CC BY
105
ОСНОВНЫЕ СООБЩЕНИЯ
ISSN 1561-6274. Нефрология. 2001. Том 5. №3.
Ù Л.Н.Иванова. 2001 УДК 612,015:612.465
Л. Н. Иванова
АКВАПОРИНЫ ПОЧЕК: СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, РЕГУЛЯЦИЯ L.I. Ivanovo
AQUAPORINES OF THE KIDNEYS: STRUCTURE, FUNCTION, REGULATION
г. Новосибирск, Россия
Введение. Молекулярные механизмы трансмембранного движения воды долгое время оставались неясными, хотя уже с 1950-х годов на основе биофизического анализа осмотического тока воды через эпителий кожи лягушки и мембрану эритроцитов было сформировано представление о существовании водных пор, пронизывающих липидный бислой [Koefeed, Johnson, Ussing, 1953; Macey, 1970]. Было обнаружено, что в эпителии различных частей нефрона также находятся пути облегченного движения воды: в проксимальных канальцах, характеризующихся высокой проницаемостью, и в собирательных трубках, где водная проницаемость регулируется вазопрессином [Burg, 1972]. Ультраструктурные исследования эпителия собирательных трубок позволили выявить, что увеличение проницаемости, вызванное вазопрессином, сопровождается появлением в апикальной мембране кластеров частиц в результате слияния с мембраной везикул, содержащих агрегаты этих частиц [Ganóte et al,, 1968; Grantham et al, 1969; Harmanchi et al., 1980]. Предполагалось, что внутримемб-ранные частицы представляют собой селективные водные каналы, обеспечивающие высокую проницаемость эпителия.
Прогресс в изучении молекулярной природы водных каналов был достигнут за последнее десятилетие после открытия в 1988 г. в лаборатории Питера Агри [Denker et al., 1988] внутримембран-ного белка CHIP-28 (channel-forming integral protein, 28 kDa). В 1991 г. была изолирована кДНК CHIP-28 [Preston, Argre, 1991], и вскоре использование комплекса современных биофизических и молекулярно-биологических методов позволило изучить его структуру, оценить специфическую локализацию и исследовать функциональные свойства [Preston et al., 1992; Fushimi et al., 1993]. СШР-28 был функционально идентифицирован как белок водных каналов, аквапорин (AQP1). К настоящему времени клонировано семейство аквапоринов (более 10 белков и их разновидностей), формирующих водные каналы в
клеточных мембранах у млекопитающих, амфибий, различных беспозвоночных животных, растений и бактерий [Chrispils, Arge, 1994; Knepper, 1994; Verkman et al., 1996]. Нумерация аквапоринов, начиная с CHIP-28—AQP1, связана с последовательностью их идентификации.
Структура аквапоринов. Аквапорины — небольшие гидрофобные трансмембранные белки массой от 26 до 34 kDa [Knepper, 1994; Verkman, Mitra, 2000]. Полипептидная цепь каждого мономера 6 раз пронизывает мембрану. N- и С-терминалы и две петли локализованы в цитоплазме клетки, 3 петли расположены внекле-точно. Биохимические и структурные исследования показали, что в мембране аквапорины формируют гомотетрамеры, при этом каждый мономер образует собственную функциональную водную пору. Предполагается, что тетра-мерная структура необходима для стабилизации индивидуальных мономеров. Предсказанный диаметр одиночной поры соответствует диаметру молекулы воды, ~3,8Â, что обусловливает высокую селективность водных каналов [Zhang et al., 1993]. Сиквенс аквапоринов млекопитающих различного типа показал, что их аминокислотная идентичность лежит в пределах 19-52% [Preston et al., 1994; Shi et al., 1995; Bai et al., 1996]. Соответственно структуре генов, гомологии аминокислотной последовательности и функции в настоящее время выделяют строго специфичные «аквапорины» (AQP1, 2, 4, 5, 6 и 8), проницаемые только для воды, и «ак-ваглицеропорины» (AQP3, 7 и 9), помимо воды, пропускающие глицерин, мочевину и даже более крупные молекулы [Кперрег, 1994; Verkman et al., 1996]. Отличительной особенностью ак-ваглицеропоринов является наличие в их молекуле дополнительных 15-20 аминокислот в экстраклеточных петлях С и Е. Специфичность тканевой локализации белков-аквапоринов соответствует их индивидуальной роли в транспорте жидкости через различные типы эпителиальных клеток [Verkman, Mitra, 2000].
