Алгоритм валидации биологических методик определения гормональной активности лекарственных средств (на примере фолликулостимулирующего гормона) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

АЛГОРИТМ ВАЛИДАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДИК ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРМОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (НА ПРИМЕРЕ ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА)

П.В. Шадрин, Л.В. Симутенко, Т.А. Батуашвили, Н.П. Неугодова, А.И. Лутцева

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: На примере определения биологической активности фолликулостимулирующего гормона разработана и апробирована валидация методики определения специфической активности лекарственных средств, основанная на принципе параллельных линий и отвечающая современным требованиям отечественных и зарубежных нормативных документов.

Ключевые слова: валидация, гормональная активность, фолликулостимулирующий гормон.

VALIDATION ALGORYTHM FOR THE BIOLOGICAL METHODS OF EVALUATING HORMONAL ACTIVITY OF MEDICINES (FOLLICLE-STIMULATING HORMONE CASE STUDY)

P.V. Shadrin, L.V. Simutenko, T.A. Batuashvili, N.P. Neugodova, A.I. Lutseva

Absract: With specific reference to determining biological activity of follicle-stimulating hormone an algorithm of validation methodology for the evaluation of specific activity of medicines, based on collateral lines principle, and up-to-date to domestic and foreign regulations has been developed and evaluated.

Key words: validation, hormonal activity, follicle-stimulating hormone.

Основным требованием к методам контроля качества лекарственных средств (ЛС) является валидация, которую проводят как при разработке новых методик (в том числе фармакопейных), так и при изменении условий их проведения. Необходимость валидации регламентируется ГОСТом Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» [1].

Одним из важнейших показателей качества ЛС, определяемых биологическими методами, является активность. Наиболее часто ее определяют в сравнении со специфической активностью стандартного образца. Для этого применяют принцип параллельных линий: сравнивают эффект не менее двух доз испытуемого препарата и стандартного образца. Расстояние между линиями дозозависимости характеризует специфическую активность испытуемого препарата [2, 3, 4]. Используемые дозы подбирают в зависимости от чувствительности биологических тест-объектов.

Согласно требованиям отечественной и зарубежной нормативной документации, в зависимости от области применения методики (определение подлинности, специфической активности, примесей и т.д.) ее валидацию проводят в соответствии с определенным набором параметров [5, 6]. Методы определения специфической активности ЛС можно отнести к категории 1, которая включает в себя методы количественного определения активных компонентов ЛС [4, 5, 6]. Методики данной категории должны соответствовать следующим параметрам валидации: «Точность», «Воспроизводимость», «Специфичность», «Линейность»

и «Диапазон применения» или «Аналитическая область» (диапазон используемых доз должен как можно полнее охватывать данную область).

Наличие индивидуальной реакции биологических тест-объектов на одну и ту же дозу ЛС приводит к вариабельности результатов и, следовательно, к необходимости использования при статистической обработке специальной схемы дисперсионного анализа. Оценивают достоверность результатов опыта (линейность, дозозависимость и т.д.) и вычисляют доверительный интервал полученной биологической активности, характеризующий точность определения [2, 3, 4]. В зависимости от вида постановки некоторые элементы схемы дисперсионного анализа могут меняться. Воспроизводимость результатов опыта характеризует величина коэффициента X, учитывающего как угол наклона линий дозозависимости, так и дисперсию результатов [7,8,9].

Целью данной работы является разработка и апробация алгоритма валидации методики определения биологической активности ЛС методом параллельных линий на примере фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) при использовании нелинейных крыс из отечественных питомников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основе валидируемой методики лежит метод определения биологической активности урофолли-тропина (препарата ФСГ, получаемого из мочи беременных женщин), изложенный в Европейской фармакопее [3]. Суть метода заключается в увеличе-

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

нии относительной массы яичников (ОМЯ) неполовозрелых крыс-самок в ответ на введение гормона. Испытание проводят с помощью трехдозовой рандомизированной постановки (частный случай метода параллельных линий). Эксперимент выполняют на 6 группах животных, 3 из которых получают 3 разновеликие дозы стандарта, а остальные 3 — такие же дозы испытуемого препарата. Соотношение доз составляет 1:2:4. Растворитель для приготовления разведений — фосфатно-альбуминовый буфер с содержанием гонадотропина хорионического 70 МЕ/мл (рН 7,2).

