CC BY
137
УДК 616-008 + 577.355-0.92.9
АКТИВНОСТЬ ПРООКСИДАНТНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ КРОВИ У КРЫС С ГИПОКОРТИКОИДНЫМИ И ГИПЕРКОРТИКОИДНЫМИ СОСТОЯНИЯМИ
А.И. Синицкий, М.В. Комелькова, Д.А. Козочкин, М.Е. Мишарина, О.Б. Цейликман, В.Э. Цейликман, М.С. Лапшин
Целью работы является изучение активности ферментов крови, вовлеченных в регуляцию свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях. Исследование выполнено на 84 белых беспородных крысах. Гиперкортикоидное состояние моделировалось путем ежедневных трехчасовых иммобилизаций с интервалом между воздействиями 3 ч. Гипокортикоидное состояние моделировали путем введения глюкокортикостероидного препарата пролонгированного действия триамцинолона аце-тонида (кеналог, УеЪ Вег1т-СЬеш1е, Германия, доза: 2 мг/кг). В цельной крови определяли активность ксантиноксидазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы. При гиперкортикоидном состоянии, вызванном ежедневными иммобилизациями, наблюдалось увеличение активности ксантиноксидазы, при одновременном увеличении активностей глутатионпероксидазы и каталазы. Гипокортикоидное состояние, вызванное введением триамцинолона ацетонида, сопровождалось снижением активности ксантиноксидазы и миелопероксидазы при одновременном увеличении активности каталазы в крови. При изученном гиперкортикоидном состоянии наблюдалось повышение активности как прооксидантных, так и антиоксидантных ферментов крови, а при гипокортикоидном состоянии их снижение за исключением глутатионперокси-дазы. Это свидетельствует об участии глюкокортикоидов в регуляции экспрессии этих ферментов.
Ключевые слова: стресс, глюкокортикоиды, антиоксиданты.
Подавляющее большинство метаболических процессов в организме позвоночных животных регулируется глюкокортикоидными (ГКГ) гормонами [14]. Уникальное разнообразие и распространенность эффектов ГКГ, очевидно, связаны с их основной функцией: эндокринной регуляцией стресса и адаптационных процессов. Известно, что ГКГ принимают участие и в регуляции процессов свободнорадикального окисления. Сегодня известно о глю-кокортикоидной регуляции МО-синтазы [9], глута-тионпероксидазы [13], каталазы [10], скорости продукции АФК [3, 8], НАДФН-оксидазы [12], мо-ноаминоксидазы [15]. Следовательно, от функционального состояния гипоталамо-гипофизарная адреналовая система (ГГАС), которое в свою очередь, определяется, прежде всего, частотой, длительностью, кратностью, и характером действующих стрессоров, могут зависеть и многие особенности свободнорадикального окисления. Дестабилизация ГГАС с последующим развитием гипо- или гипер-кортикоидного состояния зачастую является основой для развития большого количества различных заболеваний. При этом весьма вероятным последствием такой дестабилизации является развитие окислительного стресса. В данной работе мы изучали активность ферментов крови, вовлеченных в регуляцию свободнорадикального окисления, при гипо-и гиперкортикоидных состояниях.
Материалы и методы. Исследование выполнено на 84 белых беспородных крысах. Гиперкор-тикоидное состояние моделировалось путем ежедневных трехчасовых иммобилизаций с интервалом между воздействиями 3 ч [2]. Дополнительно оценивалась индивидуальная чувствительность к гипоксии и уровень микросомального окисления животных [2]. Гипокортикоидное состояние моделировали путем введения глюкокортикостероидного препарата пролонгированного действия три-амцинолона ацетонида (кеналог, УеЪ Вег1ш-СИеш1е, Германия, доза: 2 мг/кг) [7]. В цельной крови определяли активность ксантиноксидазы [11], глутатионпероксидазы [1], каталазы [4]. Содержание молекулярных продуктов ПОЛ определяли по методике И. А. Волчегорского и соавт. [6], а содержание карбонилированных белков - по методике Е.Е. Дубининой и соавт. [5]. Статистическую значимость различий между несколькими группами определяли с помощью критерия Крас-келла - Уолиса, между двумя группами по критерию Манна - Уитни.
Результаты и обсуждение. При гиперкорти-коидном состоянии, вызванном ежедневными иммобилизациями, наблюдалось увеличение активности ксантиноксидазы, при одновременном увеличении активностей глутатионпероксидазы и каталазы (табл. 1).
