CC BY
31
ЭНДОКРИНОЛОГИЯ
УДК: Б1Б.153.455-008.Б1-073 Код специальности ВАК: 03.01.04; 03.03.01; 01.04.06
АКУСТИЧЕСКАЯ ИНТЕРФЕРОМЕТРИЯ ЭРИТРОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ IN VITRO
А. И. Стародумова, Т. А. Веселова, С. А. Боаге, А. В. Клемина, А. П. Веселов,
ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского»
Стародумова Александра Игоревна - e-mail: Starodumovasa@gmail.com
Дата поступления 30.05.2018
Введение. Структурно-функциональные перестройки эритроцитов при гипергликемии могут являться одним из критериев тяжести патологии и эффективности проводимой терапии. Цель исследования: определение акустических параметров эритроцитов и содержания гликированного гемоглобина при моделировании гипергликемии в экспериментах in vitro. Материалы и методы. Модель гипергликемии создавали в цельной крови и суспензии эритроцитов практически здоровых доноров в возрасте 40±10 лет. Результаты и выводы. Показано повышение упругости эритроцитов в образцах крови и суспензии эритроцитов через сутки после повышения содержания глюкозы в образцах до 12,5, 25 и 50 ммоль/л. Показатели упругости эритроцитов в суспензии клеток зависели от уровня гликогемоглобина. В цельной крови такой зависимости не обнаружено. Обсуждаются механизмы изменения упругости эритроцитов при гипергликемии и возможности использования акустических параметров эритроцитов в комплексной диагностике гипергликемий.
Ключевые слова: гипергликемия in vitro, упругость эритроцитов, гликированный гемоглобин, диагностика.
Introduction. Structural-functional alteration of erythrocytes in the presence of hyperglycemia could be one of the criteria of severity of pathologies and efficiency of the conducted therapy. РигроБе of the study. Definition of acoustic parameters of erythrocytes and contents of glycohemoglobin in the presence of hyperglycemia in vitro. Materials and methods. Model of hyperglycemia was created in the whole blood and suspension of erythrocytes of apparently healthy donors at the age of 40±10. Results and conclusions. Increase of elasticity of erythrocytes is presented in whole blood and suspension samples every other day after increase of glucose in the content of the samples to 12,5, 25, 50 mmol/L. Indices of elasticity of erythrocytes of the suspension cells depend on level of glycohemoglobin. In whole blood such dependence was not observed. Up for discussion are the mechanisms of variance of elasticity of erythrocytes in case of hyperglycemia and opportunities for use of the acoustic parameters of erythrocytes in comprehensive diagnosis of hyperglycemia.
Key words: hyperglycemia in vitro, elasticity of erythrocytes, glycohemoglobin, diagnostics.
Введение
В условиях гипергликемии эритроциты претерпевают ряд структурно-функциональных изменений, которые определяют тяжесть течения гипергликемии и эффективность ее коррекции. Известно, что при высоком содержании глюкозы в крови активируются процессы гликирова-ния белков. В результате гликирования гемоглобина образуются конечные продукты, накопление которых является основной причиной структурных перестроек эритроцитов и их физико-химических свойств, и, соответственно, нарушения функций клеток, органов и организма в целом при гипергликемии [1].
Структурные перестройки эритроцитов при гипергликемии могут являться одним из критериев тяжести патологии и эффективности проводимой терапии. Актуален поиск новых методов быстрой и эффективной оценки физико-химических перестроек клеток. Акустический анализ упругости эритроцитов является безреагентным, простым в исполнении методом, позволяющим точно и быстро оценить структурные изменения в клетках.
Цель исследования: определение акустических параметров эритроцитов и содержания гликированного гемоглобина при моделировании гипергликемии в экспериментах in vitro.
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Материалы и методы
Объектом исследования служила цельная кровь, стабилизированная К2ЭДТА, и суспензия эритроцитов практически здоровых доноров в возрасте 40±10 лет. Плазму и эритроциты разделяли путем центрифугирования крови в течение 15 мин при 3000 об/мин. Эритроциты дважды отмывали физиологическим раствором (0,9% NaCl) [2].
