CC BY
13УДК 591.11.05
Активность протеолитических ферментов в органах и тканях воблы ^и^Ш тОШ caspicus) при воздействии солей тяжелых металлов
Исмаилова С.И., Исуев А.Р.
Нурмагомедова П.М. Дагестанский
государственный университет, г. Махачкала
Статья посвящена исследованию влияния хлорида кадмия (0,25 мг/л) и ацетата свинца (0,5 мг/л) на активность катепсина Д и суммарную активность нейтральных проте-аз в печени и кишечнике воблы. Предлагается использовать показатели протеолитических
Введение. В настоящее время приобретает особое значение поиск биохимических маркеров для оценки влияния различных токсикантов на состояние организма гидробионтов и их популяций [8, 12, 9]. В этой связи привлекает внимание система протеолитических ферментов, которая отличается высокой чувствительностью к токсикантам и выступает основным инструментом в механизмах клеточной защиты при воздействии различных ксенобиотиков.
Одной из наиболее распространенных групп токсикантов для гидробионтов признаны соли тяжелых металлов. Среди них особой токсичностью отличаются кадмий и свинец [3].
Кадмий по своей токсичности близок к ртути и мышьяку. Основная часть кадмия (90-98%) поступающего в водные экосистемы имеет антропогенное происхождение. Попадая в водоемы, ионы кадмия не подвергаются деструкции и не выводятся естественным путем из водной среды. Они легко поглощаются рыбами, и аккумулируются в тканях внутренних органов рыб: в печени, жабрах, почках, желудочно-кишечном тракте, мышцах. В клетке кадмий, инакти-вирует металлоферменты, участвующие во многих метаболических процессах; нарушает проницаемость мембран, ингибирует как окислительное фосфорилирование, так и синтез белков и нуклеиновых кислот.
Особого внимания также заслуживает свинец, загрязнение которым атмосферы, почвы и водоемов приобрело глобальный характер. Органами - мишенями для соединений свинца, растворимых в воде, выступают жабры и кишечник. Свинец обладает способностью депонироваться в организме, преимущественно в печени. Одним из опасных свойств соединений свинца является его способность замещать кальций в костях, соз-
ферментов в тканях рыб в качестве чувствительного теста на загрязнение водной среды ионами тяжелых металлов.
Ключевые слова: загрязнение, тяжелые металлы, катепсин Д, нейтральные протеазы.
давая, таким образом, постоянный источник отравления организма в течение длительного времени [3].
Свинец подобно другим тяжелым металлам, включается в различные клеточные ферменты, образуя необратимые комплексы «энзим - свинец», что приводит к блокаде ионных каналов и нарушению механизма активного транспорта ионов [3].
Учитывая выше изложенное нами исследованы протеолитические ферменты различной локализации: маркер лизосом - катепсин Д и нейтральные протеазы локализованные в цитозоле.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе лаборатории ихтиологии Дагестанского государственного университета и КАСПНИРХа. Биологическими объектами исследования были двухлетки воблы. Моделирование хронического загрязнения водной среды тяжелыми металлами производилось в аквариальных условиях. В аквариумах создавались условия постоянного температурного (19-210С) и газового режима. В опытах использовано 132 особи.
В хронических опытах были испытаны следующие загрязнители:
1. Хлорид кадмия с содержанием в водной среде 0,25 мг/л (ПДК - 0,005 мг/дм3);
2. Ацетат свинца с содержанием в водной среде 0,5 мг/л (ПДК - 0,1 мг/дм3) [10, 4].
Биохимические показатели определяли в печени и кишечнике рыб на 5, 15, 30 и 40 сутки экспозиции в водной среде с токсикантами.
Активность катепсина Д определяли методом Ансона по гидролизу гемоглобина фирмы «Агат» при рН=3,8, и выражали в мкг тиро-зина/мг белка [11]. Общую активность нейтральных протеиназ определяли модифицированным методом Лоури по гидролизу казеина при рН=7,4, и выражали в мкМоль/г мин [1].
% 50
катепснн Д
ментальные про темпы
>день
1>день
30-день
10-день
Рис. 1. Влияние интоксикации ионами кадмия и свинца на активность протеолитических ферментов (в % по отношению к контролю) в печени воблы. Здесь и далее: 1, 3 - кадмий, 2, 4 - свинец.
Использовались реактивы марки «ХЧ». Полученные данные подвергали вариационно-статистической обработке по методу малой выборки [5]. Построение диаграмм осуществлено при помощи пакета Excel 7.0.
Результаты и их обсуждение. На рисунках 1 и 2 приведены данные по влиянию хлорида кадмия и ацетата свинца на активность катеп-сина Д и суммарную активность нейтральных протеаз в печени и кишечнике воблы.
По нашим данным при экспозиции воблы в течение 5 дней в токсической среде с хлоридом кадмия и ацетатом свинца активность катепсина Д в печени не отличается от контроля.