Проблемы здравоохранения
Таблица 1
Уровень активности ферментов у нестрессированных и стрессированных крыс
Фермент Контроль (п = 18) Стресс (п = 17)
Миелопероксидаза в крови, Мкм/мин/л 43,06 ± 2,4 Р = 0,009 и 63,34 ± 5,67
Ксантиноксидаза в крови, шИ/шш^ НЬ 0,34 ± 0,01 Р = 0,004 И 0,47 ± 0,02
Каталаза в крови, кат 19,52 ± 0,96 Р = 0,0002 И 15,35 ± 0,55
Каталаза в крови, кат/г Гб 111,81 ± 4,8 Р = 0,04 И 98,45 ± 3,5
Глутатионтранс фераза, мкм/мин/л 1,38 ± 0,09 Р = 0,02 И 0,98 ± 0,11
Примечание. и - критерий Манна - Уитни; различия считали статистически значимыми при р < 0,05; Р - статистическая значимость различий между группами контроль и стресс.
Таблица 2
Влияние триамцинолона ацетонида на уровень активности прооксидантных и антиоксидантных ферментов крови, содержание молекулярных продуктов перекисного окисления липидов и уровень окислительной модификации белков
Показатель Контроль (п = 18) Триамцинолона ацетонид (п = 16)
Каталаза, мкмоль /мл /мин 5,97 ± 0,86 * 9,36 ± 0,89
Глутатионпероксидаза, ммоль/мл/мин 7,71 ± 0,46 * 1,58 ± 0,67
Глутатионтрансфераза, ммоль/мл/мин 10,11 ± 1,91 * 3,09 ± 0,8
Ксантиноксидаза, ЕД/л 6,67 ± 0,66 * 1,14 ± 0,69
Миелопероксидаза, мкмоль/л/мин 37,65 ± 2,16 * 30,17 ± 1,41
Окислительная модификация белка, мкмоль/ г белка 4,472 ± 0,316 * 6,246 ± 0,689
Окислительная модификация белка, (индукция Ее2+/Н202), мкмоль / г белка 12,97 ± 27,07 11,24 ± 11,08
Диеновые конъюгаты (гептановая фаза), е.о.и. 0,967 ± 0,022 0,966 ± 0,025
Кетодиены и сопряжённые триены (гептановая фаза), е.о.и. 0,264 ± 0,018 * 0,367 ± 0,041
Шиффовы основания (гептановая фаза), е.о.и. 0,021 ± 0,021 0,007 ± 0,007
Диеновые конъюгаты (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,612 ± 0,036 * 0,315 ± 0,069
Кетодиены и сопряжённые триены (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,323 ± 0,010 * 0,464 ± 0,099
Шиффовы основания (изопропанольная фаза), е.о.и. 0,011 ± 0,010 0,012 ± 0,012
Примечание. * - статистически значимые отличия от соответствующих показателей контрольной группы; е.о.и. - единицы окислительного индекса.
На этом фоне у стрессированных животных отмечено повышение содержания изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов в плазме крови. Однако на эту тенденцию оказывало влияние исходная устойчивость животных к гипоксии. Обнаружено, что у стрессированных высокоустойчивых (ВУ) животных по сравнению с контролем наблюдалось снижение активности ксантиноксидазы. В отличие от ВУ крыс стресси-
рование НУ крыс привело к повышению активностей миелопероксидазы и ксантиноксидазы. Кроме того, у стрессированных НУ животных наблюдалось снижение активности каталазы. На этом фоне у стрессированных НУ крыс наблюдалось повышение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Данные изменения не зависели от исходных различий по уровню микросо-мального окисления.
Гипокортикоидное состояние, вызванное введением триамцинолона ацетонида, сопровождалось снижением активности ксантиноксидазы и миелопероксидазы в крови. Активность глутати-онпероксидазы и глутатионтрансферазы также была снижена (табл. 2). Но при этом наблюдалось увеличение активности каталазы, что свидетельствует о некотором увеличении антиоксидантной защиты в крови. Указанные изменения активностей про- и антиоксидантных ферментов сопровождались накоплением вторичных продуктов пере-кисного окисления липидов и усилением спонтанной и металл-катализируемой окислительной модификации белков. При этом статистически значимо уменьшалось содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов, что указывает на преобладание среди продуктов свободнорадикального окисления карбонильных производных.
