CC BY
28
литература (references)
1. Woodfolk J.A., Commins S.P., Schuyler A.J., Erwin E.A., Platts-Mills T.A.E. Allergens, sources, particles, and molecules: Why do we make IgE responses? Allergol. International. 2015; 64: 295—303.
2. Bienboire-Frosini C., Lebrun R., Vervloet D., Pageat P., Ronin C. Variable Content of Fel d 1 Variants in House Dust and Cat Extracts May Have an Impact on Allergen Measurement. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2012; 22(4): 270—9.
3. Arshad S.H. Does exposure to indoor allergens contribute to the development of asthma and allergy? Curr Allergy Asthma Rep. 2010; 10(1): 49—55.
4. Fahlbusch B, Gehring U, Richter K. Predictors of cat allergen (Fel d 1) in house dust of German homes with/without cats. J. Investig. Allergol. Clin Immunol. 2002; 12(1): 12—20.
5. Permaul P., Hoffman E., Fu C., Sheehan W., Baxi S., Gaffin J. et al. Allergens in urban schools and homes of children with asthma. Pediatr Allergy Immunol. 2012 Sep; 23(6): 543—9.
6. Zahradnik E, Raulf M Animal allergens and their presence in the environment. Front Immunol. 2014; 5: 1—20.
7. Bollinger M.E., Eggleston P.A., Flanagan E., Wood R.A. Cat antigen in homes with and without cats may induce allergic symptoms. J. Allergy Clin. Immunol. 1996; 97(4): 907—14.
8. Leaderer B.P., Belanger K., Triche E., Holford T., Gold D.R., Kim Y. et al. Dust Mite, Cockroach, Cat, and Dog Allergen Concentrations in Homes of Asthmatic Children in the Northeastern United States: Impact of Socioeconomic Factors and Population Density. Environmental Health Perspectives 2002; 110(4): 419—25.
9. Lau S., Illi S., Platts-Mills T.A.E., Riposo D., Nickel R., Grber C. et al. Longitudinal study on the relationship between cat allergen and endotoxin exposure, sensitization, cat-specific IgG and development of asthma in childhood — report of the German Multicentre Allergy Study (MAS 90) Allergy. 2005; 60: 766—73.
10. Carlsen K.C.L., Roll S., Carlsen K. Petter Mowinckel P., Wijga A.H., Brunekreef B. et al. Does Pet Ownership in Infancy Lead to Asthma or Allergy at School Age? Pooled Analysis of Individual Participant Data from 11. Europ. Birth. Cohorts PLOS ONE. 2012; 7(8): 1—12.
ORIGINAL ARTICLE
11. Collin S.M., Granell R, Westgarth C, Murray J, Paul E, Sterne J.A.C., and Henderson A. John. Pet ownership is associated with increased risk of non-atopic asthma and reduced risk of atopy in childhood: findings from a UK birth cohort. Clin. Exp. Allergy. 2015; 45(1): 200—10.
12. Linneberg A., Nielsen N.H., Madsen F., Fralund L., Dirksen A., J0rgensen T. Pets in the home and the development of pet allergy in adulthood. Copenhagen Allergy Study. Allergy. 2003; 58(1): 21—6.
13. Platts-Mills T.A., Woodfolk, J.A. Allergens and their role in the allergic immune response. Immunolog. Rewiews. 2011; 242: 51—68.
14. Schäfer T., Stieger B., Polzius R., Krauspe A. Associations between cat keeping, allergen exposure, allergic sensitization and atopic diseases: results from the Children of Lübeck Allergy and Environment Study (KLAUS). Pediatr. Allergy Immunol. 2009; 20(4): 353—7.
15. Gehring U., Triche E., van Strien R.T., Belanger K., Holford T., Gold
D.R. et al. Prediction of Residential Pet and Cockroach Allergen Levels Using Questionnaire Information. Environmental Health Perspectives. 2004; 112(8): 834—9.