Модель гипергликемии in vitro в цельной крови создавали путем добавления к 1 мл цельной крови 50 мкл растворов глюкозы до получения концентраций 12,5; 25; 50 ммоль/л. Для приготовления растворов глюкозы в качестве растворителя использовали физиологический раствор. Контролем служили образцы крови с концентрацией глюкозы 5 ммоль/л (нормогликемия), в которые добавляли 50 мкл физиологического раствора.
Модель гипергликемии in vitro в суспензии эритроцитов создавали путем добавления физиологического раствора с различными концентрациями глюкозы (12,5; 25; 50 ммоль/л) к осадку эритроцитов в соотношении 3:1. Контролем служили эритроциты, ресуспендированные в 0,9%-ом растворе NaCl. Исследования физико-химических параметров эритроцитов проводили через 24 часа после начала моделирования гипергликемии, образцы инкубировали в закрытых пластиковых пробирках при температуре +4°C.
Уровень гликогемоглобина определяли с помощью набора «ГЛИКОГЕМОТЕСТ». Измерение упругости эритроцитов проводили акустическим методом на приборе «БИОМ». Метод акустической интерферометрии (резонаторный метод) основан на измерении скорости и поглощения ультразвука в исследуемой жидкости в цилиндрическом резонаторе [3].
Оценку эритроцитарных гематологических показателей производили на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior 30. В работе измеряли следующие параметры: содержание эритроцитов (RBC), средний объем эритроцита (MCV), широту распределения эритроцитов по размерам (RDWc), содержание гемоглобина (HGB), среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (MCHC).
Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя программу Statistica 10. Достоверность отличий в содержании гликированного гемоглобина в образцах крови и суспензии эритроцитов с высоким содержанием глюкозы по сравнению с контролем оценивали с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони, в упругости эритроцитов - с помощью критерия Крускала-Уоллиса. Для оценки возможной взаимосвязи между упругостью эритроцитов и содержанием гликогемоглобина использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Статистически достоверными считали различия при p<0,05.
и i>
u
Ml
I
■
Кин
Pij
MCH ipiJ
РИС. 1.
Упругость (G) эритроцитов через сутки после начала моделирования гипергликемии in vitro в цельной крови. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.
щ
li.i
J i j гтН
РИС. 2.
Содержание гликированного гемоглобина в крови через сутки после начала моделирования гипергликемии т мЪю. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.
fj*
■"
i \А
Йг!
+ i.*
I.H I ua
J.M 1 I
РИС. 3.
Упругость эритроцитов (G) до и после моделирования гипергликемии in vitro в суспензии клеток. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.
РИС. 4.
Содержание гликированного гемоглобина в суспензии эритроцитов после моделирования гипергликемии т мЪю. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем.
Al
ЭдУД
Результаты исследования
Через 24 часа после начала моделирования гипергликемии в цельной крови не обнаружено изменений размеров эритроцитов, содержания гемоглобина в клетках, эритро-цитарные индексы (М^, RDWc, МСН, МСНС) в образцах крови с различными концентрациями глюкозы (12,5; 25; 50 ммоль/л) не отличались от нормальных значений.
Вместе с тем после инкубации образцов крови в течение 24 часов в среде с повышенным содержанием глюкозы (12,5; 25; 50 ммоль/л) обнаружено достоверное увеличение упругости эритроцитов по сравнению с контролем (рис. 1).
При выраженной гипергликемии значительно усиливается процесс неферментативного гликозилирования мембранных белков эритроцитов и гемоглобина [4]. В представленной работе накопление гликированного гемоглобина наблюдали в пробах крови с концентрацией глюкозы 50 ммоль/л по сравнению с контролем (рис. 2).
