CC BY
15© А.В. Четверяков, В.Л. Цепелев, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-10
АКТИВНОСТЬ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ 4-1BB/4-1BBL У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ ТОЛСТОЙ КИШКИ
А.В. Четверяков, В.Л. Цепелев
ФГБОУВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, Российская Федерация, 672000, Чита, ул. Горького, 39а
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Четверяков Андрей Валерьевич — аспирант кафедры госпитальной хирургии ФГБОУВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России. Тел.: +7(914) 479-16-35. E-mail:yasnogorsk94@gmail.com. ORCID: 0000-0002-8472-107X
Цепелев Виктор Львович — заведующий кафедрой госпитальной хирургии ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России. Доктор медицинских наук, профессор. Тел: +7 (914) 479-16-35. E-mail: viktorcepelev@ mail.ru. ORCID: 0000-0002-2166-5154
Введение. Белок 4-1BB (CD137) усиливает активность Т-клеток, предотвращает их гибель, а также способствует выработке цитокинов, что делает его мощным костимулирующим фактором. В настоящее время ведется изучение применения этого гликопротеина с целью воздействия на ключевые звенья канцерогенеза.
Цель исследования. Оценка уровня 4-1ВВ в сыворотке крови, ткани опухоли и лимфатических узлов у больных с опухолями толстой кишки.
Методы. Исследование выполнено на базе ГУЗ «Краевой онкологический диспансер» (Чита) и включало 44 пациента с коло-ректальным раком, а также 25 больных с доброкачественными новообразованиями толстой кишки, проходивших лечение в период с 2019 по 2020 гг. Контрольная группа включала 25 пациентов, проходивших лечение (пластика колостомы) в ГУЗ «Краевая клиническая больница» (Чита). Концентрацию 4-1BB определяли в сыворотке крови, супернатанте гомогената ткани опухоли и лимфатических узлов с помощью метода проточной цитофлуометрии.
Результаты. Установлено, что у больных раком толстой кишки концентрация растворимой формы 4-1BB в сыворотке крови увеличивалась в 1,88раза, у пациентов с доброкачественными новообразованиями толстой кишки — в 1,86раза относительно контрольной группы. Концентрация 4-1BB в ткани опухоли у пациентов с колоректальным раком превышала данный показатель группы контроля в 2,06раза и группы больных с доброкачественными новообразованиями в 1,43раза.
Заключение. Сигнальный путь 4-1BB/4-1BBL вовлечен в каскад реакций врожденного и адаптивного иммунитета и является одним из звеньев канцерогенеза у больных с колоректальным раком.
Ключевые слова: колоректальный рак, 4-1BB, иммунитет
ACTIVITY OF THE 4-1BB/4-1BBL SIGNALING PATHWAY IN PATIENTS WITH COLON TUMORS
A.V. Chetveryakov, V.L. Tsepelev
FSBI HE "Chita State Medical Academy", Ministry of Health of Russia, Gorky st., 39a, Chita, 672000, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Chetveryakov Andrey Valerevich — postgraduate, Department of Hospital Surgery, FSBI HE "Chita State Medical Academy" of Ministry of Health. Tel.: +7(914) 479-16-35. E-mail:yasnogorsk94@gmail.com. ORCID: 0000-0002-8472-107X
Tsepelev Viktor Lvovich — Head of the Department of Hospital Surgery, FSBI HE "Chita State Medical Academy" of Ministry of Health. Tel.: +7(914) 479-16-35. E-mail: viktorcepelev@mail.ru. ORCID: 0000-0002-2166-5154
Background. Protein 4-1BB (CD137) enhances the activity of T-cells, prevents their death, and promotes the production of cytokines, which makes it a powerful co-stimulating agent. Currently, the use of this glycoprotein is being studied in order to influence the key links of carcinogenesis.
Objective. We aimed to assess 4-1BB level in blood serum, tumor tissue and lymph nodes in patients with colon tumors.