16. Platts-Mills T.A., Vaughan J.W., Blumenthal K., Pollart Squillace S., Sporik R.B. Serum IgG and IgG4 antibodies to Fel d 1 among children exposed to 20 microg Fel d 1 at home: relevance of a nonallergic modified Th2 response. Int. Arch. Allergy Immunol. 2001; 124(1-3): 126—9.
17. Platts-Mills T.A., Perzanowski M., Woodfolk J.A., Lundback B. Relevance of early or current pet ownership to the prevalence of allergic disease. Clin. Exp. Allergy, 2002; 32: 335—8.
18. Lynch S.V., Wood R.A., Boushey H., Bacharier L.B., Bloomberg G.R., Kattan M. et al. Effects of early-life exposure to allergens and bacteria on recurrent wheeze and atopy in urban children. J. Allergy Clin. Immunol. 2014; 134(3): 593—601.
19. Wegienka G., Johnson C.C., Havstad S., Ownby D.R., Nicholas C., Zoratti
E.M. Lifetime dog and cat exposure and dog- and cat-specific sensitization at age 18 years. Clin. Exp. Allergy. 2011; 41(7): 979—86.
20. Fu T., Keiser E., Linos E., Rotatori R.M., Sainani K., Lingala B. et al. Eczema
and sensitization to common allergens in the United States: a multiethnic, population-based study. Pediatr. Dermatol. 2014; 31(1): 21—6.
Поступила 30.03.17 Принята в печать 14.04.17
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.858-008.6-07:616.153.1]-092.9
Иванова Е.А.1, Золотое Н.Н.1, Капица И.Г.1, Позднее В.Ф.2, Вальдман Е.А.1, Воронина Т.А.1
АКТИВНОСТЬ ПРОЛИНСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТЕИНАЗ И АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПАРКИНСОНИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ
1 ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», 125315, Москва, Россия;
2 ФГБНУ «НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича», 119435, Москва, Россия
В последнее время всё больше внимания уделяется участию пролинспецифических ферментов в формировании воспалительного процесса. Как при нейродегенеративной, так и при воспалительной патологии изменяется активность пролилэндопептидазы (КФ 3.4.21.26, ПЭП). Дипептидилпептидаза-^ (КФ 3.4.14.5, CD26, аденозиндезаминаза-связывающий белок, ДПП-4) обеспечивает активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов, а также совместно с родственными пептидазами гидролизует цитокины и нейропептиды. Настоящее исследование посвящено оценке активности ПЭП и ДПП-4 в сыворотке крови и спинномозговой жидкости крыс с паркинсоническим синдромом разной степени тяжести, а также изучению активности участвующего в развитии иммунных реакций фермента обмена пуринов аденозиндезаминазы (КФ 3.5.4.4, АДА) в сыворотке крови этих животных. Установлено, что у крыс с развивающимся паркинсоническим синдромом, индуцированным системным семидневным введением ро-тенона, достоверно повышается активность ПЭП в сыворотке крови и ДПП-4 в спинномозговой жидкости. При тяжелом, быстро развившемся паркинсоническом синдроме, вызванном введением 6-гидроксидофамина в средний переднемозговой пучок левого полушария крыс, наблюдается достоверное повышение активности ДПП-4 в
Для корреспонденции: Иванова Елена Анатольевна, http://orchid.org/0000-0003-4961-2051, канд. фарм. наук, старший научный сотрудник лаборатории психофармакологии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», E-mail: iwanowaea@yandex.ru
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
сыворотке крови при тенденции к снижению активности этого фермента в спинномозговой жидкости. У животных с паркинсоническим синдромом, индуцированным как системным введением нейротоксина ротенона, так и внутри-мозговым введением нейротоксина 6-гидроксидофамина, снижается активность фермента аденозиндезаминазы в сыворотке крови. Обнаруженные изменения активности ферментов обмена пептидов и нуклеотидов у крыс с паркинсоническим синдромом, вызванным как системным (модель с ротеноном), так и внутримозговым (модель с 6-гидроксидофамином) введением нейротоксинов, свидетельствуют об участии этих ферментов в развитии экспериментальной нейродегенеративной патологии, что представляет интерес для дальнейшего изучения.
