Алгоритм лабораторного молекулярногенетического исследования для определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам – шаг навстречу персонализированной медицине Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОГО МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИАГРЕГАНТНЫМ ПРЕПАРАТАМ - ШАГ НАВСТРЕЧУ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЕ

О.В. Сироткина1,2, Т.В. Вавилова1

1 ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова,

2 ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова

Ингибирование тромбоцитарной агрегации является в настоящее время ключевым терапевтическим подходом в лечении и профилактике сердечно-сосудистой патологии. Теоретически процесс агрегации тромбоцитов можно блокировать на различных уровнях, однако на практике широкое применение, наряду с Аспирином, нашли блокаторы АДФ-рецепторов тромбоцитов - Клопидогрел и другие препараты из класса тиенопиридинов [1]. Индивидуальный ответ на эту группу лекарств широко варьирует, определяя в ряде случаев клинический исход болезни [2, 3]. Необходимость поиска причин различной чувствительности к антиагрегантым препаратам и сложность в оценке состояния тромбоцитарного гемостаза определяют актуальность разработки новых подходов к анализу функциональной активности тромбоцитов и практического использования полученных результатов.

Материалы и методы

Нами были проанализированы молекулярногенетические и функциональные варианты активности тромбоцитов у 991 человека - больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) (стабильное течение), с острым коронарным синдромом, лиц, перенесших инфаркт миокарда в анамнезе, и практически здоровых лиц. Характеристика больных и добровольцев, включенных в исследование, представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика больных, включенных в исследование, по группам

Группа обследованных лиц Количество Возраст (лет)

Мужчины, перенесшие инфаркт миокарда в возрасте до 45 лет 207 45±0,4

Пациенты, перенесшие инфаркт миокарда после 45 лет 75 58±2

Больные со стабильной формой ИБС 280 61±9

Пациенты с острым коронарным синдромом 101 57±1

Добровольцы без сердечнососудистых заболеваний 328 40±1

Итого 991

Все больные и добровольцы, не имевшие сердечно-сосудистых заболеваний и тромбоэмболических осложнений в анамнезе, дали согласие на проведение как функциональных, так и генетических исследований.

В исследовании были использованы следующие лабораторные технологии: ПЦР с последующим рестрикционным анализом (определение генетических вариантов тром-боцитарных рецепторов, белков-мишеней и ферментов-метаболизаторов - ЬеиЗЗРго GPШa, Пе8438ег GPIIb, С807 Т GPIa, Т13254 С GPVI, С-154 Т GPVI, ТЬг145МеГ GPIba, С18Т P2Y12, G36T P2Y12, A1622G P2Y1, A-842G СОХ-1, A-293G CYP3A4, G6986A CYP3A5, G681A CYP2C19), ПЦР в реальном времени для определения экспрессии генов (измерение уровня матричной РНК GP Ша, GP ПЬ, GP VI, P2Y12,

P2Y1 и P2X1), проточная цитометрия для определения количества рецепторов на мембране тромбоцитов (по величине средней интенсивности флуоресценции после окраски соответствующими антителами), спонтанная агрегация (лазерная агрегатометрия), АДФ- и коллаген-индуцированная агрегация (оптическая агрегатометрия), оригинальный метод оценки индуцированной тромбоцитарной активности на основе проточной цитометрии по изменению относительного количества рецепторов GP IIb- IIIa и уровня экспрессии Р-селектина до и после индукции АДФ, рассчитанному по формулам 1 и 2 [4]:

%CD62P - PE4ДФ+ - %CD62P - PE4ДФ

MFIМФ+ - MFIМФ-

MFIА

-х 100%,

(1)

%CD62P - PE4ДФ+

-x100%

(2)

где МР1ЩФ+ - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb- IIIa после инкубации с индуктором;

MFIАДФ- - средняя интенсивность флуоресценции с антителами к GP IIb- IIIa в отсутствие индуктора.

где %СБ62Р - РЕадф+ - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину, после инкубации с индуктором;

%СБ62Р - РЕАДФ- - количество тромбоцитов, меченных антителами к Р-селектину в отсутствие индуктора.

Результаты и их обсуждение. Клиническая и лабораторная практика показала, что до настоящего времени отсутствует какой-либо лабораторный тест, который с достаточной информативностью может указывать на сниженную чувствительность к антиагрегантам. Ведется поиск новых методов анализа функциональной активности тромбоцитов, а также остаточной реактивности тромбоцитов на фоне антиагрегантной терапии [5-7].