Methods. The study was carried out in the Regional Oncology Dispensary in Chita and included 44patients with colorectal cancer and 25 patients with benign tumor of the colon who were treated between 2019 to 2020. The control group comprised 25 patients who had been operated due to colon injury at the Regional Clinical Hospital in Chita. We determined 4-1BB concentration in blood serum, the supernatant of the homogenate of tumor tissue and lymph nodes using the flow cytofluometry method.
Results. It was found that in patients with colon cancer the concentration of the soluble form 4-1BB in the blood serum increased by 1.88 times, in patients with benign tumor of the colon — by 1.86 times compared to the control group. The concentration of 4-1BB in tumor tissue in patients with colorectal cancer exceeded this indicator by 2.06 times compared to the control group and it increased by 1.43 times in comparison with the group of patients with benign tumor.
Conclusion. The 4-1BB/4-1BBL signaling pathway is involved in the cascade of innate and acquired immunity reactions and is one of the carcinogenesis links in patients with colorectal cancer.
Key words: colorectal cancer, 4-1BB, immunity
ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на появление и успешное применение новых способов иммунотерапии рака, достижение стойкой ремиссии злокачественного процесса является сложной задачей. Опухолевые клетки успешно «ускользают» от иммунного ответа, что является важным звеном в патогенезе развития и роста новообразования. Основную роль в уничтожении опухолевых клеток играют цитотоксические T-лимфоциты (cytotoxic T-lymphocyte, CTL). Ингибирование опухолевыми клетками этих иммунных агентов происходит в первую очередь. На основании вышеизложенного одним из видов иммунотерапии стало применение белковых молекул, которые способствуют активации и усилению свойств цитотоксических Т-лимфоцитов [1]. Одним из таких соединений является гликопро-теин 4-1BB (CD137). Белок 4-1BB, являясь иммунной контрольной точкой, оказывает костимулирующее действие на активированные Т-клетки, усиливает их функциональные возможности и способствует сохранению клеточной памяти [2]. Активация T-клеток поддерживает и усиливает экспрессию 4-1BB. Для индукции данного белка требуется 24 ч. Экспрессия 4-1BB обнаружена на поверхности NK-клеток (natural killer cells, NK-cells), моноцитах, макрофагах, дендритных клетках (dendritic cells, DS), регуляторных Т-клетках (regular T-cells, Treg) [3]. Для осуществления функций 4-1BB требуется взаимодействие с лигандом (4-1BBL), который экспрессируется на антигенпре-зентирующих клетках. Стимулирование Т-клеток происходит при активации таких путей, как c-Jun и p38 [4]. Свойства 4-1BB позволили использовать этот белок в адаптивной Т-клеточной терапии (cellular adoptive immunetherapy), суть которой заключается в переносе Т-клеток, выращенных in vitro, в организм пациента. Однако эффект такой терапии усиливается при использовании активирующих молекул, таких как 4-1BB [5]. Применение адаптивной Т-клеточной терапии показало высокую эффективность у пациентов с меланомой, раком яичников, мелкоклеточным раком легкого [2, 6, 7]. В работе Lian-sheng Cheng (2022) изучена эффективность применения белка 4-1BB на мышиных моделях с колоректальным раком (КРР). Результаты исследования демонстрируют существенную противоопухолевую активность, что послужило толчком для использования молекулы 4-1ВВ у пациентов с раком толстой кишки [8].
Целью нашей работы явилось изучение уровня 4-1BB в сыворотке крови, ткани опухоли и лимфатических узлов у больных с новообразованиями толстой кишки.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на базе ГУЗ «Краевой онкологический диспансер» (Чита), включало 44 пациента с КРР, а также 25 больных с доброкачественными новообразованиями толстой кишки, проходившие лечение в период с 2019 по 2020 гг. Контрольная группа включала 25 пациентов, проходивших лече-
ние (пластика колостомы, сформированной ранее по поводы травм толстой кишки), в ГУЗ «Краевая клиническая больница» (Чита). Пациенты были обследованы в соответствии с клиническими рекомендациями, утвержденными Минздравом России [9]. Каждый больной выразил согласие на участие и подписал информированное добровольное согласие, с которым был ознакомлен. Исследование выполнено согласно требованиям комиссии по этике ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, а также в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации (2013).