Валидация методики состояла из следующих этапов:

1. Определение чувствительности крыс к стандартному образцу ФСГ

1.1. Построение кривой «Зависимость относительной массы яичников от логарифма дозы ФСГ».

1.2. Определение аналитической области методики и выбор оптимальных доз ФСГ для контроля показателя «Биологическая активность».

2. Проверка пригодности методики для определения биологической активности ФСГ (схема опыта — трехдозовая рандомизированная постановка).

2.1. Проверка правильности методики (отсутствие непредусмотренного влияния условий опыта на результаты испытания) — серия модельных испытаний «стандарт по стандарту».

2.2. Проверочный анализ серийных образцов (серия испытаний лекарственного препарата, содержащего ФСГ).

Эксперименты выполнены на 780 нелинейных крысах-самках массой тела 35—40 г, полученных из питомника ГУ НЦ «Биомедицинские технологии» РАМН (филиал Андреевка).

Испытуемый препарат — опытные серии мено-тропина. Стандарт — рабочий стандартный образец менотропина (менотропин менопаузный субстанция 75 МЕ/мг ФСГ и 75 МЕ/мг ЛГ, стандартный образец), биологическая активность которого определена по 4-му Международному стандартному образцу ФСГ и ЛГ 98/704 для биологических испытаний.

Подкожное введение стандартного образца и испытуемого препарата выполняли ежедневно дважды в день в течение 3 суток в объеме 0,3 мл на животное. На 5-е сутки у крыс проводили дислокацию шейных позвонков, определяли массу тела в граммах (точность до 0,01 г) и яичников в миллиграммах (точность до 0,001 г).

На первом этапе валидации для определения чувствительности животных и получения кривой зависимости эффекта от логарифма концентрации ФСГ 8 группам крыс, состоящим в среднем из 34 животных, подкожно вводили стандартный образец в концентрациях: 1,5; 3,0; 6,0; 8,0; 16,0; 32,0; 40,0 и 80,0 МЕ/мл (рис.1).

На 2-м этапе (п. 2.1) в 5 модельных опытах «стандарт по стандарту» проведена проверка правильности

методики. В качестве испытуемого препарата использовали стандартный образец. Проверку пригодности методики определения биологической активности (п. 2.2) выполнили с помощью анализа 3 серийных образцов испытуемого препарата.

В соответствии с общими требованиями к валидации методик на разных этапах работы проводили валидацию методики по следующим критериям приемлемости: точность, воспроизводимость, специфичность, линейность, статистическая значимость угла наклона линии дозозависимости, параллельность линий дозозависимости стандартного образца и испытуемого препарата.

Вычисления проводили с помощью компьютерной программы CombiStats, основанной на разделе 5.3 Европейской фармакопеи 6-го издания, рекомендуемой и распространяемой European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM) [3].

Точность результатов оценивали по ширине доверительного интервала рассчитанной биологической активности (не более 0,45 при P=0,95) [6, 10].

Воспроизводимость опытов определяли:

• при нахождении аналитической области, а также при каждом вычислении биологической активности — с помощью коэффициента воспроизводимости X [7—9].

к = s/b,

где s — среднее квадратическое отклонение результатов опыта (разброс); b — коэффициент регрессии (тангенс угла наклона линии зависимости ОМЯ от логарифма концентрации ФСГ).

Следовательно, чем меньше величина коэффициента X, тем выше воспроизводимость результатов опыта.

• для биологической активности в модельных опытах «стандарт по стандарту» с помощью коэффициента вариации v (д.б. не более 10%) [4]:

V = s'/x х 100%, где s' — среднее квадратическое отклонение среднего значения биологической активности в 5 модельных опытах; x — среднее значение биологической активности в 5 модельных опыта.

Специфичность метода заключается в оценке действия ФСГ на массу органов-мишеней (яичников).

