CC BY
97
Алгоритмы диагностики псевдогипертрофических прогрессирующих мышечных дистрофий
Е.Л. Дадали, Е.В. Подагова, С.А. Мальмберг, А.Б. Кузнецов
Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа генетически гетерогенных заболеваний, характеризующихся изолированным или преимущественным поражением мышц плечевого и тазового поясов конечностей [1, 3, 4, 17, 19]. Показано, что наиболее злокачественное течение, приводящее к ранней инвалидизации и гибели больных, характерно для так называемых псевдогипертрофических вариантов ПКМД. Особенностью этих нозологических форм является увеличение объема различных мышечных групп, формирующееся за счет прогрессирующей гибели миофибрилл с последующим замещением их соединительной тканью. В группе псевдогипертрофических ПКМД выделяют дис-трофинопатии и саркогликанопатии. Дистрофинопатии включают прогрессирующие мышечные дистрофии (ПМД) Дюшенна и Беккера, которые представляют собой аллельные варианты, обусловленные различными мутациями в гене белка дистрофина и наследующиеся по Х-сцепленному ре-
Елена Леонидовна Дадали - профессор, Медико-генетический научный центр РАМН.
Екатерина Владимировна Подагова - канд. мед. наук, педиатрический факультет РГМУ, кафедра детской неврологии.
Сергей Александрович Мальмберг - профессор, педиатрический факультет РГМУ, кафедра детской неврологии.
Александр Борисович Кузнецов -
канд. мед. наук, медико-биологический факультет РГМУ, кафедра общей и медицинской генетики.
цессивному типу. Группа саркоглика-нопатий представлена 4 вариантами ПКМД - 2С-, 2Э-, 2Е-, 2Р-типов, наследующихся по аутосомно-рецессивно-му типу и обусловленных мутациями в генах четырех трансмембранных белков - а-, р-, у- и 8-саркогликанов. Имеющиеся в литературе немногочисленные работы, посвященные проведению клинико-генетических корреляций, показали отсутствие выраженных различий клинических проявлений ПМД Дюшенна и саркогликанопатий, что можно объяснить сходством патогенетических механизмов и морфологического дефекта, возникающего при заболеваниях этих групп [1, 9, 23]. Известно, что дистрофин и саркогликаны входят в состав дистрофин-гликопро-теинового комплекса, посредством которого осуществляется связь цитоскелета миофибрилл с внеклеточным матриксом [25]. Нарушение одного из компонентов этого комплекса приводит к его деградации и некрозу мышечных волокон с последующим замещением их соединительной тканью. Сходство клинических проявлений этих генетически гетерогенных заболеваний осложняет их дифференциальную диагностику и планирование профилактических мероприятий в отягощенных семьях. Это определяет необходимость создания четких алгоритмов диагностики отдельных генетических вариантов псевдогипертрофи-ческих форм ПКМД, использование которых позволит избежать ошибок при расчетах риска и формировании заключения о состоянии здоровья будущего ребенка во время проведения
дородовой диагностики. Однако разработка таких алгоритмов невозможна без проведения тщательного генеалогического, клинического, биохимического, молекулярно-генетического и иммуногистохимического обследования больных и членов их семей.
Целью настоящей работы явилось создание алгоритмов дифференциальной диагностики псевдогипертро-фических вариантов ПКМД у больных мужского и женского пола.
Материал и методы исследования
Нами проведено комплексное обследование выборки из 123 больных мужского пола и 19 больных женского пола в возрасте от 2,5 до 40 лет с клиническими и электромиографически-ми признаками псевдогипертрофиче-ских ПКМД. Клиническое обследование включало неврологический осмотр по общепринятой в клинической нейромиологии методике, сбор анамнестических данных и генеалогический анализ. Электромиографическое обследование проводилось с использованием 4-канального электромиографа. Определение уровня активности креатинфосфокиназы (КФК) проводилось по стандартной методике на автоматическом биохимическом анализаторе. ДНК-диагностика у больных мужского пола осуществлялась методом мультиплексной амплификации с анализом 20 экзонов гена дистрофина и промоторной области. Используемый в настоящее время метод мультиплексной амплификации при проведении молекулярно-генетического ана-
Рис. 1. Алгоритм дифференциальной диагностики псевдогипертрофических ПКМД у лиц мужского пола.
лиза позволяет идентифицировать более 95% всех делеций в гене дистро-фина. Больным женского пола проводилось исследование кариотипа с использованием дифференциальной О-окраски по стандартным методикам. Иммуногистохимический анализ биоптатов четырехглавой мышцы проводился с использованием антител, специфичных С-домену, Яо^домену и Ы-концу белка дистрофина. Мышечный биоптат обрабатывался согласно стандартному иммуноцитохимическо-му протоколу. Для выявления эпитипов
дистрофина использовались антитела □УБ-1, ЭУЗ-2, ЭУЭ-Э “Мотосав^а” (Великобритания).
