CC BY
51
УДК 612.822.1.0.115.1
АКТИВНОСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ТКАНЯХ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ RANA RIDIBUNDA ПРИ ИСКУССТВЕННОЙ ГИПОТЕРМИИ И ПОСЛЕДУЮЩЕМ СОГРЕВАНИИ
© 2010 г. Н.Г. Магомедова, Р.О. Мирская, И.С. Мейланов
Дагестанский государственный университет, ул. Гаджиева, 43а, г. Махачкала, Республика Дагестан, 367000, dgu@dgu.ru
Dagestan State University, Gadjiev St., 43a, Makhachkala, Republic Dagestan, 367000, dgu@dgu.ru
Исследована активность супероксиддисмутазы в тканях мозга, печени, почек, миокарда, икроножной мышцы и в эритроцитах озёрной лягушки при недельной гипотермии 4 °С и последующем согревании в летний и осенний сезоны года. Изменения температуры тела у летних и осенних лягушек приводят к противоположным изменениям активности фермента.
Ключевые слова: лягушки, супероксиддисмутаза, гипотермия, согревание.
The activity of superoxide dismutase (SOD) in brain, liver, kidney, myocardium, gastrocnemius muscle tissues, and in erythrocytes of intact, one week hypothermia 4 °C and rewarmed lake frog Rana ridibunda at summer and autumn was measured. Hypothermia induces opposite changes in SOD activity at summer and autumn.
Keywords: frog, superoxide dismutase, hypothermia, rewarming.
Известно, что аэробные окислительно-восстановительные процессы в клетке сопряжены с генерацией свободных радикалов - химически активных соединений, способных повреждать клеточные структуры [1]. Чем интенсивней дыхание, тем интенсивней сво-боднорадикальные процессы (СРП) и тем больше вероятность их повреждающего действия. Несмотря на то, что интенсивность тканевого дыхания у пойкило-термов на порядок ниже по сравнению с гомойотерм-ными животными, клетки тканей пойкилотермных животных тоже нуждаются в антирадикальной защите, в том числе и в ее ферментативном звене [2]. Активности ферментов антирадикальной защиты в тканях пойкилотермных животных - рыб, амфибий, рептилий - сравнимы с таковыми у гомойотермов (хотя они и заметно ниже) [2]. Основным источником свободных радикалов в клетке является дыхательная цепь митохондрий [3], однако имеются источники и в цитозоле [4]. Для эффективной дезактивации свободных радикалов ферменты антирадикальной защиты должны быть локализованы в непосредственной близости от места генерации радикалов [5]. Опасность свободнорадикального повреждения клеток возрастает при резких переходах от низкого уровня аэробного дыхания к высокому [6]. Изменения температуры тела при изменении температуры окружающей среды -отличительный признак пойкилотермии. В то же время интенсивность окислительных процессов в теле пойкилотермных животных, измеряемая по потреблению кислорода, экспоненциально зависит от температуры тела [7]. При её изменении от 22-23 до 4 °С (температура, при которой лягушки обычно переживают оцепенение) интенсивность дыхания снижается примерно в 5 раз [7]. При согревании животного до
комнатной температуры интенсивность метаболизма соответственно в 5 раз возрастает. Надо полагать, что система антиоксидантной защиты у пойкилотермов эволюционно адаптирована к таким значительным изменениям уровня метаболизма. Эта адаптация должна состоять в том числе и в адекватном изменении активности ферментов антиоксидантной защиты при изменении температуры тела. В связи с этим представляет значительный интерес исследование реакции ферментов антирадикальной защиты в тканях пойкилотермных животных на резкое изменение температуры тела. Ранее нами исследована активность каталазы в тканях озерной лягушки при гипотермии и согревании в различные сезоны года [8]. Обнаружено, что активность каталазы при гипотермии летних животных повышается, а при последующем согревании -снижается. Гипотермия у осенних лягушек вызывает снижение активности каталазы, а согревание - увеличение. В продолжение этой работы нами исследована активность супероксиддисмутазы (СОД) в тканях озерной лягушки в летний и осенний сезоны при гипотермии и последующем согревании.