Ключевые слова: паркинсонический синдром; дипептидилпептидаза-IV; пролилэндопептидаза; аденозиндезаминаза; ротенон; 6-гидроксидофамин; крысы. Для цитирования: Иванова Е.А., Золотое Н.Н., Капица И.Г., Позднее В.Ф., Вальдман Е.А., Воронина Т.А. Активность пролинспецифических протеиназ и аденозиндезаминазы в сыворотке крови и спинномозговой жидкости при экспериментальном паркинсоническом синдроме. Иммунология. 2017; 38(4): 213-218. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-213-218
Ivanova E.A., Zolotov N.N., Kapitsa I.G., Pozdnev V.F., Val'dman E.A., Voronina T.A.
PROLINE-SPECIFIC ENDOPEPTIDASE AND ADENOSINE DEAMINASE ACTIVITY IN BLOOD SERUM AND CEREBROSPINAL FLUID IN EXPERIMENTAL PARKINSON'S SYNDROME
1 V.V. Zakusov Institute of Pharmacology, 125315, Moscow, Russia;
2 V.N. Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, 119435, Moscow, Russia
Nowadays attention is increasingly focused on the role of proline-specific enzymes in inflammation. The activity of prolylendopeptidase enzyme (PREP) is known to change in both inflammation and neurodegeneration. Dipeptidyl peptidase IV (adenosine deaminase binding protein, DPP-4) triggers T-lymphocyte activation and proliferation. DPP-4 and related peptidases hydrolyze cytokines and neuropeptides. This study is devoted to estimating of PREP and DPP-4 activity in blood serum and cerebrospinal fluid of rats with Parkinson's syndrome of different severity and to evaluating adenosine deaminase (ADA) activity in blood serum of these animals. ADA is a purine metabolism enzyme which is involved in immune response. It was shown that PREP activity significantly increased in blood serum and DPP-4 activity significantly increased in cerebrospinal fluid of rats with evolving Parkinson's disease induced by seven-day rotenone administration. Rats with a more severe advanced Parkinson's disease induced by 6-hydroxydopamine injection in the left medial forebrain bundle had significantly increased activity of DPP-4 in blood serum and a tendency toward a decrease of DPP-4 activity in cerebrospinal fluid. Reduced ADA activity in blood serum was demonstrated in both models of Parkinson's disease. Observed changes of the activity of peptide and purine metabolism enzymes in rats with Parkinson's syndrome induced by both systemic (rotenone-induced model) and intracerebral (model induced by unilateral intracerebral injection of 6-hydroxydipamine) administration of neurotoxins testify to the role of the enzymes in the progression of experimental neurodegenerative pathology and merit further investigations.
Keywords: Parkinson's syndrome, dipeptidyl peptidase IV, prolylendopeptidase, adenosine deaminase, rotenone, 6-hydroxydopamine, rats.
For citation: Ivanova E.A., Zolotov N.N., Kapitsa I.G., Pozdnev V.F., Val'dman E.A., Voronina T.A. Proline-specific endopeptidase and adenosine deaminase activity in blood serum and cerebrospinal fluid in experimentalparkinson's syndrome. Immunologiya. 2017; 38(4): 213-218. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-213-218 For correspondence: Elena A. Ivanova, http://orchid.org/0000-0003-4961-2051, PhD in Pharmacy, senior researcher of the laboratory of psychopharmacology, «V.V. Zakusov Institute of Pharmacology», E-mail: iwanowaea@yandex.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 25.03.17 Accepted 14.04.17
введение
Нейровоспаление рассматривается как ответ ЦНС не только на острое повреждение мозга, но и на развитие нейродегенеративных заболеваний [1]. Хотя ранняя воспалительная реакция в ответ на появление повреждающего агента в ЦНС направлена на активацию нейропротекции для восстановления, ремиелинизации нейронов и даже регенерации аксонов [2, 3], нейровоспаление, перешедшее в хроническое, губительно для ЦНС [4]. Поэтому нейровоспаление относится к факторам, усугубляющим тяжесть нейродегенеративных заболеваний и повышающим риск их развития [5]. Кроме того, нейровоспаление может приводить к развитию системного воспалительного процесса. В частности, это было показано экспериментально у крыс с нейровоспалением, вызванным введением в чёрную субстанцию бактериального эндотоксина липополисахарида (ЛПС), и у животных с гемипаркинсоническим синдромом, индуцированным введением в чёрную субстанцию 6-гидроксидофамина (6-ГОДА) [6]. Так, в плазме крови крыс с вызванным ЛПС нейровоспалением достоверно увеличивалась концентрация моноцитарного хемотоксиче-ского протеина-1; в плазме крови крыс с индуцированным
6-ГОДА паркинсоническим синдромом (ПС) достоверно повышался уровень интерлейкина 1а [6].