Почечные аквапорииы. Локализация. В почке млекопитающих и человека экспрессируются по крайней мере 4 типа аквапоринов (AQP1, 2, 3 и 4), где они опосредуют быстрый транспорт воды через высоко проницаемый эпителий и играют ключевую роль в процессе осмотического концентрирования и разведения мочи [Кпер-per et al., 1996]. AQP1 экспрессируется не только в почке, но в большинстве исследованных органов и тканей. Для проксимальных канальцев и нисходящего колена петли Генле характерен чрезвычайно высокий уровень AQP1. Количественное определение AQP1 в изолированных сегментах почечных канальцев выявило необычайно высокий уровень экспрессии этого белка (более 20 млн копий на клетку в проксимальном канальце и даже более — в нисходящем сегменте петли Генле). Такой экстраординарный уровень хорошо коррелирует с очень высоким коэффициентом водной проницаемости, характерным для этих сегментов нефрона. AQP1 практически не выявлен в тонком и толстом восходящих сегментах петли Генле, слабо проницаемых для воды, в дистальных извитых канальцах и собирательных трубках. Субклеточная иммунолокализация AQP1 — апикальная и базолатеральная мембраны [Nielsen et al., 1993; Maeda et al., 1995], что объясняет быстрый водный транспорт через оба барьера, образуемых плазматическими мембранами.
Особую роль в процессе осмотического концентрирования играет система собирательных трубок, водная проницаемость которых регулируется вазопрессином (VP). В собирательных трубках выявлены 3 типа аквапоринов: AQP2, AQP3 и AQP4. Норзерн-блот анализ экспрессии мРНК AQP2 в различных органах показал, что этот тип AQP синтезируется только в почке [Fushimi et al., 1993]. AQP2 локализован в апикальной мембране и в субмембранных везикулах главных клеток на всем протяжении собирательных трубок [Nielsen et al., 1993; Yamamoto et al., 1995; Kishore et al., 1996]. Такая локализация полностью согласуется с шаттл-гипотезой, соответственно которой агрегаты частиц перемещаются из внутриклеточных везикул в апикальную мембрану путем VP-стимулирован-ного экзоцитоза [Wade et al., 1981]. Челночный процесс перемещения AQP2 продемонстрирован в изолированных канальцах до и после обработки вазопрессином [Nielsen et al., 1995; Knepper et al., 1996]. Уровень экспрессии AQP2 достигает 12 млн копий на клетку, что коррелирует с высокой проницаемостью эпителия собирательных трубок в присутствии VP [Knepper et al., 1996].
AQP3 экспрессируется не только в почке, но и в других тканях (желудочно-кишечном трак-
те, селезенке) [Ishibashi et al., 1994]. В почке AQP3 выявляется так же, как и AQP2, в главных клетках кортикального и медуллярного сегментов собирательных трубок, с преимущественной локализацией в основании внутренней медуллы. В отличие от AQP2 он локализован в базолатеральных мембранах и практически отсутствует в цитоплазматических везикулах [Echevarría et al., 1994; Ecelbarger et al., 1995; Yamamoto et al., 1995]. AQP3 относится к группе акваглицеропоринов и, помимо воды, проницаем для мочевины [Echevarría et al., 1995; Verkman, Mitra, 2000]. Характерной особенностью AQP3 является его высокая чувствительность к препаратам ртути, при этом блокада проницаемости полностью снимается дитиот-риетолом [Echevarría et al., 1994].
В базолатеральных мембранах главных клеток собирательных трубок локализован и AQP4, экс-прессирующийся также в мозге, легких и скелетных мышцах [Jung et al., 1994]. В почке область его распространения ограничивается 2/з внутренней медуллярной части собирательных трубок. Во внутриклеточных везикулах, как и AQP3, AQP4 выявляется слабо. Хотя AQP3 и AQP4 ко-локализованы в базолатеральной мембране, AQP4 распределен примерно одинаково в латеральном и базальном домене, тогда как AQP3 преобладает в латеральных лабиринтах [Terris et al., 1995]. AQP4 уникален среди других водных каналов, поскольку транспорт воды через него не ингибируется соединениями ртути [Ма et al., 1996]. Водная проницаемость базолатеральных мембран в 4 раза выше, чем апикальной [Fla-mion, Spring, 1990], что может быть объяснено конституционным присутствием AQP3 и AQP4. В условиях антидиуреза, когда массивные потоки воды идут через клетку, высокая проницаемость аквапоринов базолатеральной мембраны собирательных трубок является необходимым условием предотвращения внутриклеточных компартмен-тов от разведения [Strange, Spring, 1987].