СОД находится в начале цепи химических превращений, составляющих комплекс СРП, катализируя реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов и тем самым влияя на последующие звенья цепи [5]. Чем выше активность СОД, тем меньше должна быть концентрация супероксидного радикала и интенсивность СРП. Поэтому исследование реакции СОД на значительные изменения температуры тела представляет большой интерес для выяснения механизмов адаптации тканей пойкилотермного животного к резким изменениям уровня генерации свободных радикалов.
Материалы и методы
Опыты проведены на озёрной лягушке Rana ridibunda (всего 30 особей). Лягушек отлавливали в окрестностях г. Махачкала летом и осенью и содержали в условиях вивария. Животные были разделены на 6 групп по 5 особей в каждой: 1 - летний (июнь-июль) контроль, температура тела 24+25 °С; 2 - летние, выдержанные в течение недели в холодильной камере при температуре тела 4 °С (гипотермия); 3 - летние, согревшиеся после гипотермии до температуры тела 22-23 °С при комнатной температуре за 30+40 мин (согревание); 4 - осенний (сентябрь-октябрь) контроль, температура тела 22+23 °С; 5 - осенние лягушки, выдержанные при температуре тела 4 °С в течение недели; 6 - осенние лягушки, согревшиеся после гипотермии до температуры тела 22-23 °С за 40 мин.
Для создания гипотермического состояния животных помещали в стеклянный сосуд с сантиметровым слоем воды, а затем этот сосуд - в холодильную камеру с температурой 4 °С. Температуру тела измеряли термометром в клоаке. Для определения активности фермента животных декапитировали, брали навески (60-100 мг) тканей мозга, печени, миокарда, почки, икроножной мышцы, а также выделяли эритроциты. Все операции проводили на холоду. Ткани указанных органов гомогенизировали в 0,067 М фосфатном буфере (рН = 7,4). Гомогенаты центрифугировали при 850 g в течение 10 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 10 000 g в течение 15 мин. Супернатант от 2-го центрифугирования, содержащий СОД, очищали от балластных белков, мешающих определению активности фермента, согласно [9]. Для получения эритроцитов кровь, собранную в стеклянную пробирку с 0,2 мл гепарина (200 ед./мл), центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Трижды отмытые физиологическим раствором эритроциты гемолизировали, для чего к 0,3 мл упакованных эритроцитов приливали 2,7 мл холодной бидистиллиро-ванной воды. Гемолизат центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин. Прозрачный гемолизат использовали для определения активности СОД. Исходное содержание гемоглобина в гемолизате определяли цианметгемоглобиновым методом с помощью стандартного набора фирмы «Реахим». Активность супер-оксиддисмутазы определяли методом, описанным в [9], по степени подавления восстановления тетразо-лиевого нитросинего (ТНС) супероксид-радикалом, генерируемым в системе феназинметасульфат -НАДН, при температуре инкубации 26 °С . Активность фермента выражали в относительных единицах в расчёте на 1 мг белка экстракта ткани или гемоглобина (для эритроцитов). Одна единица активности СОД соответствует количеству фермента, снижающему скорость восстановления тетразолиевого синего супероксидным анион-радикалом на 50 %.
