CC BY
45
—--------- —
Zabokritskiy N.A.
THE ACTUAL PHARMACOLOGICAL AND BIOLOGICAL ASPECTS OF DEVELOPMENT, DESIGN AND CREATION OF THE INNOVATIVE BIOGEPA-TOPROTECTOR - COMBINED PROBIOTIC PREPARATION OF THE NEW
GENERATION
The Ural state medical university Ekaterinburg (Russian Federation) The Institute of Immunology and Physoilogy of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, Ekaterinburg
(Russian Federation)
Summary. The article is devoted to the pharmacobiological questions of development, design and establishment of a pilot sample biogepatoprotector, as a new class of combined probiotical and eubiotical drugs for medical purposes. The author of the first attempt of justification of the selection criteria of probiotic strains of spore-forming bacteria of the genus Bacillus for the design of the pilot sample biogepatoprotector.
Keywords: pharmaceutical designing, bacterial strains, bacilli, combined drag - biogepatoprotector.
Забокрицкий Н.А.
АКТУАЛЬНЫЕ ФАРМАКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ, КОНСТРУИРОВАНИЯ И СОЗДАНИЯ ИННОВАЦИОННОГО БИОГЕПАТО-ПРОТЕТОРА - КОМБИНИРОВАННОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Минздрава России, г. Екатеринбург (РФ)
Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург (РФ)
Аннотация. Статья посвящена актуальным фармако-биологическим вопросам разработки, конструирования и создания экспериментального образца биогепатопротектора, как нового класса - комбинированных про- и эубио-тических препаратов медицинского назначения. Автором впервые предпринята попытка обоснования критериев отбора пробиотических штаммов спорообразующих бактерий рода Bacillus для конструирования экспериментального образца биогепатопротектора.
Ключевые слова: конструирование, бактериальные штаммы, бациллы, комбинированный биогепатопротектор.
Патентный поиск и современная научная литература подтверждают, что в настоящее время ассортимент лекарственных средств (А05ВА - “Препараты для лечения заболеваний печени”), используемых в терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает более 1000 наименований, что само по себе уже свидетельствует о сложности и нерешенности данной проблемы. Из этого количества препараты, обладающие в той или иной степени клинически доказанным гепатопротекторным действием (избирательным или преимущественным), представляет собой немногочисленную группу. При этом ни один из гепатопротекторов, применяемых сегодня в медицинской практике, не отвечает в полной мере предъявляемым к ним требованиям [2, 7].
В арсенале гепатопротекторов преобладают лекарственные средства растительного происхождения (до 54%) на основе флавоноидов расторопши и других растений; 16% - препараты, содержащие фосфолипиды, и остававшиеся - более 30% - синтетические средства, появление которых стало особенно интенсивным в последние годы, а также препараты на основе аминокислот и органических соединений [7].
Препараты микробиологического происхождения, обладающие гепатопротективными свойствами, в настоящее время на фармацевтическом рынке РФ отсутствуют, при том, что необходимость их создания и применения для решения задач современной гепатологии остается актуальным вопросом [2, 3, 5, 10].
В настоящее время при лечении токсических поражений печени важная роль отводится патогенетической терапии, которая направлена на коррекцию факторов, играющих существенную роль в механизмах повреждения паренхимы печени.
Гепатопротекторы обладают избирательным защитным действием в отношении печени, их системное действие направлено на восстановление гомеостаза в органе, повышение устойчивости гепатоцитов к воздействию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенера-ционных процессов в печени [2, 7].
Следует отметить, что проблема создания эффективного гепатопротекторного препарата, отвечающего вышеприведенным требованиям, остается до настоящего времени недостаточно разработанной и, в связи с этим, актуальной для решения задач здравоохранения по сохранению полноценного здоровья народонаселения России
[5].
~ 64 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
—--------- ----------
Выполненные нами теоретические исследования, а также многолетний опыт проведения экспериментальных исследований по изучению микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами, и практического использования лекарственных средств, и препаратов, созданных на их основе, позволили нам полагать с высокой степенью вероятности о наличии возможности разработки нового пробиотического гепатопротекторного средства [2, 6, 7].
Для решения поставленной задачи необходимо было, в первую очередь, провести исследования по выбору конкретного вида и штамма пробиотического микроорганизма, в экспериментальных исследованиях изучить его биологические свойства и по совокупности полученных результатов принять решение о целесообразности создания на его основе экспериментального образца нового гепатопротекторного средства.
Следует также учитывать, что предлагаемые гепатопротекторы будут являться естественным продуктом микробиологического синтеза пробиотических бактерий, различные виды которых прошли длительный эволюционный путь взаимоотношений микроорганизм-макроорганизм и взаимной адаптации [3, 4, 6, 11-13].