В последнее время всё больше внимания отводится участию пролинспецифических ферментов в формировании воспаления [7, 8]. Известно, что активность пролилэндопептидазы (ЕС 3.4.21.26., ПЭП) изменяется как при нейродегенеративной [9, 10], так и при воспалительной патологии [11, 12]. Недавно установлено, что ПЭП нейтрофилов — фермент, который в условиях активации воспалительным агентом ЛПС обеспечивает образование из коллагена хемоаттрактанта (пролил-глицил-пролина), отвечающего за хронизацию нейтрофильно-го воспалительного процесса [13]. Дипептидилпептидаза-^ (ЕС 3.4.14.5., ДПП-4, CD26, аденозиндезаминаза связывающий белок) и родственные ей пептидазы гидролизуют цито-кины и нейропептиды [14—16]. ДПП-4 обеспечивает активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов. Известно, что при ингибировании данного фермента улучшается приживаемость аллотрансплантата легких у мышей за счет уменьшения инфильтрации Т-лимфоцитов и экспрессии ГЬ-17 при повышении экспрессии ГЬ-10 [17]. Аденозиндезаминаза (АДА) необходима для оптимальной активности теломеразы CD8+ Т-лимфоцитов: снижение активности и экспрессии этого фер-
мента на клеточной поверхности приводит к репликативному старению T-лимфоцитов вследствие наличия избытка проявляющего иммуносупрессивный эффект аденозина [18].
Цель данной работы — изучение активности ДПП-4 и ПЭП в сыворотке крови и спинномозговой жидкости (СМЖ), а также активности АДА в сыворотке крови на экспериментальных моделях ПС у крыс: индуцированного системным введением ротенона и вызванного унилатеральным внутри-мозговым введением 6-гидроксидофамина.
Материал и методы
Исследования выполнены на половозрелых самцах аут-бредных белых крыс, массой на начало эксперимента 360— 440 г (модель ПС, индуцированного введением 6-ГОДА) и 380—500 г (модель ПС, вызванного системным введением ро-тенона), полученных из питомника «Столбовая» (Московская обл.). Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к корму и воде при 12-часовом световом режиме, в соответствии с нормативным документом СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29 августа 2014 г № 51.
Организация и проведение работы выполнялись в соответствии с международными и российскими нормативно-правовыми документами: Приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. (Страсбург).
В качестве модели развивающегося ПС была выбрана методика ПС, вызванного системным введением ротенона у аутбредных крыс в возрасте 4 мес [19]. ПС моделировали путём ежедневного семидневного внутрибрюшинного введения крысам разведенного в растворе миоглиоля (Miglyol 812 N) ротенона в дозе 2,75 мг/кг. Контрольным животным в течение 7 дней эксперимента вводили физиологический раствор в эквивалентном объёме. На 20-й день после первого введения ротенона у наркотизированных (этаминал-натрий в дозе 40 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс собирали СМЖ из большой (мозжечково-мостовой) цистерны. Сыворотку крови животных получали методом центрифугирования.