Критериями включения в исследование явились согласие пациента на участие в исследовании, наличие опухоли толстой кишки.
Критерии исключения:
♦ пациенты с положительным ВИЧ-статусом, аутоиммунными заболеваниями, вирусными и бактериальными инфекциями;
♦ больные, проходившие курс химиотерапевти-ческого или лучевого лечения перед оперативным пособием.
При гистологическом исследовании в 39 (88,6%) случаях ткань опухоли была представлена умеренно дифференцированной аденокарциномой (G2), в 3 (6,8%) — высокодифференцированной аденокарциномой (G1), в 2 (4,6%) — низкодифференцирован-ной аденокарциномой (G3). У 6 пациентов диагностирована I стадия, у 24 — II, у 8 — III, у 6 — IV стадия рака.
Забор крови проводили за 2 ч до начала оперативного вмешательства. Биоптаты ткани опухоли и ткани лимфатических узлов массой до 1 г гомогенизировали при помощи гомогенизатора Ultra-Turrax T 10 basic (IKA, Германия) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), далее центрифугировали при 5000 обр./мин в течение 10 мин и отбирали супернатант. Концентрацию 4-1BB в сыворотке крови и супернатанте тканей определяли методом проточной цитофлуоме-трии на анализаторе CytoFlex LX (Beckman Coulter, США), используя набор для мультиплексного анализа LEGENDplex™ HU (Immune Checkpoint, США) в соответствии с инструкциями производителя.
При проведении статистического анализа руководствовались принципами Международного комитета редакторов медицинских журналов (ICMJE) и рекомендациями «Статистический анализ и методы публикуемой литературе» (SAMPL) [10, 11]. Номинальные данные описывали с указанием абсолютных значений и процентных долей. Сравнение номинальных данных исследования проводили при помощи критерия х2 Пирсона, позволяющего оценить значимость различий между фактическим количеством исходов или качественных характеристик выборки, попадающих в каждую категорию, и теоретическим количеством, которое можно ожидать в изучаемых группах при справедливости нулевой гипотезы [12]. Нормальность распределения количественных признаков при численности исследуемых групп <50
человек оценивали с помощью критерия Шапиро— Уилка. Учитывая распределение признаков, отличное от нормального во всех исследуемых группах, полученные данные представляли в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me [Q1; Q3]. Ранговый анализ вариаций по Краскелу—Уоллису (H) выполняли для сравнения трех независимых групп по одному количественному признаку. При наличии статистически значимых различий с учетом поправки Бонферрони проводили попарное сравнение с помощью критерия Манна—Уитни [13]. Для определения фактической степени параллелизма между исследуемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена. Силу связи между исследуемыми параметрами определяли по шкале Чеддока [14]. Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics Version 25.0 (International Business Machines Corporation, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что концентрация растворимой формы 4-1BB в сыворотке крови в группе пациентов с раком толстой кишки увеличивалась в 1,88 [1,50; 2,58] раза относительно контрольной группы (U=295,0, p=0,004). Уровень 4-1BB в группе больных с доброкачественными новообразованиями толстой кишки превышал данный показатель группы контроля в 1,86 [1,35; 2,13] раза (U=65,0, p<0,001). Концентрация растворимой формы 4-1BB в сыворотке крови у больных со злокачественными и доброкачественными новообразованиями статистически не различалась (U=374,0, p=0,34) (см. таблицу).