В настоящее время накоплен значительный научный материал, свидетельствующий о том, что наибольшим биологическим потенциалом и набором конкретных позитивных свойств, которые эффективно можно использовать для разработки пробиотических препаратов являются непатогенные спорообразующие микроорганизмы рода Bacillus и, в частности, различные штаммы сенной палочки [1, 6]. Установлено, что они характеризуются выраженными антагонистическими свойствами в отношении многих видов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, способностью оказывать иммуномодулирующее действие (в основном за счет стимулирования различных звеньев клеточного и гуморального иммунитета), а также обладают антитоксическими, антиаллергическими, противорадиационными и другими эффектами [8-10, 12, 13].
Цель работы - провести доклинические фармако-биологические исследования по разработке, созданию и конструированию экспериментального образца комбинированного биогепатопротектора нового поколения.
Материалы и методы. С целью конструирования экспериментального образца гепатопротекторного средства нами были проведены сравнительные микробиологические исследования выбранных штаммов Bacillus subtilis.
Так, использовали споровые культуры следующих штаммов: Bacillus subtilis В-2335, Bacillus subtilis В-4759, Bacillus subtilis В-2895, Bacillus subtilis В-3679, Bacillus subtilis В-9906, Bacillus subtilis В-9909.
Все указанные штаммы находятся в настоящее время на хранении во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика). Паспортные характеристики исследуемых штаммов бацилл в целом были типичны для вида Bacillus subtilis.
Еще раз считаем необходимым указать, что согласно требованиям, приведенным в Санитарных правилах СП 1.2.731-99, штаммы Bacillus subtilis относятся к сапрофитам, то есть микроорганизмам, непатогенным для человека и животных, работа с ними не требует специальных мер биологической защиты.
Культивирование бактериальных клеток Bacillus subtilis, штамм В-9906 проводили в жидкой питательной среде на термостатированной установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 при 37 1C в течение 30 ч. Посевной материал готовили в концентрации не менее 1 • 106 КОЕ-см-3. В колбы вносили питательную среду, после чего добавляли посевной материал.
Выращивание пробиотических клеток Bacillus subtilis штамма В-9906 в объемах, необходимых для получения комплекса метаболитов, производили глубинным способом с использованием ферментера (БИОР-0,1). Для культивирования использовали среду на основе соляно-кислотного гидролизата казеина или панкреатического гидролизата соевой муки с добавлением солей кальция хлорида, сульфатов магния и марганца, хлорида натрия и сульфата железа. Глюкозу и раствор кальция хлорида вносили непосредственно при посеве с соблюдением асептических условий. Выращивание проводили при температуре (36±1)°C. Контроль за развитием культуры клеток осуществляли визуально, путем микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену. Через 36±4 часов культивирования, что соответствовало окончанию стационарной фазы роста, процесс биосинтеза прекращали, культуральную жидкость охлаждали до температуры (12±3)°С.
Получение комплекса биологически активных веществ (метаболитов), продуцируемых клетками Bacillus subtilis штамм В-9906, осуществляли по рекомендуемым методикам.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием стандартных программ: Microsoft Office Excel 2007 и “Statistica 6.0”. Использовали метод дисперсионного анализа (ANOVA). Оценку нормальности распределения полученных данных проводили по методу Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни и параметрический F-критерий Фишера в зависимости от нормальности распределения данных. Проверку статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение. Для обоснования критериев отбора штаммов Bacillus subtilis нами были проведены экспериментальные исследования по углубленному изучению биологических свойств вышеперечисленных штаммов с целью обоснования объективных критериев для выбора конкретного штамма, обладающего наиболее приемлемыми свойствами для конструирования на его основе экспериментального образца гепатопротекторного средства (таблицы 1, 2, рисунки 1, 2).
~ 65 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Таблица 1
Оценка антагонистической активности споровых культур штаммов Bacillus subtil is (MDm, n=3)
№ п/п Образцы препаратов Зоны угнетения роста тест-культур, мм
Candida albicans 690 s uc is c id o i 0 c im 09 _2 С ?у 43 ^ yh d 1 ph pi 1 ta e tS Escherichia coli 0157 Staphylococcus aureus 209 Р Pseudomonas aeruginosa 9027 Proteus vulgaris 15 Streptococcus pyogenes ATCC 19615
1. Bacillus subtilis В-2335 2З,б ±2,0* 24,5 ±2,3* 2б,9 ±3,1* 20,8 ±1,8* 22,З ±1,9* 14,4 ±1,1* 21,2 ±1,9*
2. Bacillus subtilis В-4759 20,2 ±1,8* 21 ,б ±1,9* 2З,2 ±2,1* 19,8 ±1,7* 17,1 ±1,5* 1б,б ±1,5* 17,9 ±1,6*
З. Bacillus subtilis В-2895 20,З ±1,9* 21,8 ±1,9* 22,5 ±2,0* 19,З ±1,6* 18,4 ±1,8* 14,б ±1,2* 17,З ±1,7*
4. Bacillus subtilis В-3679 24,7 ±2,8* 20,5 ±1,8* 2З,б ±2,2* 24,0 ±2,6* 17,7 ±1,6* 12,9 ±1,1* 21,5 ±2,0*
5. Bacillus subtilis В-9906 28,1 ±3,7* 2б,0 ±3,2* более З5 2З,З ±2,2* 21 ,б ±1,8* 19,4 ±1,6* 2З,1 ±2,2*
б. Bacillus subtilis В-9909 20,б ±2,0* 19,2 ±1,6* 22,8 ±2,1* 22,2 ±2,1* 15,б ±1,3* 1З,4 ±1,1* 20,б ±1,9*
7. Контроль (стерильное вазелиновое масло) 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
Примечание: - * - достоверные (р<0,05) различия по и-критерию Манна-Уитни по отношению к группе «Контроль (стерильное вазелиновое масло)».