В сыворотке крови и СМЖ крыс флуориметрически определяли активность ферментов обмена пептидов ДПП-4 и ПЭП [20]. Метод основан на определении освобождающегося в процессе ферментативной реакции 7-амино-4-метилкумарина с пептидом Z-Ala-Pro-MCA (для ПЭП) или с пептидом Gly-Pro-MCA (для ДПП-4), имеющего отличный от пептидов спектр флуоресценции. Гидролиз субстрата регистрировался после инкубации проб при 37°C на спектроф-луориметре LS-5B (Perkin-Elmer, США). Инкубация пробы при измерении активности ДПП-4 в сыворотке крови составляла 15 мин, в СМЖ — 4 ч; инкубация пробы при измерении активности ПЭП в сыворотке крови составляла 25 мин, в СМЖ — 4 ч. Количество освободившегося из субстрата 4-метил-7-аминокумарина определяли, исходя из величины флуоресценции. Удельную активность ферментов определяли по формуле:
A (нмоль/мл/мин) = [(E - C) - (S - B)KW-1,
где E — флуоресценция пробы (380/460 нм); C — флуоресценция смеси, содержащей 0,02 мл субстрата и 0,02 мл сыворотки крови или 0,003 мл СМЖ, 0,76 мл (в случае определения активности ферментов в сыворотке) или 0,75 мл (в случае определения активности ферментов в СМЖ) трис-HCl (приготовленного из ТРИС-основания, Serva, Германия) буфера (pH 8), содержащего по 1 мМ ЭДТА-Na (Reanal, Венгрия), дитиотреитола (Serva, Германия), и 0,2 мл 20% уксусной кислоты; B — флуоресценция смеси, содержащей 0,02 мл субстрата, 0,78 мл трис-HCl буфера (pH 8), содержа-
ORIGINAL ARTICLE
щего по 1 мМ ЭДТА-№2, дитиотреитола, и 0,2 мл уксусной кислоты; S — флуоресценция смеси, содержащей 0,02 мл субстрата, 0,78 мл трис-HCl буфера (pH 8), содержащего по 1 мМ ЭДТА-№2, дитиотреитола, 0,2 мл 20% уксусной кислоты и 0,02 мл раствора 7-амино-4-метилкумарина (Serva, Германия) (2 нмоль), t — время инкубации в мин, v — объём ферментного препарата в мл.
Инкубационная смесь состояла из 0,02 мл сыворотки крови или 0,003 мл СМЖ; 0,02 мл раствора Z-Ala-Pro-МСА или Gly-Pro-МСА (синтезированы в «НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича») в DMSO («Реахим», Россия) с концентрацией субстрата 1 мг/мл и 0,76 мл (в случае определения активности ферментов в сыворотке) или 0,75 мл (в случае определения активности ферментов в СМЖ) 0,02 М трис-HCl буфера (pH 8), содержащего по 1 мМ ЭДТА-№2, дитиотреито-ла. Остановка реакции производилась добавлением в инкубационную смесь 0,2 мл 20% уксусной кислоты [20].
Определение активности АДА в сыворотке крови проводили спектрофотометрически по изменению оптической плотности реакционной смеси, содержащей 50 мкл сыворотки крови, 100 мкл 1,4-ммолярного раствора аденозина и 3 мл фосфатного буфера (pH 7,4), при 265 нм [21]. Продолжительность инкубации реакционной смеси при температуре 37°C составляла 30 мин. Активность АДА вычисляли по формуле:
A (нмоль/мл/мин) = (ДА265/тт)/(8,1^сыворотки/Уреак-ционной смеси).
В качестве модели быстро развивающегося тяжелого ПС была выбрана модель ПС, индуцированного введением 6-ГОДА в средний переднемозговой пучок левого полушария 2-месячных крыс [22]. Для его моделирования нейро-токсин вводили в виде раствора 3 мкг/мкл в 0,02% растворе аскорбиновой кислоты объемом 4 мкл с использованием стереотаксиса в средний переднемозговой пучок левого полушария головного мозга аутбредных крыс-самцов. Ложно-оперированным крысам вводили 0,02% раствор аскорбиновой кислоты. На 35-й день после операции у наркотизированных (этаминал-натрий в дозе 40 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс брали пробы: СМЖ и сыворотку крови. В сыворотке крови крыс флуориметрически определяли активность ДПП-4 и ПЭП и спектрофотометрически — активность АДА; в СМЖ крыс флуориметрически определяли активность ДПП-4 и ПЭП по описанным выше методикам.