Таким образом, у ВУ крыс при стрессе наблюдалось снижение активности как проокси-дантных, так и антиоксидантных ферментов. Это может отражать уменьшение кислородного запроса тканей, что является одним из признаков толерантной стратегии адаптации. Напротив, у НУ животных, также как и в общей выборке стрессиро-ванных животных, наблюдалось усиление
активности таких прооксидантных ферментов, как ксантиноксидаза и миелопероксидаза, при одновременном снижении активности каталазы. Таким образом, одно и то же стрессорное воздействие привело к различным изменениям баланса проок-сидантных и антиоксидантных ферментов. Только у НУ крыс по этим параметрам наблюдались признаки оксидативного стресса в зависимости от устойчивости к гипоксии. Анализ взаимоотношения между глюкокортикоидами и процессом свободнорадикального окисления позволяет рассматривать гормоны коры надпочечников в качестве кон-дициональных факторов, у которых эффективность и последствия действия определяются условиями, в которых они находятся. В этом контексте можно рассматривать влияние глюкокорти-коидов на активность антиоксидантных и проок-сидантных ферментов как основной механизм их регуляции свободнорадикального окисления.
Влияние глюкокортикоидов на самые разнообразные ферменты сводятся к непосредственному влиянию гормонов на их активность и влияние гормонов на их экспрессию.
Заключение. При изученном гиперкортикоид-ном состоянии наблюдалось повышение активности как прооксидантных, так и антиоксидантных ферментов крови, а при гипокортикоидном состоянии их снижение за исключением глутатионпероксида-зы. Это свидетельствует об участии глюкокорти-коидов в регуляции экспрессии этих ферментов.
Исследование поддержано грантом РФФИ 14-04-01381.
Литература
1. Власова, С.Н. Активность глутатионзави-симых ферментов в эритроцитах при хронических заболеваниях печени у детей / С.Н. Власова, Е.И. Шабунина, И.А. Переслегина // Лаб. дело. -1990. - № 8. - С. 19-22.
2. Грек, О.Р. Гипобарическая гипоксия и метаболизм ксенобиотиков / О.Р. Грек, А.В. Ефремов, В.И. Шарапов. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -120 с.
3. Дубинина, Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты /Е.Е. Дубинина. - СПб.: Мед. пресса, 2006. -397 с.
4. Королюк, М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова // Лаб. дело. - 1988. - № 1. -С. 16-19.
5. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод её определения / Е.Е. Дубинина, С. О. Бурмистров, Д.А. Ходов и др. // Вопросы мед. химии. - 1995. - № 41. - С. 24-26.
6. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / И.А. Волчегорский, А.Г. Налимов, Б.Г. Яровинский, Р.И. Лифшиц // Вопросы мед. химии. - 1989. - № 1. -
C. 127-131.
7. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников, В.Э. Цейликман. - Челябинск: Изд-во ЧГПУ, 2000. -167 с.
8. Glucocorticoid receptor agonist compound K regulates dectin-1-dependent inflammatory signaling through inhibition of reactive oxygen species / T. T. Cuong, Y. Chul-Su, Y. Jae-Min et al. // Life Sciences. - 2009. - Vol. 85. - Р. 625-633.
9. Glucocorticoid response elements and 11 в-hydroxysteroid dehydrogenases in the regulation of endothelial nitric oxide synthase expression / Y. Liu,
D. Mladinov, J.L. Pietrusz et al. // Cardiovascular Research. - 2009. - Vol. 81. - P. 140-147.
10. Glucocorticoid treatment skews human monocyte differentiation into a hemoglobin-clearance phenotype with enhanced heme-iron recycling and antioxidant capacity / F. Vallelian, C.A. Schaer, T. Kaempfer et al. // Blood. - 2010. - Vol. 116 (24). -Р. 5347-5356.
11. Hashimoto, S. A new spectrophotometric Assay Method of Xantineoxidase in Grude Tissue Homo-genate / S. Hashimoto // Analytical biochemistry. -1974. - Vol. 62. - Р. 426-435.
12. NADPH Oxidase Mediates Depressive Behavior Induced by Chronic Stress in Mice / J.S. Seo, J.Y. Park, J. Choi et al. // The Journal of Neuroscience. - 2012. - Vol. 32 (28). - Р. 9690-9699.