Аналогичная динамика наблюдалась при исследовании данного гликопротеина в ткани опухоли. Так, уровень 4-1BB в группе пациентов с КРР был выше в 2,06 [1,71; 2,99] раза по сравнению с группой контроля (U=120,0, p<0,001). Концентрация 4-1ВВ в ткани опухоли у больных с доброкачественными новообразованиями толстой кишки превышала данный показатель контрольной группы в 1,44 [1,09; 1,74] раза (U=125,0, p=0,04) (см. таблицу). Установлено статистически значимое различие уровня 4-1ВВ в опухолевой ткани при доброкачественном и злока-
Уровень 4-1BB у больных с новообразованиями толстой кишки 4-1BB level in patients with colon tumor
Концентрация 4-1BB (пг/мл) Группы пациентов Тестовая статистика, df=2
контрольная, n=25 доброкачественная опухоль, n=25 КРР, n=44
Сыворотка 20,3 37,7 38,2 H=10,2; крови [19,8; 25,2] [34,1; 42,2] [37,9; 51,1] p=0,006
Ткань опухоли 11,1 [10,6; 13,3] 16,0 [14,5; 18,4] 22,9 [22,8; 31,7] H=22,9; p<0,001
Примечание: Н — критерий Краскела—Уоллиса; p — уровень значимости различий. Note: H — Kruskal — Wallis criterion; p — level of significance.
чественном процессе. Так, концентрация 4-1ВВ у больных раком толстой кишки превышала таковую в группе пациентов с доброкачественной опухолью в 1,43 [1,24; 2,19] раза (U=272,0, p =0,02).
У пациентов с КРР определяли концентрацию 4-1BB в ткани регионарных лимфатических узлов. Установлено, что уровень 4-1BB в ткани лимфатических узлов у пациентов с КРР составил 254,3 [228,7; 311,9] пг/мл.
Наши исследования показали увеличение концентрации гликопротеина 4-1BB в сыворотке крови больных с новообразованиями толстой кишки. Аналогичная динамика наблюдалась при исследовании данной молекулы в ткани опухоли. В исследованиях L. Yi и X. Jin (2022) у пациентов с раком легкого также отмечено увеличение уровня 4-1BB в сыворотке крови [15]. Похожие данные также были получены у больных с холангиокарциномой и раком шейки матки [16, 17].
Сигнальная молекула 4-1BB относится к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (TNF), обладающих костимулирующим действием. Данный гликопротеин играет важную роль в поддержании противоопухолевого иммунного ответа и формировании иммунологической памяти. Профиль экспрессии 4-1BB, а также его уникальная способность усиливать эффекторные ответы в нескольких субпопуляциях лимфоцитов, имеющих отношение к опухолевому иммунитету, делает 4-1BB уникальной и привлекательной мишенью для иммунотерапии [18]. Так, показано, что терапия агонистами 4-1BB приводит к стимуляции пролиферации CD8+ цитоток-сических Т-клеток и увеличению их эффекторного потенциала за счет увеличения выработки гамма-интерферона и экспрессии множества гранзимов. Антитела к 4-1BB стимулируют антителозависимую кле-точно-опосредованную цитотоксичность через Fc/ FcR взаимодействия. Агонисты 4-1BB, нацеленные на дендритные клетки (dendritic cells, DC), индуцируют созревание последних и способности презентации антигена. Кроме того, стимулированные гликопроте-ином 4-1BB DC начинают экспрессировать IL-12 и IL-27, а также фермент IDO для модуляции функции Т-клеток [19].