Результаты и разработанные алгоритмы
На основании проведенного исследования были определены частоты встречаемости ПМД Дюшенна и псевдогипертрофических вариантов ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования. Показано, что 96,7% случаев в группе больных мужского пола
приходится на долю ПМД Дюшенна и лишь 3,3% случаев представлено сар-когликанопатиями. Полученные результаты соответствуют таковым в других европейских популяциях с низким уровнем инбридинга. В противоположность этому среди больных женского пола у 77,8% больных диагностированы аутосомно-рецессивные саркогликанопатии, а 22,2% женщин являлись гетерозиготными носительницами мутации в гене дистрофина. Известно, что возникновение клинических симптомов у таких носительниц происходит в результате преимущественной инактивации Х-хромосо-мы, не несущей мутантный ген, в мышечных клетках либо в результате количественных перестроек одной из Х-хромосом [14, 15]. Полученные нами данные о частотах встречаемости ПМД Дюшенна и саркогликанопатий с аутосомно-рецессивным типом наследования позволили сделать заключение о необходимости первоочередного использования комплекса диагностических методов, направленных на идентификацию ПМД Дюшенна у больных мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофи-ческих форм ПКМД.
На основании результатов собственных исследований и анализа литературных данных нами предложены алгоритмы дифференциальной диагностики этих групп заболеваний у лиц мужского и женского пола, схематически представленные на рис. 1-3.
Как видно из рис. 1, дифференциальная диагностика различных генетических вариантов псевдогипертро-фических ПМД Дюшенна значительно облегчается при наличии информативной родословной, анализ которой позволяет однозначно определить тип наследования заболевания в отягощенной семье (Х-сцепленный рецессивный или аутосомно-рецессивный) и установить генотипы родственников пробандов на основании типов образующихся гамет. Основные сложности при дифференциальной диагностике возникают при отсутствии сегрегации заболевания в семье, где пробанд является единственным больным. Одно-
значная диагностика ПМД Дюшенна у больных мужского пола в таких случаях осуществляется на основании обнаружения делеции или дупликации в гене дистрофина. Однако на основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований показано, что количество делеци-онных вариантов ПМД Дюшенна в различных популяциях мира не превышает 70%, дупликационных - 7-10%. Остальные 20-25% случаев ПМД Дю-шенна обусловлены точковыми мутациями, поиск которых затруднен в силу значительной протяженности гена дистрофина [2, 7, 20, 22].
Существенное значение в диагностике ПМД Дюшенна в семьях с единственным больным мужского пола имело также определение повышения уровня КФК в плазме крови матерей пробандов, свидетельствующее об их гетерозиготном носительстве мутации в гене дистрофина. Однако проведенные исследования, направленные на анализ этого показателя у облигатных носительниц, позволили сделать заключение о том, что он не является абсолютным диагностическим тестом, так как часть облигатных носительниц имеет нормальные значения уровня КФК [1, 20, 22]. Таким образом, при наличии генеалогических данных, свидетельствующих об Х-сцепленной рецессивной сегрегации заболевания, повышении уровня КФК в плазме крови матери пробанда, а также при обнаружении делеции или дупликации в гене дистрофина диагностический этап можно считать завершенным, а диагноз ПМД Дюшенна окончательно установленным.
В том случае, если используемые диагностические методы не позволяют уточнить нозологическую форму псевдогипертрофических ПКМД, необходимым условием дифференциальной диагностики является проведение иммуногистохимического анализа дистрофиновых волокон в биоптате мышечного волокна. При отсутствии или резком снижении количества дис-трофинпозитивных волокон в биоптате диагностика ПМД Дюшенна считается окончательной.
Таким образом, в большинстве случаев псевдогипертрофических ПШД диагностический поиск будет ограничиваться алгоритмом, предложенным на рис. 1. Однако в части случаев (в нашей выборке количество таких больных составляет 3,3%) возникает необходимость продолжения процесса уточнения диагноза на основе идентификации оставшихся четырех генетических вариантов саркогли-канопатий. С этой целью нами предложен следующий алгоритм диагностики псевдогипертрофических ПШД с аутосомно-рецессивным типом наследования (саркогликанопатий), разработанный на основании анализа литературных данных с учетом частот встречаемости различных генетических вариантов этой группы заболеваний. Алгоритм представлен на рис. 2. Установлено, что не менее 50% случаев аутосомно-рецессивных саркогли-канопатий представлено вариантом 2D, который обусловлен мутацией в гене а-саркогликана, кодирующем белок адгалин [5, 8, 10-12]. Это определяет необходимость первоочередного исследования указанной мутации в алгоритме ДН^диагностики. Вторым по частоте генетическим вариантом, на долю которого приходится чуть более 25% всех случаев ПШД, является ПШД 2Е-типа, причиной которой являются мутации в гене р-саркогликана [6, 13, 21]. Два других генетических варианта ПШД - 2С- и 2F-типов, обусловленные мутациями в генах у- и 8-саркогликанов, встречаются в 14 и 2% случаев ПШД соответственно [16, 21, 24, 26]. Таким образом, при проведении ДН^анализа необходимо поочередно исключать 4 генетических варианта 2D-, 2E-, 2C-, 2F-типов, наследующихся аутосомно-рецессив-ным путем.