Регуляция системы аквапоринов почки. Соответственно современным представлениям, факторы, способные влиять на концентрирующую функцию почек, проявляют свое действие путем модуляции состояния аквапоринов в собирательных трубках. Вазопрессин (VP) — единственный из известных гормонов, способный быстро повышать водную проницаемость эпителия. Его эффект в изолированных канальцах и in vivo начинает проявляться в течение 40 с и достигает максимума к 40-50 мин [Wall et al., 1992]. При длительном водном дефиците у животных и человека уровень VP в крови резко повышен и, соответственно, длительное время сохраняется высокая проницаемость эпителия собирательных трубок.
В регуляции трансэпителиального водного транспорта выделяют 2 независимых механизма, реализующих эффект VP различной длительности на аквапорины:
— быстрая регуляция водной проницаемости (30—40 мин), которая является следствием перемещения AQP2 из внутриклеточных везикул и их встраивания в апикальную мембрану и
— долгосрочная регуляция проницаемости собирательных трубок при ограничении приема воды в результате увеличения биосинтеза AQP2.
Быстрая регуляция проницаемости собирательных трубок, экспрессирующих AQP2, достаточно полно охарактеризована. С использованием количественной иммуно-электронной микроскопии и других методов показано непосредственное влияние VP на перемещение AQP2 из внутриклеточных везикул в плазматическую мембрану. Этот эффект реализуется через V2 рецепторы и цАМФ-зависимое фосфо-рилирование аквапорина протеинкиназой А по серину-256 [Кперрег et al., 1996; Nishimoto et al., 1999]. Удаление из инкубационной среды гормона или понижение его уровня в крови при водной нагрузке приводит к обратному перемещению AQP2 в везикулы. Встраивание AQP2 в мембрану и его возвращение в субмембранные везикулы являются независимыми процессами и определяются взаимодействием VP с PGE2. PGE2 не влияет на фосфорилирование AQP2 и его встраивание в мембрану, индуцированное VP, но стимулирует эндоцитоз AQP2 и его возвращение в цитоплазматический пул [Fushimi et al., 1997; Zelenina et al., 2000]. 2-дневное введение крысам индометацина приводит к поразительному сдвигу AQP2 из фракции внутриклеточных везикул во фракцию плазматических мембран внутренней медуллы [Ecelbarger et al., 1997]. Пока остается неясным, какие именно мембранные протеины везикул, содержащих AQP2, участвуют в «фиксации», их перемещение и слияние с мембранной и какова роль цАМФ-зависимого фосфорилирования везикулярных белков в этом процессе.
Длительная регуляция AQP2 осуществляется на геномном уровне. У крыс, дегидратированных 24—48-часовой водной депривацией, в собирательных трубках значительно увеличивается уровень мРНК аквапорина 2 и количество белка как в мембране, так и в везикулах [DiGiovanni et al., 1994; Terris et al., 1996; Kisho-re et al., 1996]. Сигналом, стимулирующим транскрипцию гена AQP2 в условиях дегидратации, является, очевидно, VP, поскольку повышение содержания мРНК AQP2 наблюдалось при длительном (5 сут) введении гормона крысам Браттлборо, лишенным эндогенного VP, и этот эффект полностью блокировался при од-
новременном введении VP и антагониста рецепторов V2 [Fujita et al., 1995; Hayashi et al., 1996; Terris et al., 1996]. Долговременный эффект VP на транскрипционном уровне осуществляется так же, как и быстрый эффект благодаря включению аденилатциклазного механизма с У2-рецепторов. Образующийся цАМФ в 2—3 раза повышает активность промотора гена AQP2, который содержит как цАМФ-респон-сивный элемент (CRE), так и другие cis-эле-менты (АР сайт и SP1 сайт). Взаимодействие этих элементов приводит к активации промотора гена AQP2 и накоплению белка AQP2 [Hozawa et al., 1996; Matzumura et al., 1997; Yasui et al., 1997]. Водная нагрузка сопровождается быстрым снижением содержания мРНК (на 50% за 20 мин) вследствие деградации [Sasaki et al., 1998]. Таким образом, один и тот же посредник — цАМФ-используется вазопресси-ном при осуществлении как краткосрочного, так и долгосрочного эффектов. Другие факторы, модулирующие диурез (гипокалиемия, гиперкальциемия, обструкция уретры и различные лекарственные препараты), очевидно, также реализуют свое действие на проницаемость собирательных трубок через систему аквапори-нов, но прямые доказательства получены лишь для лития, который вызывает диурез путем резкого снижения AQP2 в апикальной мембране [Marples et al., 1995].