Проблемы здравоохранения
13. Patel, R. Disruptive effects of glucocorticoids on glutathione peroxidase biochemistry in hippocampal cultures / R. Patel, L. McIntosh, J. McLaughlin // Journal of Neurochemistry. - 2002. - Vol. 82. -P. 118-125.
14. Sapolsky, R. How do glucocorticoids influence stress' responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory, and preparative actions / R.M. Sapolsky,
M. Romero, A. Munck // Endocrine Revies. - 2000. -№ 1. - P. 55-82.
15. Transcription factor E2F-associated phos-phoprotein (EAPP), RAM2/CDCA7L/JPO2 (R1), and simian virus 40 promoter factor 1 (Sp1) cooperatively regulate glucocorticoid activation of monoamine oxidase B / K. Chen, X.M. Ou, J.B. Wu, J.C. Shih // Mol. Pharmacol. - 2011. - Vol. 79(2). - P. 308-317.
Синицкий Антон Иванович, кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры биохимии, Южно-Уральский государственный медицинский университет (Челябинск), biochem2009@yandex.ru.
Комелькова Мария Владимировна, аспирант кафедры биохимии, Южно-Уральский государственный медицинский университет (Челябинск), kaprizka1982@mail.ru.
Козочкин Денис Александрович, ассистент кафедры биохимии, Южно-Уральский государственный медицинский университет (Челябинск), nauka-chelsma@yandex.ru.
Мишарина Мария Евгеньевна, аспирант кафедры биохимии, Южно-Уральский государственный медицинский университет (Челябинск), mari.misharina@mail.ru.
Цейликман Ольга Борисовна, профессор кафедры адаптивной физической культуры, физиологии и биохимии, Южно-Уральский государственный университет (Челябинск), diol2008@yandex.ru.
Цейликман Вадим Эдуардович, заведующий кафедрой биохимии, Южно-Уральский государственный медицинский университет (Челябинск), vadimed@yandex.ru.
Лапшин Максим Сергеевич, кандидат биологических наук, докторант кафедры адаптивной физической культуры, физиологии и биохимии, Южно-Уральский государственный университет (Челябинск), diol2008@yandex.ru.
Поступила в редакцию 5 января 2014 г.
Bulletin of the South Ural State University Series “Education, Healthcare Service, Physical Education” _________________________________2014, vol. 14, no. 1, pp. 73-77
ACTIVITY OF PROOXIDANT AND ANTIOXIDANT ENZYMES IN RATS WITH HYPOCORTICOID AND HYPERCORTICOID STATES
A.I. Sinitsky, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation, biochem2009@yandex.ru, M.V. Komelkova, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation, kaprizka1982@mail.ru,
D.A. Kozochkin, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation, nauka-chelsma@yandex.ru,
M.E. Misharina, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation, mari.misharina@mail. ru,
O.B. Tseylikman, South Ural State University, Chelyabinsk, Russian Federation, diol2008@yandex.ru,
V.E. Tseylikman, South Ural State Medical University, Chelyabinsk, Russian Federation, vadimed@yandex.ru, M.S. Lapshin, South Ural State University, Chelyabinsk, Russian Federation, diol2008@yandex.ru
Objective: to study the activity of enzymes involved in the regulation of blood free-radical oxidation in hypo- and hypercorticoid states. The study was performed on 84 white rats. Hypercorticoid state is achieved by the daily three-hour immobilization interval between exposures. Hypocorticoid condition is simulated by administering a long-acting glucocorticos-teroid preparation of triamcinolone acetonide (Kenalog, Veb Berlin-Chemie, Germany, dose: 2 mg/kg). In whole blood we determined activity of xanthine oxidase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase. At hypercorticoid state caused by daily immobilization we observed an increase in activity of xanthine oxidase with simultaneous increase in activity of glutathione peroxidase and catalase. Hypocorticoid induced by the administration of triamcinolone aceto-nide was associated with decreased activity of xanthine oxidase and myeloperoxidase with simultaneous increase in activity of catalase in the blood. At the studied hypercorticoid state we
observed increase in activity prooxidant as well as antioxidant enzymes of blood, and hypocor-ticoid state was associated with their decline except for glutathione peroxidase. This indicates that glucocorticoids are involved in the regulation of expression of these enzymes.
Keywords: stress, glucocorticoids, antioxidants.