Коэффициент корреляции Спирмена показал наличие средней степени сопряженности между концентрацией глюкозы в крови и параметром упругости эритроцитов (г=0,58, р<0,05), однако зависимости между показателем упругости эритроцитов и содержанием гликирован-ного гемоглобина А1с крови не обнаружено.
По всей видимости, при высоком уровне глюкозы в крови влияние на упругость эритроцитов оказывает не только содержание гликированного гемоглобина, но и степень гликирования плазменных белков.
Для исключения возможного влияния на упругость эритроцитов изменений физико-химических параметров плазмы при гипергликемии проведена серия исследований акустических параметров эритроцитов и содержания гликированного гемоглобина в суспензии эритроцитов с высоким содержанием глюкозы.
Эритроцитарные индексы (М^, МСН, МСНС, RDWc) в суспензии эритроцитов с разными концентрациями глюкозы не отличались от таковых в контроле (таблица).
Однако наблюдали повышение упругости эритроцитов в суспензии клеток с концентрацией глюкозы 12,5, 25 и 50 ммоль/л по сравнению с контролем (рис. 3).
Накопление гликированного гемоглобина в суспензии эритроцитов по сравнению с контролем было выявлено при инкубировании клеток в среде с концентрациями глюкозы 25 и 50 ммоль/л по сравнению с контролем (рис. 4).
Коэффициент корреляции Спирмена показал наличие достаточно высокой степени сопряженности между параметром упругости эритроцитов и содержанием гликиро-ванного гемоглобина в суспензии эритроцитов при гипергликемии (г=0,61, р<0,05).
Обсуждение
В представленной работе показано увеличение упругости эритроцитов в цельной крови и суспензии эритроцитов с высоким содержанием глюкозы (12,5; 25 и 50 ммоль/л). Одним из механизмов изменения вязко-эластических свойств эритроцитов при гипергликемии может являться повышение скорости гликирования белков, в частности, гликирования гемоглобина [5]. Зависимость упругости эритроцитов от содержания гликирован-ного гемоглобина обнаружена только при моделировании гипергликемии в суспензии эритроцитов. Отсутствие
ТАБЛИЦА.
Эритроцитарные индексы в суспензии эритроцитов с высоким содержанием глюкозы
Эритроцитарные индексы Концентрация глюкозы, ммоль/л
0(контроль) 12,5 25 50
MCV 87,5±0,60 87,17±0,44 87,83±0,24 87,17±0,36
MCH 25,9±0,64 26,4±0,27 25,75±0,91 25,87±0,64
MCHC 297±8,70 302±3,80 295±11,00 297±8,50
RDWc 14,17±0,25 14,03±0,09 14,42±0,25 14,38±0,36
такой зависимости при моделировании гипергликемии в цельной крови дает возможность предположить влияние гликирования плазменных белков на физико-химические характеристики эритроцитов [6-8].
В условиях гипергликемии в эритроцитах увеличивается внутриклеточное содержание глюкозы, что приводит к активации полиолового пути метаболизма глюкозы. За счет накопления сорбитола в клетках происходит формирование внутриклеточной гиперосмолярности, снижение эластичности и вязкости клеточной мембраны эритроцитов, характеризующих деформируемость и упругость клеток красной крови [9].
Выводы
1. В экспериментах in vitro показано увеличение упругости эритроцитов цельной крови и суспензии клеток через сутки после повышения содержания глюкозы в образцах до 12,5, 25 и 50 ммоль/л.
2. Накопление гликированного гемоглобина в эритроцитах через 24 часа после начала моделирования гипергликемии обнаружено лишь при повышении содержания глюкозы до 25 и 50 ммоль/л в суспензии клеток и до 50 ммоль/л в цельной крови.
3. Выявлена зависимость упругости эритроцитов от содержания гликогемоглобина в суспензии клеток в процессе моделирования гипергликемии in vitro. При моделировании гипергликемии в цельной крови зависимости упругости эритроцитов от содержания гликогемоглобина не обнаружено.