Таблица 2 - Гемолитическая активность исследуемых штаммов Bacillus subtilis (M±m, n=3)
Исследуемая культура Ср ок на бл юд ен ия, сут Зона гемолиза на питательных средах, мм
Плотная питательная среда Г аузе 2 с добавлением дефибрированной кроличьей крови, % Плотная питательная среда Г аузе 2 с добавлением дефибрированной человеческой крови, %
10% кровя- ной агар 10% кровя- ной агар 20% кровяной агар + 1% глюкоза 10% кровя- ной агар 20% кровяной агар + 1% глюкоза 10% кровя- ной агар 20% кровяной агар + 1% глюкоза 20% кровяной агар + 1% глюкоза
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
№ серии 18 19 19 20 17 19 19 17
Bacillus subtilis В-2ЗЗ5 2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
З 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
Bacillus subtilis В-4759 2 1,2±0,1 1,4±0,2 1,1±0,1 2,3±0,3 1,0±0,1 1,1±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0
З 1,3±0,1 1,0±0,1 1,2±0,1 2,0±0,2 0,0±0,0 1,1±0,1 0,0±0,0 2,2±0,3
Bacillus subtilis В-2895 2 1,0±0,1 1,1±0,1 1,0±0,1 3,5±0,8 2,3±0,4 2,6±0,4 0,0±0,0 0,0±0,0
З 1,3±0,1 1,2±0,1 1,1±0,1 5,2±1,4 1,2±0,1 2,0±0,3 0,0±0,0 0,0±0,0
—--------------------------------—
~ 66 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
Bacillus subtilis В-3679 2 2,8±0,6 2,1±0,1 0,0±0,0 2,0±0,2 2,1±0,2 2,0±0,3 0,0±0,0 3,3±0,9
3 2,3±0,4 2,0±0,3 0,0±0,0 2,5±0,5 2,7±0,5 2,5±0,6 0,0±0,0 3,8±1,0
Bacillus subtilis В-9906 2 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
3 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
Bacillus subtilis В-9909 2 1,0±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 1,1±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
3 1,3±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 1,2±0,1 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0
Примечание: - достоверных (р<0,05) различий по и-критерию Манна-Уитни по отношению к соответствующим группам высеянных на «плотной питательной среде Г аузе 2 с добавлением дефибринированной кроличьей крови» не установлено.
Анализ полученных сравнительных экспериментальных данных свидетельствует о том, что все выбранные для исследований бактериальные штаммы обладают достаточно высоким уровнем специфической антагонистической активности и способны подавлять рост и размножение тест-штаммов различных групп патогенности. Отмечено, что наибольшая активность определяется у штаммов Bacillus subtilis В-4759, Bacillus subtilis В-9906, Bacillus subtilis В-9909, в тоже время размеры зоны подавления у штамма Bacillus subtilis В-9906 были практически во всех случаях выше, чем у других сравниваемых штаммов.
Одним из важных критериев безопасного применения пробиотических штаммов для создания фармакологических препаратов является отсутствие у них гемолитической активности (таблица 2).
Наших исследованиях (таблица 2) установлено полное отсутствие гемолитических свойств у штаммов Bacillus subtilis В-2335, Bacillus subtilis В-9906, незначительный уровень гемолитической активности обнаружен у штаммов Bacillus subtilis В-4759, Bacillus subtilis В-9909, Bacillus subtilis В-3679 и Bacillus subtilis В-2895.
Ниже приведены результаты изучения биохимической активности исследуемых пробиотических штаммов (рисунки 1, 2).
Рисунок 1 - Сравнительная оценка протеолитической активности исследуемых пробиотических штаммов Bacillus subtilis (n=3).
Примечание: - 1) Протеолитическую активность штаммов оценивали при их глубинном культивировании в жидкой питательной среде (панкреатический гидролизат соевой муки).