В результате проведенного нами исследования было показано, что генетические варианты рецепторов GP 11Ь- 111а, Р2У12, GP VI и GP 1а- 11а, количество рецепторов GP 11Ь- 111а,

5--1 I- -

12,1

3&Е

Ile843Ser GPIIb

T13254C GPVI

ul *

5^1----1 20

= 20 17,2 ГГ

- 15---П----------— г

^ 10,5

1НИЕЗЕ!

u Л n<t> Л nrh J.

■ генотип NN ■ генотип NM + MM *р = 0,03 *р = 0,025

■ (-154)CC GPVI ■ (-154)CT+TTGPVI *p = 0,0002 *p = 0,0006

20,8

10,8

Se

S 25 Q

x 20

I 15

S

* 10

с

і 5

в 0 fVA'*' - W T

■ 807CC GPla ■ 807CT + TTGPla *p = 0,007 **p = 0,015

Рисунок 1. Зависимость функциональной активности тромбоцитов, измеренной методом проточной цитометрии, от генетических вариантов рецепторов GP IIb- IIIa, P2Y12, GP VI и GP la- lia: а - значение параметра К1 в зависимости от Ile843Ser GPIIb и T13254C GPVI; б - количество рецепторов фибриногена GP IIb- IIIa до и после активации 10 мкМ АДФ в зависимости от C-154T GP VI; в - число клеток, экспрессирующих на поверхности Р-селектин, до и после активации 10 мкМ АДФ в зависимости от С807Т GP Ia

25

20

Рисунок 2. Показатели коллаген-индуцированной агрегации у пациентов и доноров в зависимости от генотипов рецептора GP VI (а) и GP la- Ila (б)

Таблица 2.

Параметры спонтанной и АДФ-индуцированной агрегации у доноров с различными генотипами рецептора фибриногена GP IIb- Illa

Исследуемые параметры Leu33Pro GP IIIa Ile843SerGPIIb

LeuLeu ProPro+LeuPro IleIle IleSer+SerSer

R макс 1,26±0,06 1,80±0,24* 1,19±0,06 1,31±0,11

V макс (AR/мин) 0,59±0,09 0,62±0,10 0,69±0,15 0,62±0,18

Т (%) 26,6±5,3 30,8±70,3 40,7±7,8 60,3±4,7**

V (%/мин) 31,7±3,4 4 , U-J I+- * 29,6±5,4 32,0±3,2

*р = 0,03 между носителями ЬеиЬеи и ЬеиРго+РгоРго; ~р = 0,049 - Пе8ег+8ейег против 11е11е; ***р=0,08 - РгоРго+ЬеиРго против ЬеиЬеи Таблица 3.

Зависимость скорости АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов от генотипов С18Т и G36T гена Р2У12 у мужчин, перенесших ИМ, и в контрольной группе

Генотипы V ,%/сек max’

ИМ Контроль

CC18 1,01±0,08 1,10±0,09

CT18+TT18 0,84±0,05* 1,19±0,08

GG36 0,92±0,06 1,12±0,06

GT36+TT36 0,93±0,08 1,31±0,16**

*р = 0,03 - по сравнению с СС18; ~р = 0,07 - по сравнению с GG36 Таблица 4.

Корреляция степени АДФ-индуцированной агрегации с количеством рецепторов фибриногена GP IIb- Illa и АДФ-рецепторов P2Y12, P2Y1 и уровнем экспрессии соответствующих генов

Рецептор/ген R p

GP IIb- IIIa/мРНК GP IIb 0,37/0,31 0,01/0,03

P2Y12/nPHK P2Y12 0,44/0,38 0,009/0,003

P2Y1/мРНК P2Y1 0,39/0,33 0,02/0,005

*

з 70 *

<Б 50

со 40

пен 30

£ 20

10 1 1

п

А-842О СОХ-1 Т13254С ОРУ!] ■ Норма ■ Мутация *р = 0,09

Рисунок 3. Изменение степени коллаген-индуцированной агрегации на 14-й день терапии Аспирином в зависимости от полиморфизмов генов GP VI и СОХ-1

■ До терапии ■ 14 дней терапии *р = 0,01 **р = 0,04

Рисунок 6. Изменение количества свободных АДФ-рецепторов Р2У1 и Р2У12 на 14-й день терапии Клопидогрелом