Статистическая обработка проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро—Уилка с последующей оценкой равенства дисперсий по критерию Левена. В случае нормального распределения в экспериментальных группах и соблюдения межгруппового равенства дисперсий дальнейшую обработку проводили с помощью метода параметрической статистики /-критерия Стьюдента. При отсутствии нормального распределения в экспериментальных группах либо при несоблюдении межгруппового равенства дисперсий дальнейшую обработку проводили с помощью метода непараметрической статистики Манна—Уитни. Результаты в таблицах представлены в зависимости от использования параметрических или непараметрических методов анализа: в случае применения параметрической статистики — как среднее ± ошибка среднего — Mean ± SEM; в случае анализа непараметрическими методами — как медиана, 25 ^ 75% . Различия между группами считали достоверными приp < 0,05; в случае, когда при статистическом сравнении групп р-уровень значимости превышал значение 0,05, но был ниже значения 0,1 (т. е. 0,05 <р < 0,1), делали заключение о статистической тенденции различий показателей этих групп.
результаты и обсуждение
Системное семидневное введение ротенона в дозе 2,75 мг/ кг 4-месячным крысам приводило к формированию экспериментальной патологии, при которой развивалась олигокине-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
Активность дипептидилпептидазы-IV, пролилэндопептидазы и аденозиндезаминазы в сыворотке крови крыс с паркинсоническим синдромом, вызванным 7-дневным системным введением ротенона
Группа Активность ферментов в сыворотке крови, нмоль/мл/мин
дипепти- пролилэн- аденозиндезами-
дилпептидаза-IV допептидаза наза
Контроль, n = 6 34,12 ± 1,24 0,46 ± 0,04 0,0072 ± 0,0011
Ротенон, n = 8 33,26 ± 1,36 0,67 ± 0,07* 0,0046 ± 0,0006*
Примечание. * — р < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем контрольной группы, /-критерий Стьюдента.
зия, постуральная неустойчивость, моторный дефицит, наблюдались отрицательная динамика массы тела и гибель 50% животных в группе. У выживших к 20-му дню опыта крыс с индуцированным ротеноном ПС была зарегистрирована достоверно повышенная активность ПЭП сыворотки крови на 45,7% относительно животных контрольной группы (табл. 1). Известно, что одной из функций ПЭП является участие в накоплении а-синуклеина [23]. Поэтому можно полагать, что повышенная активность ПЭП в сыворотке крови животных с индуцированным ротеноном ПС влияет на характерную для этой модели аккумуляцию а-синуклеина в ЦНС. Однако при оценке активности фермента в СМЖ подобного зарегистрированному в сыворотке крови животных с ПС повышения активности ПЭП не наблюдалось: активность ПЭП в СМЖ в контрольной группе и группе крыс с ПС была одинакова (табл. 2).
Показатели активности ДПП-4 в сыворотке крови крыс с ПС и животных контрольной группы не отличались между собой (см. табл. 1). При этом в СМЖ крыс с индуцированным ротеноном ПС было обнаружено достоверное повышение активности ДПП-4 на 72,5% относительно показателя контрольной группы (см. табл. 2). Это согласуется с результатами зарубежного исследования, свидетельствующего о повышенном содержании ДПП-4 в стриатуме крыс с экспериментальным ПС, индуцированным субхроническим подкожным введением ротенона [24].
Уровень активности фермента обмена нуклеотидов АДА в сыворотке крови животных с патологией достоверно снижался на 36,1% по сравнению с контрольными крысами (см. табл. 1).