Регуляция AQP3 менее изучена. Быстрого перемещения AQP3 из везикул в базолатераль-ную мембрану не установлено. Следы AQP3 в везикулярных структурах скорее всего отражают перемещение белка из аппарата Гольджи в мембрану в процессе биосинтеза [Yamamoto et al.,
1994]. В то же время долгосрочная регуляция AQP3 со значительным увеличением количества белка в почечной медулле при водной депри-вации или при длительном введении VP четко продемонстрирована [Nielsen et al., 1993; Eche-varia et al., 1994; Ecelbarger et al., 1995]. Активность промотора гена AQP3 возрастает под влиянием форболовых эфиров, но не цАМФ, однако, индукция экспрессии мРНК AQP3 не столь выражена, как AQP2 [Umenishi et al., 1996]. У крыс Браттлборо инфузия VP вызывала индукцию экспрессии AQP3 так же, как и AQP2. Вероятно, VP активирует не только V2, но и Vrpe-цепторы, сопряженные с системой Са2+ — про-теинкиназа С. Активация этой системы стимулирует транскрипцию AQP3, вероятно, через АР2-элемент в промоторе гена [Inase et al.,
1995]. Таким образом, вазопрессин дает долгосрочный эффект в одних и тех же клетках собирательных трубок через две различные сигнальные системы, стимулиря транскрипцию генов AQP2 и AQP3 и на длительное время повышая
проницаемость для воды апикальной и базола-теральной мембран.
Экспрессия AQP1, локализованного в проксимальных канальцах и нисходящих сегментах петель Генле, и AQP4, колокализованного с AQP3, не изменяется ни при остром, ни при длительном повышении уровня VP в крови.
Лквапорины в развивающейся почке. Известно, что в раннем возрасте почка млекопитающих не чувствительна к VP, и полная компетентность по отношению к этому гормону устанавливается к концу периода молочного вскармливания [Siga, Horster, 1991 J. Очевидно, к этому времени должны быть сформированы все звенья внутриклеточных реакций, обеспечивающих физиологическую реакцию на гормон. Установлено, что у крыс в процессе развития возрастает экспрессия гена рецептора вазо-прессина типа V2, увеличивается число рецепторов, изменяются их свойства [Соленов, Иванова, 1992, 1997; Hirasawa et al., 1994]. Сложный онтогенетический паттерн характерен для экспрессии гена а-субъединицы сопрягающего Gj-белка, рецепторных и каталитических свойств цАМФ-зависимой протеинкиназы [Иванова и др., 1990; Соленов и др., 1991; Зеленина и др., 1994]. Найдены изменения и в конечном звене цепи реакций, индуцируемых VP. Выявлено прогрессирующее нарастание экспрессии гена AQP2, формирующего водные поры в апикальной мембране клеток эпителия собирательных трубок. Количество белка AQP2 также возрастает, но корреляция с активностью гена AQP2 устанавливается лишь к концу периода молочного вскармливания [Solenov et al., 1999]. Процесс транслокации AQP2 из внутриклеточных везикул в мембрану в условиях дегидратации или действия dDaVP проявляется как у взрослых, так и новорожденных крыс, однако, у последних при этом не наблюдается увеличения осмоляльности мочи [Bonilla-Felix, Jiang, 1997], что дает основание прийти к заключению, что хотя экспрессия AQP2 играет значительную роль в развитии концентрирующей функции почек, но это не является главным лимитирующим фактором и необходимо формирование единой консолидированной системы, способной реализовать трансдукцию и реализацию сигнала VP.
Аквапорины и патология водного обмена. Для оценки вклада аквапоринов в патогенез различных нарушений водного обмена в настоящее время используются экспериментальные модели, у которых методом направленного трансге-неза «выбит» ген аквапорина определенного типа (нокаутные мыши) [Ма et al., 1999; Verkman, 1999]. У таких животных найдены множественные фенотипические отклонения, соответствен-
но, основной функции аквапоринов: дефект концентрирующей функции при нокауте гена AQP3, дефект продукции слюны у АС?Р5-нокаутов, нарушение водного баланса в мозге при нокауте гена AQP4, крайне низкая водная проницаемость в легочной ткани при нокауте AQP1 и AQP5. Экспрессия аквапорина в ткани в норме еще недостаточна для суждения о его физиологической или патогенетической роли. Например, хотя AQP4 экспрессируется, помимо мозга, почки и легкие, также в париетальных клетках желудка и плазмолемме скелетных мышц, нокаут гена AQP4 не сопровождается дисфункцией этих последних органов [Verkman, 1999].