References
1. Vlasova S.N., Shabunina E.I., Pereslegina I.A. [Activity of Glutathione Enzymes in Red Blood Cells in Chronic Liver Disease in Children]. Laboratornoe delo [Laboratory Case], 1990, no. 8, pp. 19-22 (in Russian).
2. Grek O.R., Efremov A.V., Sharapov V.I. Gipobaricheskaya gipoksiya i metabolizm ksenobiotikov [Hypo-baric Hypoxia and Metabolism of Xenobiotics]. Moscow, GEOTAR Media Publ., 2007, 120 p.
3. Dubinina E.E. Produkty metabolizma kisloroda v funktsional’noy aktivnosti kletok (zhizn’ i smert’, sozida-nie i razrushenie). Fiziologicheskie i kliniko-biokhimicheskie aspekty [Products of Oxygen Metabolism in the Functional Activity of Cells (Life and Death, Creation and Destruction). Physiological and Clinical-Biochemical Aspects]. St. Petersburg, Medical Press Publ., 2006, 397 p.
4. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Mayorova I.G. [Method for Determining the Activity of Catalase]. Laboratornoe delo [Laboratory Case], 1988, no. 1, pp. 16-19 (in Russian).
5. Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Khodov D.A. [Oxidative Modification of Proteins of Human Serum, the Method of Determining]. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of Medical Chemistry], 1995, no 41, pp. 24-26.
6. Volchegorskiy I.A., Nalimov A.G., Yarovinskiy B.G., Lifshits R.I. [Comparison of Different Approaches to the Definition of Lipid Peroxidation Products in the Heptane-isopropanol Extracts Blood]. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of Medical Chemistry], 1989, no 1, pp.127-131.
7. Volchegorskiy I.A., Dolgushin I.I., Kolesnikov O.L., Tseylikman V.E. Eksperimental’noe modelirovanie i laboratornaya otsenka adaptivnykh reaktsiy organizma [Experimental Modeling and Laboratory Evaluation of Adaptive Reactions of the Organism]. Chelyabinsk, Chelyabinsk Humanitarian Pedagogical University Publ., 2000, 167 p.
8. Cuong T.T., Chul-Su Y., Jae-Min Y. et al. Glucocorticoid Receptor Agonist Compound K Regulates Dectin-1-dependent Inflammatory Signaling through Inhibition of Reactive Oxygen Species. Life Sciences, 2009, no. 85, pp. 625-633.
9. Liu Y., Mladinov D., Pietrusz J.L. Glucocorticoid Response Elements and 11p-hydroxysteroid Dehydrogenases in the Regulation of Endothelial Nitric Oxide Synthase Expression. Cardiovascular Research, 2009, no. 81, pp. 140-147.
10. Vallelian F., Schaer C.A., Kaempfer T., Gehrig P., Duerst E., Schoedon G., Schaer D.J. Glucocorticoid Treatment Skews Human Monocyte Differentiation into a Hemoglobin-clearance Phenotype with Enhanced Heme-iron Recycling and Antioxidant Capacity. Blood. 2010, no. 116(24), pp. 5347-5356.
11. Hashimoto S. A New Spectrophotometric Assay Method of Xantineoxidase in Grude Tissue Homoge-nate. Analytical biochemistry, 1974, vol. 62, pp. 426-435.
12. Seo J.S., Park J.Y., Choi J. et al. NADPH Oxidase Mediates Depressive Behavior Induced by Chronic Stress in Mice. The Journal of Neuroscience, 2012, no. 32(28), pp. 9690-9699.
13. Patel R., McIntosh L., McLaughlin J. Disruptive Effects of Glucocorticoids on Glutathione Peroxidase Biochemistry in Hippocampal Cultures. J. of Neurochemistry, 2002, no. 82, pp. 118-125.
14. Sapolsky R.M., Romero M., Munck A. How do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Revies, 2000, no. 1, pp. 55-82.
15. Chen K., Ou X.M., Wu J.B., Shih J.C. Transcription Factor E2F-Associated Phosphoprotein (EAPP), RAM2/CDCA7L/JPO2 (R1), and Simian Virus 40 Promoter Factor 1 (Sp1) Cooperatively Regulate Glucocorticoid Activation of Monoamine Oxidase B. Mol. Pharmacol, 2011, no. 79(2), pp. 308-317.
Received 5 January 2014