Индуцированный унилатеральным введением 6-ГОДА в средний переднемозговой пучок левого полушария крыс развернутый гемипаркинсонический синдром проявлялся выраженной акинезией передней конечности, контралатеральной стороне повреждения, и прогрессивно нарастающей на про-
Таблица 2
Активность ферментов дипептидилпептидазы-iV и пролилэндопептидазы в спинномозговой жидкости крыс с паркинсоническим синдромом, индуцированным 7-дневным системным введением ротенона
Группа Активность ферментов в спинномозговой жидкости, нмоль/мл/мин
дипептидилпептидаза-IV пролилэндопептидаза
Контроль, n = 6 0,40 0,256 ± 0,013
0,39 + 0,42
Ротенон, n = 8 0,69* 0,256 ± 0,011
0,53 + 0,77
Таблица 3
Активность дипептидилпептидазы-iV, пролилэндопептидазы и аденозиндезаминазы в сыворотке крови крыс с гемипаркин-соническим синдромом, индуцированным унилатеральным введением 6-гидроксидофамина в средний переднемозговой пучок левого полушария крыс
Группа
Активность ферментов в сыворотке крови, нмоль/мл/мин
дипептидил-пептидаза-IV
пролилэндо-пептидаза
аденозиндезами-наза
Ложноопериро-ванные, n = 5
6-гидрокси-дофамин, n = 6
16,75 16,0 + 18,5
21,15* 18,2 + 21,4
0,57 0,55 + 0,59
0,47 0,42 + 0,63
0,0110 0,0075 + 0,015
0,0065** 0,0005 + 0,0007
Примечание. * — р < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем группы ложнооперированных животных, критерий Манна—Уитни; ** — р < 0,01 по сравнению с соответствующим показателем группы ложнооперированных животных, критерий Манна—Уитни.
тяжении 3 нед тестирования длительностью каталептогенно-го состояния животных. В сыворотке крови крыс с тяжёлым гемипаркинсонизмом достоверно повышалась активность ДПП-4 на 26,3% по сравнению с ложнооперированными животными (табл. 3). В СМЖ крыс с гемипаркинсоническим синдромом, напротив, наблюдалась тенденция к снижению (р < 0,1) активности ДПП-4 относительно группы ложнооперированных животных, составлявшая 9,5% (табл. 4).
Зарегистрированные значения активности ПЭП в сыворотке крови и СМЖ крыс с развернутым гемипаркинсони-ческим синдромом, вызванным унилатеральным введением 6-ГОДА в средний переднемозговой пучок левого полушария, не отличались от соответствующих значений в группе ложнооперированных животных (см. табл. 3, 4).
Активность АДА у крыс с ПС, вызванным 6-ГОДА, как и при индуцированной ротеноном экспериментальной патологии, уменьшалась. Однако индуцированное 6-ГОДА снижение активности АДА вследствие меньшего количества животных в группе при большем разбросе зарегистрированных показателей носило характер тенденции (р < 0,1) и составляло 40,9% относительно параметра группы ложнооперирован-ных крыс (см. табл. 3).
Таким образом, у крыс с экспериментальным ПС разной степени тяжести изменялась активность ферментов обмена пептидов (ДПП-4, ПЭП) и нуклеотидов (АДА). При индуцированном ротеноном ПС в сыворотке крови животных повы-
Таблица 4
Активность дипептидилпептидазы-1У и пролилэндопептидазы в спинномозговой жидкости крыс с гемипаркинсоническим синдромом, индуцированным унилатеральным введением 6-гидроксидофамина в средний переднемозговой пучок левого полушария крыс
Группа
Активность ферментов в спинномозговой жидкости, нмоль/мл/мин
дипептидилпептидаза-
Iv
пролилэндопепти-даза
Ложнооперированные,
n = 5
6-гидроксидофамин, n = 6
4,2 4,2 + 4,3 3,8* 3,8 + 4
0,9 0,33 + 1,85
0,75 0,16 + 2,5
П р и м е ч а н и е . * — р < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем контрольной группы, критерий Манна—Уитни.
Примечание. * — р < 0,01 по сравнению с соответствующим показателем группы ложнооперированных животных, критерий Манна—Уитни.