. 45_

- 40_

35_

30_

25— 2,5 мкМ АДФ 2015105

• 0-

Клопидогрел

2,5 мкМ АДФ * І 77

--1-1- - -2,5 мкМ АДФ—

тт

10 мкМ АДФ

_еиРго+РгоРго

) 45_

- 40_ ! 35-¡я 30_

25 2,5 мкМ АДФ

20—

Клопидогрел

10 мкМ АДФ

15—

О 10—

5

б. 0—

СС СТ + ТТ

■ До терапии ■ 14 дней терапии *р < 0,05

Рисунок 4. Зависимость АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне терапии Клопидогрелом от 1_еи33Рго вР !!!а (а) и С18Т Р2У12 (б)

*

ции 50

н 20

епе 10

о 0-

1 мкМ АДФ 2,5 мкМ АДФ 5 мкМ АДФ 10 мкМ АДФ

■ ОО генотип ■ ОА + АА генотип *р < 0,05

Рисунок 5. Изменение степени АДФ-индуцированной агрегации на 14-й день терапии Клопидогрелом в зависимости от полиморфизма в6986А СУР3А5

10 мкМ АДФ

_еи1_еи

10 мкМ АДФ

2,5 мкМ

Р2У12 и Р2У1 и уровень экспрессии соответствующих генов определяют повышенную функциональную активность тромбоцитов у пациентов с сердечно- сосудистыми заболеваниями и доноров без тромбоэмболической и сердечно-сосудистой патологии в анамнезе (рис. 1,2, табл. 2-4).

Некоторые генетические варианты оказались значимыми для функционального ответа тромбоцитов на прием антиагрегантов. Модулирующее влияние на чувствительность к Аспирину оказывали полиморфизмы рецептора коллагена Т13254С GP VI и циклооксигеназы I типа и A-842G СОХ-1 (рис. 3).

Ответ на терапию Клопидогрелом модулировался генетическими вариантами рецепторов к фибриногену, к АДФ, цитохрома СУР3 А5 и количеством АДФ-рецепторов на поверхности тромбоцитов (рис. 4-6).

Таким образом, при индивидуализации лечения антиагрегантами необходимо учитывать генотип пациента, который может влиять на эффективность лекарственного средства.

Результаты исследований других авторов подтверждают наш тезис о необходимости проведения комплексного анализа. Так, Магсиссі И. и соавт. показали, что только лабораторные тесты с использованием нескольких агонистов могут адекватно отразить состояние тромбоцитарного гемостаза и выявить высокую реактивность тромбоцитов на фоне терапии. Авторы отмечают, что анализ агрегации

тромбоцитов с одним индуктором не способен предсказать повторные сердечно-сосудистые осложнения [8].

Следует отметить, что до сих пор не сформулирован четкий алгоритм обследования пациентов с целью выявления факторов риска высокой реактивности тромбоцитов, в т. ч. генетических, и рекомендации по тактике антиагрегантной терапии, основывающихся на проведенных лабораторных исследованиях. Помимо трудностей лабораторного определения состояния «резистентности» к антиагрегантным препаратам, существует проблема преодоления низкой чувствительности к лекарственному средству, решить которую возможно только с позиций персонализированной медицины. Уже появились сообщения о снижении функциональной активности тромбоцитов, остающейся высокой при приеме Аспирина в дозировке

100 мг/день, путем увеличения дозы препарата до 325 мг/день [9], а также о возможном повышении дозы Клопидогрела или замене Кло-пидогрела на антагонисты АДФ-рецепторов последнего поколения (Прасугрел, Элиногрел, Тикагрелор), GP №- ПЬ блокаторы, антагонисты рецепторов тромбина [10, 11].

Суммировав литературные данные и обобщив собственные результаты, мы сформировали алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам (рис. 7).

Первичная оценка больного дает сведения о проводимой терапии: пациент либо не принимает никаких антиагрегантных препаратов, либо принимает Аспирин в стан-

ПЕРВИЧНАЯ ОЦЕННД БОЛЫНОГО С С«

/Ч

Ншт йнімгідоянімай

Сйлрг Делимые

Аслнр*мі №0 йяг/димь

о**аяш*о й а и т слш

АДФ--ндуцнрбмгнн** ■грфгшин (2.5. а н 10 мМ АДФ)

ПрО'Г'ОЧмши

сЛ1 чК2

АГр*ґйгЦНЛ

СШрті

1^ ІвиїїРгрСі

±

ТІЇІЖДОШ А-ВДйСОК-1

1 РЕшЁниб \

п-

_: :

100 МГ/ДОЬ МЛОАНДОКрСЛ її МІ /д-гн*.