Результаты и обсуждение
Гипотермия летних лягушек приводит к статистически достоверному увеличению активности СОД во всех тканях, кроме миокарда. Следует отметить, что гипотермическое состояние длится неделю. Следова-
тельно, активность фермента при гипотермии соответствует стационарному состоянию (то же самое относится и к контролю). Согревание приводит к увеличению активности фермента. Причём согревание животных до температуры тела 22-23 °С достигается за ~20 мин. Поэтому активность фермента в этом случае соответствует переходному состоянию. Уменьшение активности фермента при согревании приводит к тому, что его активность в некоторых тканях возвращается к уровню контроля (таблица). Сходные изменения активности СОД в различных тканях говорят об общей причине этих изменений, главной из которых, надо полагать, является изменение скорости окислительно-восстановительных процессов в клетках тканей при изменении температуры тела. Увеличение активности СОД при охлаждении летних лягушек указывает на то, что при охлаждении, возможно, интенсифицируются метаболические процессы в тканях, а это в свою очередь активирует СРП и соответственно активность антирадикальных ферментов. Но почему при пролонгировании гипотермического состояния в течение недели активность СОД не снижается по сравнению с контролем, ведь уровень энергетического обмена при температуре тела 4 °С примерно в 5 раз ниже, чем при 23 °С ? Возможно, что повышение активности СОД является реакцией на действие низкой температуры среды на организм, а в дальнейшем при понижении температуры тела активность фермента уже не изменяется, т.е. фиксируется изменение, вызванное началом охлаждения. Выяснение этого вопроса требует подробного исследования переходных от нормотермии к гипотермии процессов.
Активность СОД в тканях озерной лягушки при гипотермии и самосогревании в летний (числитель) и осенний (знаменатель) периоды (М±т, п=5)
Исследуемая Контроль Недельная Самосогревание
ткань гипотермия
Мозг 0,44±0,03 1,20±0,11* 0,60±0,01*
0,58+0,05 0,32+0,02 * 0,59+0,03
Печень 0,75±0,03 1,21±0,04* 0,79±0,02
0,85+0,05 0,40+0,03* 0,72+0,06
Почка 0,59±0,03 1,21±0,13* 0,60±0,02
0,67+0,03 0,42+0,02* 0,58+0,06
Миокард 0,47±0,04 0,54±0,04 0,58±0,02*
0,93+0,05 0,66+0,02* 0,78+0,04
Икроножная 0,14±0,01 0,17±0,01* 0,14±0,01
мышца 0,16+0,01 0,06+0,01* 0,11+0,06
Эритроциты 0,07±0,01 0,17±0,01 0,09±0,01
0,13+0,01 0,10+0,01 0,15+0,01
* - соответствует уровню значимости различий средних по отношению к контролю р<0,05.
В таблице приведены данные для гипотермии и согревания осенних лягушек. Недельная гипотермия привела к снижению активности СОД в тканях, а последующее согревание - к увеличению её активности. И снова согревание животных приводит к тому, что активность фермента приближается к уровню контроля (теперь уже осеннего). Таким образом, эти изменения противоположны тем, которые происходят при охлаждении и согревании летних лягушек. Активности СОД в тканях летних и осенних лягушек после
согревания в общих чертах близки друг другу. Таким образом, главное различие состоит в реакции тканей на недельную гипотермию: увеличение активности летом и снижение осенью.
Чем вызвано это различие? Осенью ночные температуры снижаются до 5-10 °С. Также изменяется и температура тела лягушек. Эти периодические снижения температуры тела, видимо, перенастраивают биохимические системы тканей животного, подготавливая их к гипометаболическому состоянию оцепенения. Искусственное снижение температуры тела осенью воспринимается регуляторной системой организма как погружение в зимнее оцепенение. Известно, что при впадении в гипометаболические состояния у различных видов животных включаются механизмы подавления активности ферментов энергетического обмена и некоторых других систем [2]. Поэтому снижение активности СОД (так же как и каталазы) при гипотермии у осенних лягушек, возможно, является частью общего процесса регуляторного снижения уровня метаболизма. Ферменты гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, биосинтеза и деградации белков ингибируются посредством обратимого фосфори-лирования [2]. Неизвестно, действует ли этот механизм в отношении СОД. Увеличение её активности при гипотермии летних лягушек, возможно, связано с тем, что у летних лягушек метаболические системы клеток не готовы к переключению на значительное снижение уровня обмена, и поэтому ответная реакция на снижение температуры тела состоит в активации окислительных процессов и антиоксидантных ферментов. Другими словами, можно предположить, что летние лягушки реагируют на охлаждение подобно гомойотермным животным интенсификацией обмена. Интересны в этой связи данные, приведённые Н.Н. Тимофеевым, согласно которым у лягушек при температуре среды 5 °С возникает подобие мышечной дрожи [10]. Это говорит в пользу предположения, согласно которому у пойкилотермных животных имеются зачатки терморегуляторных реакций, которые у гомойотермных животных выражены значительно сильнее.