В отличие от катепсина Д активность суммарных нейтральных протеаз в печени под воздействием ионов кадмия повышается по сравнению с контролем на 17,5% (Р<0,02), а под воздействием ионов свинца не отличается от контроля [рис. 1].
На 15-й день пребывания воблы в водной среде с ионами кадмия и свинца в печени наблюдается повышение активности катепсина Д на 11,8 и 17,7% по сравнению с контролем.
Суммарная активность нейтральных протеаз в печени на данном этапе интоксикации ионами кадмия повышается на 30,2%, а в среде с ионами свинца - на 9,6%, по сравнению с контролем (Р<0,02) [рис. 1].
Пролонгирование интоксикации воблы (30 дней) в водной среде с ионами кадмия приводит к дальнейшему повышению активности катепсина Д в печени на 21,7% (Р<0,01), а в среде с ионами свинца, наоборот, активность фермента на уровне контроля. Суммарная активность нейтральных протеаз печени в этих же условиях повышается по сравнению с контролем на 39,7% в среде с кадмием, и на 17,5% в среде со свинцом (Р<0,001) [рис. 1].
Интоксикация рыб ионами кадмия и свинца в течение 40 дней приводит к снижению активности катепсина Д в печени по сравнению с контролем на 11,8 и 10,0% соответственно. На данном этапе суммарная активность нейтральных протеаз в печени под воздействием хлорида кадмия все еще выше контроля на 22,2% (Р<0,001), а под воздействием ацетата свинца не отличается от контроля [рис. 1].
В отличие от печени, в кишечнике воблы на 5-день эксперимента под воздействием ионов кадмия и свинца наблюдается повышение активности катепсина Д на 46,2 и 92,3% (Р<0,001). Суммарная активность нейтральных протеаз в кишечнике тоже повышается как в среде с хлоридом кадмия (на 16,4%), так и в среде с ацетатом свинца (на 54,8%) по сравнению с контролем [рис. 2].
Пребывание воблы до 15- дней в среде с хлоридом кадмия приводит к повышению ак-
Рис.2. Влияние интоксикации ионами кадмия и свинца на активность протеолитических ферментов (в % по отношению к контролю) в кишечнике воблы.
тивности катепсина Д в кишечнике по сравнению с контролем в 2,3 раза, а в среде с ацетатом свинца понижается на 38,5% (Р<0,001).
В эти же сроки интоксикации активность суммарных нейтральных протеаз в кишечнике воблы выше контроля в 1,6 раза, как при воздействии ионов кадмия, так и свинца (Р<0,001) [рис. 2].
На 30-день интоксикации ионами кадмия активность катепсина Д в кишечнике воблы все еще выше нормы в 1,9 раза (Р<0,001), а в среде с ионами свинца активность фермента ниже контроля на 17,3%.
На данном этапе интоксикации суммарная активность нейтральных протеаз в кишечнике воблы повышается относительно контроля в 1,8 раза в среде с ионами кадмия и в 2 раза в среде с ионами свинца (Р<0,01) [рис. 2].
К 40 дню интоксикации ионами кадмия активность катепсина Д в кишечнике не отличается от контроля, а в среде со свинцом активность катепсина Д ниже контроля на 30,8% (Р<0,001). Суммарная активность нейтральных протеаз в кишечнике в этот же период интоксикации ионами кадмия и свинца все еще выше контроля на 48,7 и 42,8% соответственно (Р<0,001) [рис. 2].
Результаты наших исследований показывают, что интоксикация ионами кадмия и свинца приводит к повышению активности
катепсина Д в печени (5, 15 дни) и кишечнике воблы (5, 15, 30 дни). Наиболее выраженные изменения в динамике активности катепсина Д наблюдаются в кишечнике воблы.
Изменения в динамике активности катепси-на Д в печени и кишечнике воблы более выражены в условиях кадмиевой интоксикации, чем свинцовой. Из литературных источников известно также, что кадмий по своим токсическим свойствам превосходит свинец [6].
Повышение активности катепсина Д на начальных этапах интоксикации можно рассматривать как результат закисления среды и лабилизации лизосомальных мембран под воздействием исследуемых токсикантов. Последующее снижение активности катепсина Д при пролонгировании в среде с токсикантами, видимо, связано с включением регуля-торных механизмов защиты лизосомальных мембран, хотя не исключено, что более длительное воздействие токсикантов привело бы к необратимым процессам в организме.
Одним из проявлений биологического значения повышения активности протеаз может быть усиленный протеолиз дефектных (поврежденных) белковых структур, возникающих в результате воздействия токсикантов
[7].
Аналогичный эффект был показан при изучении влияния различных концентраций
ионов цинка, аммония, и некоторых других веществ на активность катепсина Д в тканях, икре и личинках рыб [13, 9].