2) Различия достоверные (р<0,05) по U-критерию Манна-Уитни во всех случаях в группе «Bacillus subtilis № B-9906» по отношению к группе «Bacillus subtilis № B-9909».
-----------------------------------------
~ 67 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НАУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта по созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
5
10
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
Bacillus
subtilis № B-subtilis № B-subtilis № B-subtilis № B-subtilis № B-subtilis № B-
2335
4759
2895
3679
9906
9909
15 20 25
Время, ч
30
35
Рисунок 2 - Сравнительная оценка амилолитической активности исследуемых пробиотических штаммов Bacillus subtilis (n=3).
Примечание: - 1) Aмилолитическую активность штаммов оценивали при их глубинном культивировании в жидкой питательной среде (панкреатический гидролизат соевой муки).
2) Различия достоверные (р<0,05) по U-критерию Манна-Уитни во всех случаях в группе «Bacillus subtilis № B-9906» по отношению к группе «Bacillus subtilis № B-9909».
Bыводы. Таким образом, оценка биохимической активности изучаемых штаммов, результаты которой представлены на вышеприведенных рисунках 1 и 2, показала, что протеолитические и амилолитические ферменты при глубинном способе культивирования в наибольших концентрациях синтезируются в жидких питательных средах такими штаммами, как Bacillus subtilis B-9906, Bacillus subtilis B-4759, Bacillus subtilis B-2335. Причем штаммы Bacillus subtilis B-9906, Bacillus subtilis B-4759 обладали способностью продуцировать указанные ферменты не только в сравнительно в более высоких концентрация, но и на более ранние сроки культивирования.
B последующем в опытах на лабораторных животных использовали только эти три штамма, т.е. Bacillus subtilis B-2335, B-4759, b-9906.
ЛИТЕРАТУРА
1. Г олубкова A.A. Причины, условия и сигнальные признаки вспышек внутрибольничных инфекций в учреждениях родовспоможения // Стерилизация и госпитальные инфекции. - 2006. -№2. - С.23-28.
2. Забокрицкий НА. Новый биогепатопротектор для лечения социально-значимых заболеваний нечени // Сб. науч. статей и тез. XIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -М., 2012. -Т14. -№2. -С.49-50.
3. Звездина Н.Д., Мальченко ЛА., Фатеева В.И., Бродский В.Я. Сигнальные факторы самоорганизации ритма синтеза белка в культурах генатоцитов - ганглиозиды и катехоламины - функционируют независимо друг от друга // Онтогенез. - М., 2008. -Т.39, №3. - С.198-207.
4. Козлов Р.С., Сивая О.В., Шпынев К.В. Aнтибиотикорезистентность Streptococcus pneumoniae в России в 1999-2005гг. Результаты многоцентровых проспективных исследований ПеГ A^I и ПеГ A^II // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -2006. -Т.8, №1. - С.33-47.
5. Онищенко Г.Г. Санитарно-эпидемиологическая обстановка [Электронный ресурс] // Федеральная служба но надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучения человека. -М.:Роспотребнадзор, 2013. - Режим доступа: http://rospotrebnadzor.ru/ epidemiologic_situation/6114/. html.
6. Осинова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиотиков : дис. ...д-ра биол. наук. -М., 2006. - 283 с.
7. Патент на изобретение RUS 2429869 “Средство “Гепатобиол”, обладающее гепатопротективным действием” / Забокриц-кий НА., Ладыгин О.В., Забокрицкий A.R, Морозов М.П., Уракова НА., Ураков A^. Российская Федерация. За-явл.2008125589/15 от 23.06.2008 г. Опубл. 27.09.2011 г. Бюл. №27. - 14 с.
8. Патент на изобретение RUS 2452478 “Многофункциональный раствор для эпибульбарных инстилляций” / Бондаренко Л.В., Ураков A^., Новиков В.Е., Забокрицкий НА., Виноградов A.B., Кашковский М.Л., Витер В.И., Вавилов A.Ю., Гайсина Л.Ф., Ливане Р.Л., Кривопалов СА. Российская Федерация. Заявл.2011106504/15 от 21.02.2011 г. Опубл. 10.06.2012 г. Бюл. №16. - 8 с.
9. Ураков A^., Уракова НА., Козлова Т.С. Локальная токсичность лекарств как показатель их вероятной агрессивности нри местном применении. Вестник Уральской медицинской академической науки 2011. -Т.1, №33. - С. 105-108.
—--------------------------------—
~ 68 ~
Издание зарегистрировано в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). Свидетельство о регистрации СМИ ПИ № ФС77-49390 Журнал представлен в НAУЧНОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ БИБЛИОТЕКЕ - головном исполнителе проекта но созданию Российского индекса научного цитирования (РИНЦ).