Как уже отмечалось выше, гипотермическое состояние длится неделю, а согревание занимает всего 20 - 40 мин. Однако согревание практически нормализует активность фермента, изменившуюся при гипотермии (и летом, и осенью). Механизмы срочной регуляции активности СОД исследованы недостаточно. Известно, что нитрозилирование в молекуле СОД тирозиновых остатков пероксинитритом, который образуется в клетке при взаимодействии окиси азота с супероксидом [11], ингибирует её активность [12]. Гликозилирование молекулы СОД тоже ингибирует её активность [13]. Известно также, что СОД инакти-вируется перекисью водорода [14]. Все эти химические модификации молекулы фермента вполне обра-
тимы, и поэтому могут быть основой для механизмов срочной регуляции. Исследование физико--химических свойств молекул СОД при различных физиологических состояниях организма позволит выяснить механизм регуляции активности СОД и биологическое значение изменений её активности. Тот факт, что изменения активности каталазы в исследованных тканях при тех же физиологических состояниях лягушек [8] имеют ту же направленность, что и для СОД, говорит о связи изменений активности обоих антиокси-дантных ферментов с уровнем окислительного метаболизма в клетке. Поскольку основным источником свободных радикалов в клетке является дыхательная цепь митохондрий, представляет существенный интерес исследование влияния значительных изменений температуры тела у лягушек на активность митохонд-риальной СОД.
Литература
1. Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury / K. Hensley [et al.] // Free Radical Biol. & Med. 2000. Vol. 28, № 10. P. 1456-1462.
2. Storey K.B., Storey J.M. Metabolic rate depression in animals: transcriptional and translational controls // Biol. Rev. 2004. Vol. 79. P. 207-233.
3. Turrens J.F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species // J. Physiol. 2003. Vol. 552, № 2. P. 335-344.
4. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function // Physiol. Rev. 2002. Vol. 82. P. 47-95.
5. Weisinger R.A., Fridovich I. Superoxide Dismutase // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, № 10. P. 3582-3592.
6. Ascorbate dynamics and oxygen consumption during arousal from hibernation in Arctic ground squirrels / O. Toien [et al.] // Am. J. Physiol. (Regul. Interg. Comp. Physiol.). 2001. Vol. 281. P. R572-R583.
7. Зотин А.И. Термодинамическая основа реакций организмов на внешние и внутренние факторы. М., 1988. 272 c.
8. Исследование активности каталазы в тканях лягушки озерной Rana ridibunda при гипотермии и самосогревании / Э.З. Эмирбеков [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. Ес-теств. науки. 2004. Приложение. № 6. С. 55-61.
9. Дубинина Е.Е. Активность и свойства СОД эритроцитов и плазмы крови человека в онтогенезе // Укр. биохим. журн. 1988. Т. 66. С. 20-24.
10. Тимофеев Н.Н., Прокопьева Л.П. Нейрохимия гипобио-за и пределы криорезистентности организма. М., 1997. 208 с.
11. Gutteridge J.M.C., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000: A historical look to the future // Ann. NY Acad. Sci. 2000. Vol. 899(1). P. 136-147.
12. MacMillan-Crow L.A., Crow J.P., Thomson J.A. Peroxynitrite-mediated inactivation of manganes superoxide dismutase involves nitration and oxidation of critical tyrosine residues // Biochemistry. 1998. Vol. 37. P. 4731-4739.
13. Yan H., Harding J.J. Glycation-induced inactivation and loss of antigenicity of catalase and superoxide dismutase // Biochem. J. 1997. Vol. 328. P. 599-605.
14. Liochev S.I., Fridovich I. Cooper, Zinc Superoxide Dismutase and H2O2 // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277(38). P. 34674-34678.
Поступила в редакцию_6 ноября 2009 г.