Линейность полученных результатов определяли:

• при установлении аналитической области методики — с помощью дисперсионного анализа [10, 6];

• при определении биологической активности ФСГ — с помощью дисперсионного анализа, согласно требованиям Европейской фармакопеи к трехдозовой рандомизированной постановке [3].

Статистическую значимость угла наклона линии дозозависимости оценивали:

• при установлении аналитической области методики — с помощью дисперсионного анализа;

• при определении биологической активности ФСГ — с помощью дисперсионного анализа, согласно требованиям Европейской фармакопеи к трехдозовой рандомизированной постановке [3].

Параллельность линий дозозависимости стандартного образца и испытуемого препарата при определении биологической активности ФСГ оценивали с помощью дисперсионного анализа, согласно требованиям Европейской фармакопеи к трехдозовой рандомизированной постановке [3].

Для выявления чрезмерно отклоняющихся значений (выбросов) применяли «правило 4с» (п>10) [2].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные, характеризующие зависимость среднего значения ОМЯ от логарифма концентрации стандартного образца ФСГ (первый этап валидации), приведены на рис. 1, где была визуально определена аналитическая область методики, соответствующая точкам 4, 5 и 6 (8, 16 и 32 МЕ/мл соответственно). Данный диапазон концентраций проанализировали на линейность, дозозависимость и воспроизводимость реакции.

Проверка линейности реакции животных показала, что наблюдаемое значение критерия Фишера (Бнабл) меньше критического для данного числа степеней свободы (табл. 1, параметр «Нелинейность» статистически незначим), что указывает на линейный характер дозозависимости.

С помощью дисперсионного анализа также была подтверждена статистическая значимость коэффициента регрессии Ь = 3,066 (п = 104, Р=0,95): наблюдаемое значение критерия Фишера больше критического, что свидетельствует о наличии дозозависимости (см. табл. 1, параметр «Регрессия» статистически значим).

Десятичный логарифм концентрации ФСГ

Рис. 1. Зависимость среднего значения ОМЯ от логарифма концентрации стандартного образца ФСГ. Каждая точка имеет порядковый номер и представляет собой среднее арифметическое значение ОМЯ ± полуширина 95% доверительного интервала

О высокой воспроизводимости результатов в данном диапазоне концентраций говорит значение коэффициента X, равное 0,229.

Проведенный анализ показал, что диапазон концентраций 8, 16 и 32 МЕ/мл представляют собой аналитическую область методики определения биологической активности ФСГ. Есть основания полагать, что данные концентрации являются оптимальными для определения биологической активности.

Таблица 1

ДИСПЕРСИОННЫЙ И РЕГРЕССИОННЫЙ АНАЛИЗ ЗАВИСИМОСТИ ОМЯ ОТ ЛОГАРИФМА КОНЦЕНТРАЦИИ ГОРМОНА

Источник дисперсии (параметр) Число степеней свободы Сумма квадратов Средний квадрат Е б набл. Е критич.

Регрессия (дозозависимость) 1 59,6350 59,6350 121,354 >6,9 (Р=0,99)

Нелинейность 1 0,00662674 0,00662674 0,013 <3,94 (Р=0,95)

Обработки (число уровней воздействия) 2 59,6417 29,8208

Отклонение (дисперсия опыта) 101 49,6328 0,491414

Итог 103 109,274 1,06092

Дисперсия опыта в2 = 0,491 (п = 104, Р = 0,95) ^ X = 0,229

Логарифм Наблюдаемое Расчетное среднее Разность

Концентрация, МЕ/мл концентрации среднее значение значение ОМЯ (остаток)

(х) ОМЯ (у) (у’ = а + Ьх) у - у’

8,0 0,9031 0,8734 0,8678 0,0057

16,0 1,2041 1,7794 1,7908 - 0,0113

32,0 1,5052 2,7194 2,7138 0,0057

Регрессионные коэффициенты: а = -1,9012; Ь = 3,0661 (п = 104, Р = 0,95)

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Таблица 2

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА РЕЗУЛЬТАТОВ МОДЕЛЬНЫХ ОПЫТОВ