По нашему мнению, у больных женского пола, так же как и у больных мужского пола с псевдогипертрофи-ческими ПШД, дифференциальнодиагностический поиск должен начинаться с исключения гетерозиготного носительства мутации в гене дистро-фина с последовательным использованием комплекса диагностических
Особенности клинических проявлений + ЭHMГ + №K
Рис. 2. Дифференциально-диагностический алгоритм аутосомно-ре-цессивных ПШД.
методов. Безусловно, носительство мутации в гене дистрофина значительно реже, чем мутации в генах сар-когликанов, будет приводить к появлению клинических признаков заболеваний у лиц женского пола. Однако методы, используемые для диагностики ПМД Дюшенна у женщин, просты и экономически менее затратны. Предложенный алгоритм дифференциальной диагностики псевдогипертрофи-
Рис. 3. Алгоритм дифференциальной диагностики различных вариантов псев-догипертрофических ПКМД у лиц женского пола.
ческих вариантов ПКМД у больных женского пола представлен на рис. 3. Однозначная диагностика гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина может быть сделана на основании генеалогического анализа. Облигатное носительство мутации при Х-сцепленных рецессивных заболеваниях точно устанавливается в трех случаях: 1) женщина является дочерью больного с Х-сцепленным рецессивным заболеванием; 2) у женщины есть больной сын и больной брат; 3) женщина имеет двух больных сыновей. Идентификация саркогликанопатий с аутосомно-рецессивным типом наследования на основе генеалогического анализа однозначно устанавливается при наличии в семье двух больных сибсов женского пола. Если при анализе родословной уточнить тип наследования не удалось, диагностический поиск продолжается. Сначала при кли-
нико-неврологическом исследовании, а затем при кариотипировании исключается один из цитогенетических вариантов синдрома Шерешевско-го-Тернера, затем проводится анализ на наличие несбалансированной лайо-низации одной из Х-хромосом в клетках крови, при отсутствии которой появляется необходимость в иммуно-гистохимическом исследовании био-птатов мышечных волокон. Как и у больных мужского пола, при отсутствии дистрофинпозитивных волокон в части миофибрилл устанавливается гетерозиготное носительство патологической мутации в гене дистрофина -в этом случае делается вывод о том, что клинические проявления обусловлены ПМД Дюшенна.
Предложенные нами алгоритмы дифференциальной диагностики псев-догипертрофических вариантов ПКМД у больных мужского и женского пола
позволяют унифицировать диагностический поиск, уменьшить экономические затраты при проведении обследования больного и повысить эффективность профилактических мероприятий в отягощенных семьях.
Список литературы
1. Дадали Е.Л. Наследственные нервномышечные заболевания: диагностика и медико-генетическое консультирование: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 1999.
2. Иллариошкин С.Н. и др. ДНК-диагнос-тика и медико-генетическое консультирование в неврологии. М., 2002.
3. Мальмберг С.А. Наследственные нервно-мышечные заболевания у детей: современные аспекты электрофизиологии, диагностики и лечения: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2000.
4. Петрухин А.С. Неврология детского возраста. М., 2004.
5. Anastasi G. et al. // Int. J. Mol. Med. 2004. V. 14. P 989.
6. Balci B. et al. // Acta Myol. 2004. V. 23. P. 154.
7. Calvo F. et al. // Neuromusc. Disord. 2000. V. 10. P 560.
8. Carrie A. et al. // J. Med. Genet. 1997. V. 34. P. 470.
9. Dincer P et al. // Neuromusc. Disord. 2004. V. 10. P 247.
10. Dincer P et al. // Ann. Neurol. 1997. V. 42. P. 222.
11. Duggan D.J. et al. // New. Eng. J. Med. 1997. V. 336. P. 618.
12. Eiris-Punal J. et al. // Rev. Neurol. 2002. V. 34. P 486.
13. Fanin M. et al. // Neuromusc. Disord. 2003. V. 13. P 303.
14. Hiramatsu S. et al. // J. Cardiol. 2000. V. 38. P. 35.
15. Hoogerwaard E.M. et al. // Lancet. 1999. V. 353. P 2116.
16. Kefi M. et al. // Neuromusc. Disord. 2003. V. 13. P. 779.
17. Matsumura K. // Ryoikibetsu Shokogun Shirizu. 2001. V. 35. P 88.
18. Nigro V. // Acta Myol. 2003. V. 22. P 35.
19. Nonaka I. // Rinsho Shinkeigaku. 2004. V. 44. P 901.
20. Passos-Bueno M.R. et al. // Amer. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. P 1150.
21. Passos-Bueno M.R. et al. // Amer. J. Med. Genet. 1999. V. 82. P 392.
22. Silbert J.R. et al. // Arch. Dis. Child. 1979. V. 54. P 534.
23. Sunada Y. // Rinsho Shinkeigaku. 2004. V. 44. P 995.
24. Todorova A. et al. // Community Genet. 2002. V. 5. P 217.
25. Vainzof M. et al. // Eur. J. Hum. Genet. 1999. V. 7. P 251.
26. Zatz M. et al. // Amer. J. Med. Genet. 1989. V. 32. P 407. 4