При длительной интоксикации ионами кадмия и свинца выявлена достаточно четкая активация нейтральных протеаз, как в печени, так и в кишечнике воблы. Как нам известно, существенный вклад в суммарную активность нейтральных протеаз вносят кальпаины. Кальпаины выполняют в разных тканях животных общие регуляторные функции, поэтому неконтролируемое повышение активности этих ферментов может иметь фатальные последствия для организма [14]. Действие тяжелых металлов на тканевом уровне часто сопровождается явлением цитотоксичности, связанным с гибелью клеток путем некроза или апоптоза, а в этих процессах, как известно, кальпаины играют ключевую роль [2].
Результаты, полученные в ходе данного исследования, подтверждают участие катеп-сина Д и нейтральных протеаз в развитии ответной реакции организма на действие тя-
Р СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алейникова Т.Г., Рубцова Г. В. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - М.: Высшая школа, 1988. - С. 239.
2. Бондарева Л.А. , Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И. Внутриклеточная Са 2+ - зависимая протеолитическая система животных. - М.: Наука, 2006. - 294 с.
3. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем // Соросовский образоват. журн. Биология, 1998. Т.7. № 5. - С. 23-29.
4. Волошина Г. Э. Экологическая оценка состояния поверхностных вод реки Понура // Эколог. вест. Север. Кавказа, 2006. Т.2. № 1. - С.118-122.
5. Лакин В. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 300 с.
6. Линник П. Н., Искра И.В. Кадмий в поверхностных водах: содержание, формы, нахождение, токсическое действие // Гидробиол. журн., 1997. Т. 3. № 6. - С. 72-87.
7. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 1996. - С 56-70.
8. Немова Н.Н. Эколого-биохимическое тестирование водоемов по состоянию рыб / Н.Н. Немова, Р.У. Высоцкая, В.С. Сидоров // Научные аспекты экологических проблем России. - М.: Наука, 2002. Т.1. - С. 215-220.
Ismailova S.I.,
желых металлов. Можно предположить, что катепсин Д и нейтральные протеазы участвуют в процессах адаптации организма рыб на уровне внутриклеточного метаболизма, обеспечивая тем самым его устойчивость к изменяющимся условиям среды.
Выводы.
1. Показано, что при хроническом воздействии ионов кадмия и свинца происходит достоверная активация нейтральных протеаз, как в печени, так и в кишечнике воблы.
2. В развитии ответной реакции организма на действие хлорида кадмия и ацетата свинца принимают участие катепсин Д и нейтральные протеазы. Повышение активности ферментов протеолиза, по - видимому, связано с активацией защитных функций клетки.
3. Высокая чувствительность протеолити-ческих ферментов к загрязнению окружающей среды тяжелыми металлами может быть использована для биоиндикации водной среды и для оценки состояния гидробионтов при нормировании антропогенной нагрузки на водоемы.
9. Немова Н.Н., Крупнова М.Ю. Лизосомальные протеолитические ферменты - один из критериев оценки физиолого-биохимическо-го состояния рыб / Труды научной конференции Калининград, 2005. - С.116-117.
10. Минина Л.И. Методические указания к практикуму «Анализ объектов окружающей среды». Определение массовой концентрации меди, свинца, кадмия в поверхностных водах суши инверсионным вольтамперметрическим методом. Под ред. Е.М. Цыганкова. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 26.
11. Покровский А.А., Арчаков А.И. Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н. Озеховича. - М.: Медицина, 1968. - С. 117119.
12.Сидоров В.С., Немова Н.Н., Высоцкая Р.У., Феклов Ю.А. Использование интегрального биохимического индекса при определении предельно допустимых концентраций промышленных токсикантов // Прикладная биохимия и микробиология, 2002. Т.38. №2. - С. 345-350.
13. Чекунова М.П., Фролова А.Д. Роль лизосом в токсикологии металлов / Тез. докл. 3-го всесоюз. симпоз. «Структура и функции лизосом». - Тбилиси, 1986. - С. 228-229.
14. Suzuki K., Imajoh S., Emori Y., Kawasaki H., Minami Y., Ohno S. Regulation of activity of calpain //Adv. Enzymol. Regul., 1988. V.27. - P.153-169.
, Nurmagomedova P. M.
Isuyev A.R.
Activity of proteolytic enzymes in organs and tissues of the fish Rutilus rutilus caspicus
at exposure to heavy metals salts
Dagestan State University, Makhachkala
The article is dedicated to the study of the influence of cadmium chloride (0.25 mg/l) and lead acetate ( 0.5 mg/l) on the cathepsin D activity and total activity of neutral proteases in the Rutilus rutilus caspicus liver and intestine. It is suggested to use indicators of proteolytic enzymes in fish tissues in sensibility testing of aquatic contamination by heavy metals ions.
Материал поступил в редакцию 10.03.2010 г.