№ испытания Линейность (P=0,95) Дозозависимость (P=0,99) Параллельность (P=0,95) Биологическая активность (БА), % Доверительный интервал БА при P=0,95, % Ширина доверительного интервала (д.б.<0,45) Коэффициент воспроиз- водимости 1

1 +* + + 95,40 78,71-115,31 0,366 0,159

|2 + + + 107,06 90,30-127,31 0,370 0,143

3 + + + 99,75 84,69-117,47 0,328 0,137

4 + + + 99,85 85,57-116,50 0,309 0,129

5 + + + 103,31 84,21-127,03 0,428 0,171

Среднее значение БА, % 101,07

Среднее квадратическое отклонение среднего значения БА 3,90

Коэффициент вариации среднего значения БА, % (д.б. <10%) 3,86

Здесь и в табл. 3: * «+» — соответствует требованиям Европейской фармакопеи.

Таблица 3

СВОДНАЯ ТАБЛИЦА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРЕХ СЕРИЙ ИСПЫТУЕМОГО ПРЕПАРАТА

№ испытания Линейность (P=0,95) Дозозависимость (P=0,99) Параллельность (P=0,95) Биологическая активность (БА), % Доверительный интервал БА при P=0,95, % Ширина доверительного интервала (д.б.<0,45) Коэффициент воспроиз- водимости 1

1 +* + + 99,94 83,22-120,00 0,368 0,151

I2 + + + 98,04 84,10-117,38 0,333 0,139

3 + + + 92,69 80,91-105,95 0,250 0,113

Второй этап валидации (п.2.1) подтвердил правильность результатов методики при постановке модельных опытов «стандарт по стандарту» (табл. 2).

Видно, что результаты модельных опытов «стандарт по стандарту» по параметрам «Линейность», «До-зозависимость» и «Параллельность» соответствуют требованиям Европейской фармакопеи. О точности результатов свидетельствует ширина доверительного интервала, а о воспроизводимости — низкие значения коэффициента X, а также значение коэффициента вариации среднего значения биологической активности.

Результаты определения биологической активности трех серийных образцов испытуемого препарата с применением валидируемой методики (второй этап, п. 2.2, таблица 3) также соответствовали требованиям Европейской фармакопеи.

ЛИТЕРАТУРА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложена валидация методики определения биологической активности ФСГ, отвечающая современным требованиям отечественных и зарубежных нормативных документов. Этот подход обеспечивает проверку по всем параметрам, которым должны соответствовать методы количественного определения активных компонентов лекарственных средств («Точность», «Воспроизводимость», «Специфичность», «Линейность» и «Диапазон применения»).

Данный алгоритм валидации применим для других биологических методик, основанных на принципе параллельных линий и предназначенных для определения специфической активности различных фармакологических групп лекарственных средств.

1. ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств». М.: Стандартинформ. 2009.

2. Burn J.H., Finney D.J., Goodwin L.G. Biological standardisation. 1950. London.: Oxford Univ. Press.

3. European Pharmacopoeia 6.0, 2008.

4. United States Pharmacopeia 31. 2009. Art.

№ 1225 Validation of compendial procedures.

5. ГОСТ Р 8.563-2009 «Методики (методы) измерений». М.: Стандартинформ. 2010.

6. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств // методические рекомендации / под ред.

Н.В. Юргеля, А.Л. Младенцева,

A.В. Бурдейна, М.А. Гетьмана, А.А. Малина,

B.В. Косенко. М.: 2007.

7. Eneroth G., Ahlund K. Biological assay of insulin by blood sugar determination in mice// Acta Pharm.Suec. 1968. V.5. № 6. P 591-594.

8. Eneroth G., Ahlund K. Exogenous insulin and blood glucose levels in mice. Factors affecting

the dose response relationship// Acta Pharm. Suec. 1970. V.7. P 491-500.

9. Eneroth G., Ahlund K. A twin cross-over method for bioassay of insulin using blood glucose levels in mice-a comparison with a rabbit method// Acta Pharm.Suec. 1970. V.7. № 4. P457-462.

10. Урбах В.Ю. Биометрические методы (статистическая обработка опытных данных в биологии сельском хозяйстве и медицине). М.: Наука. 1964. 415 с.