і ^

ОРРСФГ/ЇГМІРГ футмц44ДОдМ!*НФ0 (*ф«ии$ОЦМГЛачі

£

£

Т ТІифіицмиК»*. №1А И Т ІДО}«»*. Т їадлмгвн]»»* Мутации Т ІЇ2І4С СР VI. Т 4АДОэЗед Т [ч>м™0*30* Муті чим ЦліІІРта СР (Пі, С1НТ Р2¥1і

\РЕШЕНИЕ І

и:

Корргнци* »»рипим Ні

ТргВкгггї»ч

-

ш-

г

іКанчт^іиль фрмтцыймйХкмйй и

і

Рисунок. 7. Алгоритм лабораторного молекулярно-генетического исследования для оценки функционального состояния тромбоцитов у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и определения индивидуальной чувствительности к антиагрегантным препаратам

дартной дозе 100 мг/день. Первым шагом является анализ функциональной активности тромбоцитов с использованием нескольких подходов: АДФ-индуцированная агрегация при нескольких концентрациях индуктора (рекомендуемыми являются 2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ АДФ), коллаген-индуцированная агрегация, исследования функциональной активности на проточном цитометре с расчетом параметров Kl и К2. Одновременно проводится молекулярно-генетический анализ следующих полиморфизмов - Ьеи33Рго GPШa, С18Т Р2У12, Т13254С GPVI, G6986A СУР3А5 и A-842G СОХ-1. По результатам исследований может быть принято первое клиническое решение - назначение или изменение антиагрегантной терапии.

Вторым шагом является следующее определение функциональной активности тромбоцитов не ранее чем через 7 дней скорректированной терапии.

Если у пациента отсутствуют генетические нарушения, а показатели функциональной активности тромбоцитов снизились по сравнению с исходной точкой и составляют менее 50% для степени АДФ- и коллаген-индуцированной агрегации, с удлинением лаг-фазы коллаген-индуцированной агрегации, и менее 10 и 50% для показателей цитометрического анализа Kl и К2, соответственно, можно сделать заключение об эффективном действии антиагрегант-ной терапии и продолжать прием назначенных лекарственных препаратов в стандартной дозировке в течение рекомендованного срока согласно диагнозу.

Сохраняющаяся высокая функциональная активность тромбоцитов на фоне двойной антиагрегантной терапии Клопидогрел (75 мг/ день) + Аспирин (100 мг/день) по сравнению с исходной с показателями степени индуцированной агрегации тромбоцитов больше 50% для всех индукторов и параметрами ^>10% и К2>50%, особенно при детекции у данных пациентов генетических вариантов ЬеиЗЗРго GPШa, С18Т Р2У12 или G6986A СУР3А5, гово-

рит о развитии «клопидогрел-резистентности» и риске повторных сердечно-сосудистых событий. В таком случае следует пересмотреть тактику антиагрегантной терапии. В первую очередь может быть рекомендовано увеличение дозы Клопидогрела до 150 мг/день, доза Аспирина остается стандартной (100 мг/день). Если дальнейшее наблюдение за больным не покажет положительной динамики в снижении функциональной активности тромбоцитов, следует поставить вопрос о смене антиагрегантной терапии - второе клиническое решение.

В любом случае контроль за антиагре-гантной терапией необходимо продолжать, особенно если была проведена коррекция дозы Аспирина и Клопидогрела, для предотвращения как состояний с сохраняющейся высокой активностью тромбоцитов (остается риск повторных сердечно-сосудистых заболеваний), так и геморрагических осложнений при чрезмерном подавлении тромбоцитарной функции. При выборе тактики антиагрегантной терапии особое внимание необходимо уделять соблюдению баланса между уменьшением риска развития сердечно-сосудистой патологии и одновременной минимизацией риска геморрагий, это положение согласуется с мнением других исследователей [12].

Таким образом, нами предложен алгоритм лабораторного обследования пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, получающих антиагрегантную терапию, с учетом индивидуальной генетически детерминированной чувствительности к Клопидогрелу и Аспирину, с использованием современных молекулярных технологий.

Литература

1. Meadows TA, Bhatt DL. Clinical aspects of platelet inhibitors and thrombus formation. Circ Res 2007; 100: 1261-1275.

2. Matetzky S, Shenkman B, Guetta V., Shechter M, Bienart R, Goldenbergl, Novikov I, Pres H, Savion N,

Varon D, Hod H. Clopidogrel resistance is associated with increased risk of recurrent atherothrombotic events in patients with acute myocardial infarction. Circulation 2004; 109: 3171-3175.