4. Метод акустической интерферометрии может использоваться в комплексной диагностике гипергликемий, однако, необходимы дальнейшие исследования молекулярных механизмов структурных перестроек эритроцитов, обусловленных высоким содержанием глюкозы в крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шилов А.М., Мельник М.В. Артериальная гипертония и реологические свойства крови. БАРС. 2005. № 7. С. 13-18.
Shilov А.М., Mel'nik M.V. Arterial'naya gipertoniya i reologicheskie svojstva krovi. BARS. 2005. № 7. S. 13-18.
2. Крылов В.Н., Дерюгина А.В., Константинова А.И. Электрофоретическая подвижность и активность №,К-АТФазы эритроцитов у крыс при стрессе. Росс. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2014. Т. 100. № 11. С. 1297-1302.
Krylov V.N., Deryugina A.V., Konstantinova A.I. Elektroforeticheskaya pod-vizhnost' iaktivnost' Na,K-ATFazy eritrocitov u kryspristresse. Ross. fiziol. zhur-nalim. I.M. Sechenova. 2014. T. 100. №11. S. 1297-1302.
3. Клемин В.А., Клемина А.В. Акустический анализатор «БИОМ» для безре-агентной лабораторной медицинской диагностики. Известия ЮФУ. Технические науки. 2009. № 10. С. 258-259.
Klemin V.A., Klemina A.V. Akusticheskij analizator «BIOM» dlya bezreagent-noj laboratornoj medicinskoj diagnostiki. Izvestiya YuFU. Texnicheskie nauki. 2009. № 10. S. 258-259.
4. Сулейманова М.Х. Разработка аффинной тест-системы для количественного определения гликозилированного гемоглобина: автореф. дис. ... к. м. н. Москва, 2006. С. 35.
NK
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Sulejmanova M.X. Razrabotka affinnoj test-sistemy dlya kolichestvennogo opredeleniya glikozilirovannogo gemoglobina: avtoref. dis.... k. m. n. Moskva, 2006. S. 35.
5. Riquelme B., Foresto P., D'Arrigo M. et al. A dynamic and stationary rheological study of erythrocytes incubated in a glucose medium. Biochem. Biophys. Methods. 2005. V. 62. № 2. P. 131-141.
6. Чазова И.Е., Мычка В.Б. Метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа и артериальная гипертензия. Сердце: журнал для практикующих врачей. 2003. Т. 2. № 3. С. 102-144.
Chazova I.E., Mychka V.B. Metabolicheskij sindrom, saxarnyj diabet 2 tipa i arterial'naya gipertenziya. Serdce: zhurnal dlya praktikuyushhix vrachej. 2003. T. 2. № 3. S. 102-144.
7. Ju-Ming Lu, Li-Nong Ji, Yu-Feng Li et al Glycated albumin is superior to glycated hemoglobin for glycemic control assessment at an early stage of diabetes treatment: A multicenter, prospective study. Journal of Diabetes and Its Complications. 2016. V. 30. № 8. P. 1609-1613.
8. Ting Gan, Xin Liu, Gaosi Xu. Glycated Albumin Versus HbA1c in the Evaluation of Glycemic Control in Patients With Diabetes and CKD. Clin Chim Acta. 2012. V. 413. P. 1555-1561.