В отличие от аквапоринов других типов, даже незначительные мутационные нарушения структуры AQP2 у человека и животных феноти-пически четко проявляются в виде выраженного нефрогенного несахарного диабета. В 1994 г. впервые была описана редкая форма не сцепленного с Х-хромосомой нефрогенного диабета, причиной которого явилась мутация в структуре AQP2 [Deen et al., 1994]. К настоящему времени у больных с нефрогенным диабетом выявлены более 25 мутаций различного типа, в результате которых либо полностью выключается ген AQP2, либо происходит задержка биосинтеза белка на уровне плазматического рети-кулума или аппарата Гольджи [Tamarappoo et al., 1994; Deeh et al., 1995; Kamsteed et al., 1999]. Приведенные в литературе случаи наследственного нефрогенного диабета были отнесены к аутосомно-рецессивному типу, а обнаруженные при этом мутации в молекуле AQP2 локализованы в разных сайтах и могли быть как одиночными, проявляющимися в гомозиготе, так и компаундами у гетерозигот [Van Lieburg et al., 1994; Bichet et al., 1995; Mulders et al., 1997]. Мутация в гене другого почечного аквапорина (AQP1) может не проявляться столь драматически, как при нарушении AQP2. Описаны 3 исключительно редких случая, когда у фенотипически совершенно здоровых субъектов была выявлена мутация в структуре AQP1, единственным проявлением которой оказалось снижение водной проницаемости эритроцитов [Preston et al., 1994].
Экспрессию AQP2 исследовали во многих экспериментальных моделях. Найдены повышение уровня мРНК AQP2 и содержание белка в почке крыс при циррозе печени, что обусловливало выраженный антидиурез. Введение препаратов лития, гипокалиемия, обструкция мочеточников и низкобелковая диета вызывали развитие полиурии. Оказалось, что в основе этого симптома лежит значительное снижение экспрессии AQP2 [Marples et al., 1995, 1996; Stands et al., 1996].
Экспрессия аквапоринов начинает использоваться в диагностических целях. Иммуногис-тохимическое выявление AQP2 оказалось необходимым для установления процента клеток, происходящих из собирательных трубок при ау-тосомно-доминантном поликистозе почек [Hayashi et al., 1997]. Иммуногистохимическое окрашивание AQP1 и AQP2 позволило определить, из какого сегмента нефрона происходит карцинома почек [Kageyama et al., 1996]. Изучается диагностическая ценность недавно обнаруженной экскреции AQP2 с мочой [Rai et al., 1997; Saito et al., 1997].
Значительное внимание уделяется поиску блокаторов аквапоринов для создания фармакологических препаратов, которые найдут применение в клинике для коррекции отека мозга, отека легких, в качестве средств для снижения внутричерепного и внутриглазного давления и т. д. [Verkman, Mitra, 2000]. С этой целью используется комплекс современных молекуляр-но-биологических методов, применяемых для изучения структуры и функции аквапоринов. Пока известно лишь одно соединение, ингиби-рующее транспорт воды через большинство аквапоринов. Это — сульфгидрильные производные ртути, но они слишком токсичны для использования in vivo.
Заключение. Несмотря на стремительный прогресс в изучении структуры и функции аквапоринов, остаются нерешенными многие вопросы. Мало известно о внутримолекулярных взаимодействиях и механизме проникновения воды через мономер. Неясно, какие особенности структуры определяют проницаемость молекулы акваглицеропорина для мочевины, глицерина и некоторых низкомолекулярных веществ. Необходимы исследования по идентификации взаимодействия как между аквапоринами и другими компонентами мембраны, так и между аквапоринами и цитоплазматическими белками. Хотя фенотипические проявления у нокаут-ных мышей дали возможность выявить функциональную роль аквапоринов в различных органах, но остаются практически не выясненными механизмы регуляции их биосинтеза, перераспределения и деградации. В то же время, изменение локализации, структуры, свойств и регуляции аквапоринов могут быть ведущими факторами в развитии многих патологических состояний, таких как неонатальная дисфункция легких, гипертония, отек мозга, несахарный диабет и др. Понимание функции и регуляции аквапоринов позволит разработать новые принципы коррекции нарушений водного гомеоста-за как у детей, так и у взрослых.