3. Geisler T, Schaeffeler E, Dippon J, Winter S, Buse V., Bischofs C, Zuern C, Moerike K, Gawaz M, Schwab M. CYP2C19 and nongenetic factors predict poor responsiveness to clopidogrel loading dose after coronary stent implantation. Pharmacogenomics 2008; 9 (9): 1251-1259.

4. Сироткина ОВ, Боганькова НА, Ласко-вец АБ, Кухарчик ГА., Гайковая ЛБ, Вавилова ТВ. Иммунологические методы в оценке функциональной активности тромбоцитов у больных с сердечно- сосудистыми заболеваниями. Медицинская иммунология 2010; 12 (3): 213-218.

5. Salles I., Broos K, Fontayne A, Szanto T, Ruan C, NurdenAT, VanboorelbekeK, DeckmynH. Development of a high- throughput ELISA assay for platelet function testing using platelet- rich plasma or whole blood. Thromb Haemost 2010; 104 (2): 392-401.

6. Paniccia R,Antonuucci E,Maggini N, Miranda M, Gori AM, Marcucci R, Giusti B, Balzi D, Prisco D, Abbate R. Comparison of methods for monitoring residual platelet reactivity after clopidogrel by point- of- care tests on whole blood in high- risk patients. Thromb Haemost 2010; 104 (2): 287-292.

7. Barragan P,PaganelliF, Camoin-Jau L,BourguetN,

Boulay- Moine D, Moulard M, Bonello L. Validation of a novel ELISA- based VASP whole blood assay to measure P2Y12-ADP receptor activity. Thromb Haemost 2010; 104 (2): 410-411.

8. Marcucci R, Gori AM, Paniccia R, Giusti B, Valente S, Giglioli C, Buonamici P., Antoniucci D, Abbate R, Gensini GF. High on-treatment platelet reactivity by more than one agonist predict 12-month follow- up cardiovascular death and non- fatal myocardial infarction in acute coronary syndrome patients received coronary stenting. Thromb Haemost 2010; 104 (2): 279-286.

9. Brambilla M, ParolariA, Camera M, Colli S, Eligini S, Centenaro C, Anselmo A, Alamanni F, Tremoli E. Effect of two doses of aspirin on thromboxane biosynthesis and platelet function in patients undergoing coronary surgery. Thromb Haemost 2010; 103: 516-524.

10. Zurn CS, Geisler T, Gawas M. ADP-receptor blockade: a case for personalized pharmacotherapy? Thromb Haemost 2010; 103: 496-506.

11. Barrero AE. Platelet reactivity tests: why they are usful and which ones to use. E-Journal of the ESC Council for Cardiology Practice 2010; 18 (18): 1-5.

12. MerliniP. New antiplatelet agents: why they are badly needed by the cardiologist. Pathofysiology of Haemostasis and Thrombosis 2009-2010; 37 (Suppl.1): P17.

ПОДПИСНАЯ КАМПАНИЯ НА 2013 ГОД

Журнал «Атеротромбоз» основан в 2008 г. Национальным обществом по атеротромбозу.

Представляемая информация будет весомым подспорьем клиницистам, организаторам здравоохранения и сотрудникам фармацевтических фирм. Публикуемые материалы в журнале «Атеротромбоз» полезны и интересны научным работникам и могут быть использованы в преподавательской работе, для повышения квалификации и уровня знаний.

Среди авторов журналаизвестныеученые, ведущиеисследователи и аналитики.

Журнал распространяется БЕСПЛАТНО (2 номера журнала «Атеротромбоз» и 1 номер журнала «Медицинский совет. Кардиология») по подписке.

Вам нужно заполнить ФОРМУ ПОДПИСКИ НА ЖУРНАЛ

внизу этой страницы и выслать заполненную форму в адрес редакции любым удобным для вас способом:

• по факсу: (495) 780-34-26

• по e-mail: podpiska@remedium.ru

• по адресу: 105082, г. Москва, а/я 8, ООО «Ремедиум»

ФОРМА ПОДПИСКИ НА ЖУРНАЛ

Ф.И.О__________________________________________________________________________

Специальность__________________________________________________________________

Место работы (наименование организации)________________________________________

Адрес организации______________________________________________________________

Адрес доставки журнала_________________________________________________________

Телефон_________________________________________________________________________________

E-mail__________________________________________________________________________________

Согласие на обработку и использование персональных данных_______________________________

(подпись)