Адаптивная Т-клеточная терапия, основанная на агонистиче-ских моноклональных антителах к 4-1BB, приводит к высокой противоопухолевой активности у пациентов с В-клеточной лимфомой и лейкозом [8]. Однако развитие системной токсичности не позволило применять препарат продолжительное время. К тому же уменьшение дозы препарата не приводит к ожидаемой противоопухолевой активности. Поэтому оптимальным выходом из сложившейся ситуации стало применение двух видов моноклональных антител к PD-1
(Programmed cell death-1, PD-1) и стимуляция экспрессии 4-1BB у пациентов с солидными опухолями нервной системы, что продемонстрировало отличные результаты и снижение системной токсичности [5]. Стоит также отметить, что в исследованиях Hinner (2019) продемонстрирована эффективность локальной доставки в опухолевую ткань специфичных антител к гликопротеину 4-1BB, что значительно снижает развитие системной токсичности [20]. Таким образом, применение агонистических моноклональных антител к 4-1BB позволяет стимулировать противоопухолевый иммунный ответ и способствовать регрессии опухоли.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сигнальный путь 4-1BB/4-1BBL вовлечен в каскад реакций врожденного и адаптивного иммуните-
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Fan X., Wang D., Zhang W., Liu J., Liu C., Li Q., Ma Z., Li H., Guan X., Bai Y. Inflammatory markers predict survival in patients with advanced gastric and colorectal cancers receiving Anti-PD-1 therapy. Front Cell Dev Biol. 2021; 9: 638312. https://doi. org/10.3389/fcell.2021.638312
2. Palameta S., Manrique-Rincon A.J., Toscaro J.M., Semionatto I.F., Fonseca M.C., Rosa R.S.M., Ruas L.P., Oliveira P.S.L., Bajgel-man M.C. Boosting antitumor response with PSMA-targeted immunomodulatory VLPs, harboring costimulatory TNFSF ligands and GM-CSF cytokine. Mol Ther Oncolytics. 2022; 17 (24): 650-62. https://doi. org/10.1016/j.omto.2022.02.010
3. Zizzari I.G., Filippo A.Di., Botticelli A. Circulating CD137+ T-cells correlate with improved response to Anti-PD1 immunother-apy in patients with cancerCD137+ T-cells for a successful immunotherapy. Clinical Cancer Research. 2022; 1-11. https://doi. org/10.1158/1078-0432.CCR-21-2918
4. Legut M., Gajic Z., Guarino M. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 2022; 603 (7902): 728-35. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04494-7
5. Meier S.L., Satpathy A.T., Wells D.K. Bystander T-cells in cancer immunology and therapy. Nature Cancer. 2022; 3 (2): 143-55. https://doi.org/10.1038/s43018-022-00335-8
6. Yi L., Jin X., Wang J., Yan Z., Cheng X., Wen T., Yang B., Wang X., Che N., Liu Z., Zhang H. CD137 agonists targeting CD137-medi-ated negative regulation show enhanced antitumor efficacy in lung cancer. Front Immunol. 2022; 7 (13): 771809. https://doi. org/10.3389/fimmu.2022.771809
7. Cheng H., Zong L., Kong Y., Gu Y., Yang J., Xiang Y. Emerging targets of immunotherapy in gynecologic cancer. Onco Targets Ther. 2020; 13: 11869-82. https://doi. org/10.2147/0TT.S282530
8. Cheng L., Cheng Y., Liu W., Shen A., Zhang D. A humanized 4-1BB-targeting agonistic
Для цитирования: Четверяков А.В., Цепелев В.Л. Активность сигнального пути 4-1BB/4-1BBL у пациентов с опухолями толстой кишки. Молекулярная медицина. 2022; 20 (4): 60-63. https://doi. org/10.29296/24999490-2022-04-10
та и является одним из звеньев канцерогенеза у больных КРР. Это позволяет рассматривать гликопротеин 4-1BB, с одной стороны, в качестве потенциального биомаркера, с другой — в качестве мишени для тар-гетной терапии больных раком толстой кишки. Коррекция иммунного ответа посредством применения агонистических моноклональных антител к 4-1BB является, на наш взгляд, перспективным направлением лечения больных КРР.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Zabajkal'skij medicinskij vestnik. 2020; 1: 151-63 (In Russian)]
14. Мудров В.А. Алгоритмы корреляционного анализа данных в биомедицинских исследованиях с помощью пакета программ SPSS. Забайкальский медицинский вестник. 2020; 2: 169-76. [Mudrov V.A. Algorithms for performing data correlation analysis in biomedical research using the SPSS software package. Zabajkal'skij medicinskij vestnik. 2020; 2: 169-76 (In Russian)]
15. Yi L., Jin X., Wang J., Yan Z., Cheng X., Wen T., Yang B., Wang X., Che N., Liu Z., Zhang H. CD137 agonists targeting CD137-medi-ated negative regulation show enhanced antitumor efficacy in lung cancer. Front Immunol. 2022; 7 (13): 771809. https://doi. org/10.3389/fimmu.2022.771809
16. Kim H.D. 4-1BB delineates distinct activation status of exhausted tumor infiltrating CD8+ T cells in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2020; 71 (3): 955-71.