9. Caimi G., Presti R.L. Techniques to evaluate erythrocyte deformability in diabetes mellitus. Acta Diabetol. 2004. V. 41. № 3. P. 99-103. m
УДК: Б1Б.153.45-008.9
Код специальности ВАК: 14.01.02
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА Г51799883 ГЕНА FABP2 С РАЗЛИЧНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА У ЖИТЕЛЕЙ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН
Ф. В. Валеева, К. Б. Хасанова, Е. В. Валеева, Т. А. Киселева, Е. А. Созинова, И. И. Ахметов,
ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет»
Дата поступления 05.09.2018
Хасанова Камиля Булатовна - e-maii: kamiiya_khasanova@maii.ru
Целью исследования явился анализ ассоциации полиморфизма rs1799883 гена FABP2 с различными нарушениями углеводного обмена у жителей Республики Татарстан (РТ). Материалы и методы. В исследовании приняли участие 225 пациентов (30% мужчин и 70% женшин) в возрасте от 38 до 76 лет с однократной гипергликемией в анамнезе и 95 пациентов с подтвержденным диагнозом сахарного диабета 2-го типа (СД2). Всем включенным в исследование пациентам с однократной гипергликемией в анамнезе был проведен пероральный глюкозотолерант-ный тест (ПОГТТ). В зависимости от результатов ПОГТТ были выделены четыре группы пациентов: 1-я - с нарушенной толерантностью к глюкозе (НТГ), 2-я - с нарушенной гликемией натощак (НГН), 3-я - с функциональным гиперинсулинизмом (ГИ), 4-я - с впервые выявленным СД2. Всем пациентам были проведены клиническое и лабораторное обследования. Результаты. Носительство мутантного аллеля А связано с увеличенным риском развития СД2 (OR=1,32, 95% CI 0,99-1,78), а наличие гомозиготного генотипа GG связано с пониженным риском развития заболевания (OR=0,72, 95% CI 0,49-1,06). При изучении распределения генотипов данного полиморфного маркера у пациентов с НГН обнаружено, что шанс развития нарушения значительно увеличивается у обладателей мутантной гомозиготы AA (OR=5,52, p=0,02). В результате корреляционного анализа была получена значимая корреляция полиморфизма rs1799883 гена FABP2 с уровнем инсулина и С-пептида (r=0,16, p=0,04; r=0,l5, p=0,05, соответственно). Выводы. Результаты исследования показали, что в группе пациентов с ранними нарушениями углеводного обмена носители аллеля A и генотипа AA полиморфного маркера rs1799883 гена FABP2 имеют повышенный риск развития инсулинорези-стентности. Носительство мутантного аллеля A гена FABP2 ассоциировано с повышенным риском развития СД2 у жителей РТ.
Ключевые слова: полиморфизм, ген FABP2, rs1799883, сахарный диабет 2-го типа,
инсулинорезистентность.
Purpose of the study was to analyze the association of the rs1799883 polymorphism of the FABP2 gene with various carbohydrate metabolism disorders in the inhabitants of the Republic of Tatarstan (RT). Materials and methods. The study involved 225 patients (30% of men and 70% of women) aged 38 to 76 years with a single history of hyperglycemia and 95 patients with confirmed diagnosis of type 2 diabetes. All patients with a single history of hyperglycemia who were included in the study underwent an oral glucose tolerance test (OGTT). Depending on OGTT results, four groups of patients were distinguished: 1 - with impaired glucose tolerance (IGT), 2 - with impaired fasting glycemia (IFG), 3 - with functional hyperinsulinism (HI), 4 - with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus (CD2). All patients underwent clinical and laboratory examination. Results. The carriership of the mutant allele A is associated with an increased risk of developing CD2 (OR=1,32, 95% CI 0,99-1,78); the presence of a homozygous GG genotype is associated with a reduced risk of disease development (Or=0,72, 95% CI 0,49-1,06). While studying the distribution of genotypes of the polymorphic marker in patients with IFG, it was found that the chance of developing a disorder significantly increases in the carriers of the mutant homozygote AA (OR=5,52, p=0,02). As the outcome of the correlation analysis, a significant correlation of the rs1799883 polymorphism of the FABP2 gene with the level of insulin and C-peptide (r=0,16, p=0,04, r=0,15, p=0,05, respectively) was obtained. Conclusions. The results of the study showed that the carriers of allele A and genotype AA of the polymorphic marker rs1799883 of the FABP2 gene in the group of patients with early carbohydrate metabolism disorders have an increased risk of developing insulin resistance. The carriership of the FABP2 gene mutant A allele is associated with an increased risk of development of CD2 in RT residents.
Key words: polymorphism, FABP2 gene, rs1799883, type 2 diabetes mellitus, insulin resistance.
