пациенток (2,4%). При этом в группе контроля у 6 пациенток (8,0%) отсутствовали вариантные аллели во всех исследуемых генетических полиморфизмах, наличие вариантной аллели в полиморфизме только одного гена обнаружено у 22 пациенток (29,3%). Сочетание полиморфизмов двух генов у пациенток контрольной группы наблюдалось у 33 пациенток (44,0%), трех генов - у 11 пациенток (14,7%), а сочетание вариантных аллелей в четырех полиморфизмах было выявлено только у 3 пациенток (2,6%) (рис. 3).
Е
I 1
Ч
-<нет
I I I I
4 9,40% 2,60%
3 38,80% 14,70%
2 35,30% 44,00%
1 14,10% 29,30%
2,40%
8,00%
Основная группа
Контрольная группа
0°%
20°%
40%
60% 80%
100%
Рис. 3. Сочетание аллельных полиморфизмов нескольких генов у пациенток основной и контрольной группы
Анализ анамнеза исследуемых пациенток показал, что из 85 пациенток основной группы у 16 (18,8%) пациенток было больше всего неудачных попыток ЭКО (4-5). При этом у 6 из них было выявлено сочетание двух аллельных полиморфизмов, у 8 - сочетание трех аллельных полиморфизмов, у 2 из них было сочетание четырех вариантных аллелей в исследуемых полиморфизмах.
Таким образом, у пациенток с многократными неэффективными попытками ЭКО нами выявлен дисбаланс ангиогенных факторов, который выражается в увеличении частот встречаемости аллельных вариантов генов VEGF и ангиопо-этина-2. Выявленные генетические особенности исследуемых пациенток могут указывать на значение данных полиморфизмов генов VEGF -1154 G/A и ангио-поэтина 735G/A в успешности имплантации. При обследовании пациенток с многократными неудачными попытками ЭКО целесообразно уделять внимание молекулярно-генетическим исследованиям для выявления предрасположенности пациентки к нарушению имплантации и, возможно, проведения предграви-дарной подготовки.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Акушерство: Национальное руководство / Под ред. Э.К. Айламазяна, В.И. Кулакова, В.Е. Радзинского, Г.М. Савельевой. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.
[2] Бурлев В.А., Ильясова Н.А., Шишканова О.Л. Циклический ангиогенез эутопического эндометрия (обзор литературы).// Проблемы репродукции. - 2006. - №6.
[3] Гюльмамедова И.Д., Назар О.В., Ильин И.Е, Бойкова И.Н., Гюльмамедова Е.А. Роль иммунологического фактора у женщин с неэффективными циклами IVF-ET в анамнезе // Медицинские аспекты здоровья женщины. - 2010. - № 9-10 (38). - С. 10-13.
[4] Келлэт Е.П., Шуршалина А.В., Корнеева И.Е. Роль эндометрия в неудачах реализации репродуктивной функции // Проблемы репродукции. - 2010. - № 2. -16-20.
[5] Радзинский В.Е., Ордиянц И.М., Оразмурадов А.А. Женская консультация. - 3-е изд. -М.: ГЭОТАР-МЕДИА, 2009.
[6] Ранние сроки беременности. - 2-е изд., испр. и доп. / Под ред. В.Е. Радзинского, А.А. Оразмурадова. - М.: Status Praesena, 2009. - 480 c.
[7] Репродуктивное здоровье: Учеб. пособ. / Под ред. В.Е. Радзинского. - М.: РУДН, 2011.
[8] Хамадьянов У.Р., Саубанова Т.В., Хамадьянова С. У., Громенко Ю.Ю., Галимов А.И., Русакова Л.А. Оценка и дифференцированная коррекция состояния эндометрия у женщин с бесплодием в комплексной подготовке к ЭКО и ПЭ // Вестник РУДН. Сер. «Медицина. Акушерство и гинекология». - 2011. - № 6. - С. 167-171.
[9] Goodman C., Jeyendran R.S., Coulam C.B.Vascular endothelial growth factor gene polymorphism and implantation failure // Reprod Biomed Online. - 2008. - V. 16. - № 5. -Р. 720-3.
[10] Hannan N.J., Paiva P., Meehan K.L., Rombauts L.J., Gardner D.K., Salamonsen L.A. Analysis of fertility-related soluble mediators in human uterine fluid identifies VEGF as a key regulator of embryo implantation // Endocrinology. - 2011. - V. 152. - № 12. -Р. 4948-56.
[11] Plaisier M., Dennert I., Rost E., Koolwijk P., van Hinsbergh V.W., Helmerhorst F.M. Decidual vascularization and the expression of angiogenic growth factors and proteases in first trimester spontaneous abortions // Hum Reprod. - 2009. - V. 24. - № 1. - Р. 185-97.
[12] Seo W.S., Jee B.C., Moon S.Y. Expression of endometrial protein markers in infertile women and the association with subsequent in vitro fertilization outcome // Fertil Steril. -2011. - V. 95. - № 8. - P. 2707-10.
[13] Su M.T., Lin S.H., Lee I.W., Chen Y.C., Kuo P.L. Association of polymor-phisms/haplotypes of the genes encoding vascular endothelial growth factor and its KDR receptor with recurrent pregnancy loss // Hum Reprod. - 2011. - V. 26. - № 4. - P. 75864.
[14] Wang Y., Zheng Y., Zhang W., Yu H., Lou K., Zhang Y., Qin Q., Zhao B., Yang Y., Hui R. Polymorphisms of KDR gene are associated with coronary heart disease// Journal of the American College of Cardiology. - 2007. - V. 50. - № 8.
ALLELE GENE POLYMORPHISM OF ANGIOGENESIS FACTORS AT PATIENTS WITH REPEATED IVF FAILURE
M.V. Belokurova, O.B. Panina, GM. Savelyeva
Department of Obstetrics and Gynecology Moscow State University named after M.V. Lomonosov Lomonosovsky Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192
L^. Samokhodskaya, О.N. Sadekova, VA. Tkachuk
Department of biochemistry and molecular medicine Moscow State University named after M.V. Lomonosov Lomonosovsky Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192
М.P. Kramarenko
Family planning center Sevastopolskyi Av., 24A, Moscow, Russia, 117209
Aim of investigation: To determine the possible role of the angiogenesis genes polymorphisms in the implantation failure in patients with repeated failure of IVF on account of primary unexplained infertility or tubo-peritoneal infertility. Material and methods: The study included 85 females (case group) with from 2 to 5 IVF failures and 70 females (control group) with successful pregnancies outcomes. In all patients the study of angiogenesis gene polymorphisms VEGF -1154 G/A, KDR 1719 A/T, KDR -604 T/C and angiopoetin-2 735G/A was performed using PCR-RFLP. Results: In patients with the repeated failure of IVF was revealed the disbalance in angiogenesis factors in the form of increase in frequency of mutant gene genotypes VEGF and angiopoetin-2. Conclusions: In patients with repeated failure of IVF molecular-genetic investigations should be considered to reveal predisposition to implantation failure and possibly to perform preconceptional therapy.
Key words: unexplained infertility, tubo-peritoneal infertility, IVF, implantation, gene polymorphism, angiogenesis, VEGF, KDR, angiopoetin-2.