17. Kayukova E.V., Sholokhov L.F., Belokrinits-kaya T.E., Tereshkov P.P. Checkpoint proteins in patients with precancer and cervical cancer. BioRxiv. 2021; 02.09.430409. https:// doi.org/10.1101/2021.02.09.430409
18. Ye L., Park J.J., Yang Q. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8
T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metabolism. 2022; 34 (4): 595-614.
19. Zhou L. Group 3 innate lymphoid cells produce the growth factor HB-EGF to protect the intestine from TNF-mediated inflammation. Nature Immunology. 2022; 23 (2): 251-61. https://doi.org/10.1038/s41590-021-01110-0
20. Hinner M.J., Aiba R.S.B., Jaquin T.J., Berger S., Durr M.C. Tumor-localized costimulatory T-Cell engagement by the 4-1BB/ HER2 bispecific antibody-anticalin fusion PRS-343. Clin. Cancer Res. 2019; 125 (19): 5878-89. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-18-3654
Поступила 15 июня 2022 г.
For citation: Chetveryakov A.V., Tsepelev V.L. Activity of the 4-1BB/4-1BBL signaling pathway in patients with colon tumors. Molekulyarnaya medit-sina. 2022; 20 (4): 60-63 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-10
10.
11.
12.
antibody exerts potent antitumor activity in colorectal cancer without systemic toxicity. Journal of Translation Medicine. 2022; 1: 1-21. https://doi.org/10.21203/ rs.3.rs-1352893/v1
Общероссийский национальный союз. Ассоциация онкологов России. Злокачественные новообразования ободочной кишки и ректосигмоидного отдела. Клинические рекомендации. 2020. [Russian National Union. Association of Oncologists of Russia. Colorectal cancer. Clinical recommendations. 2020 (In Russian)] Alshogran O.Y., Al-Delaimy W.K. Understanding of international committee of medical journal editor's authorship criteria among faculty members of pharmacy and other health sciences in Jordan. J. Empir Res Hum Res Ethics. 2018; 13 (3): 276 84. https://doi.org/10.1177/15562646187 64575 Lang T.A., Altman D.G. Basic statistical reporting for articles published in biomedical journals: Statistical analyses and methods in the published literature or the SAMPL guidelines. Int J. Nurs Stud. 2015; 52 (1): 5-9. https://doi.org/10.10Wj. ijnurstu.2014.09.006
Мудров В.А. Алгоритмы статистического анализа количественных признаков в биомедицинских исследованиях с помощью пакета программ SPSS. Забайкальский медицинский вестник. 2020; 1: 140-50.
[Mudrov V.A. Statistical analysis algorithms of quantitative features in biomedical research using the SPSS software package. Zabajkal'skij medicinskij vestnik. 2020; 1: 140-50 (In Russian)]
Мудров В.А. Алгоритмы статистического анализа качественных признаков в биомедицинских исследованиях с помощью пакета программ SPSS. Забайкальский медицинский вестник. 2020; 1: 151-63. [Mudrov V.A. Statistical analysis algorithms of qualitative features in biomedical research using the SPSS software package.