шалась активность ПЭП, а в СМЖ увеличивалась активность ДПП-4. У крыс с моделью более тяжёлого экспериментального ПС, вызванного введением 6-ГОДА в средний переднемозго-вой пучок левого полушария, активность ДПП-4 повышалась только в сыворотке крови. При увеличении активности ДПП-4 наблюдаются изменения концентрации провоспалительных цитокинов, хемокинов и нейропептидов [14—16], а повышенная активность ПЭП способствует хронизации воспалительного процесса [13]. При сопоставлении активности ферментов обмена пептидов в СМЖ животных с разными моделями ПС отмечено, что абсолютные значения активности ПЭП и особенно ДПП-4 выше в СМЖ крыс, которым осуществлялось внутримозговое введение нейротоксина 6-ГОДА или растворителя, что может быть связано с повреждением головного мозга при стереотаксической операции (см. табл. 2, 4).
Активность АДА в сыворотке крови крыс как с индуцированным ротеноном, так и 6-ГОДА ПС была понижена. При снижении активности АДА увеличивается концентрация аденозина, избыток которого может привести как к иммуносупрессии [18], так и к нарушению аденозинерги-ческой нейромодуляции, которое может являться одним из звеньев в формировании нейродегенеративного процесса, так как аденозиновые А2А-рецепторы солокализованы с D2-рецепторами и проявляют с ними функциональный антагонизм [25—28].
Наблюдаемые изменения активности ферментов обмена пептидов в сыворотке крови и СМЖ и фермента обмена пуринов в сыворотке крови животных с экспериментальным ПС, вызванным как системным, так и внутримозговым введением нейротоксинов, свидетельствуют об участии про-линспецифических протеиназ и АДА, которые играют роль в формировании воспалительного процесса, в развитии экспериментальной нейродегенеративной патологии, что представляет интерес для дальнейшего изучения.
Быводы
У крыс с экспериментальным паркинсоническим синдромом, индуцированным системным 7-дневным введением пестицида ротенона в дозе 2,75 мг/кг, достоверно повышается активность пролилэндопептидазы в сыворотке крови и дипептидилпептидазы-^ в спинномозговой жидкости.
При тяжелом, быстро развившемся экспериментальном паркинсоническом синдроме, вызванном введением 12 мкг 6-гидроксидофамина в средний переднемозговой пучок левого полушария крыс, наблюдается достоверное повышение активности дипептидилпептидазы-^ в сыворотке крови при тенденции к снижению активности этого фермента в спинномозговой жидкости.
У животных с паркинсоническим синдромом, индуцированным как системным введением нейротоксина ро-тенона, так и внутримозговым введением нейротоксина 6-гидроксидофамина, снижается активность фермента аде-нозиндезаминазы.
Обнаруженные изменения активности пролинспецифиче-ских протеиназ и аденозиндезаминазы у крыс с паркинсониче-ским синдромом свидетельствуют об участии этих ферментов в развитии экспериментальной нейродегенеративной патологии, что представляет интерес для дальнейшего изучения.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
6. Таллерова А.В., Иванова Е.А., Капица И.Г., Коваленко Л.П., Вальдман Е.А., Воронина Т.А. Влияние противопаркинсониче-ского препарата гимантана на уровень цитокинов в эксперименте. Иммунология. 2013; 34(5): 254—7. 20. Золотов Н.Н., Кутепова О.А., Воронина Т.А., Позднев В.Ф.,
ORIGINAL ARTICLE
Смирнов Л.Д., Дюмаев К.М. О возможном участии пептидаз мозга в регуляции функции памяти при старении. ДАН СССР. 1991; 317(1): 234—7.
references
1. Shaftell S.S., Griffin W.S.T., O'Banion M.K. The role of interleu-kin-1 in neuroinflammation and Alzheimer disease: an evolving perspective. J. Neuroinflammation. 2008; 5: 7: doi:10.1186/1742-2094-5-7.
2. WeeYong V. Inflammation in neurological disorders: a help or ahin-drance? Neuroscientist. 2010; 16(4): 408—20.
3. Molina-Holgado E., Molina-Holgado F. Mending the broken brain: neuroimmune interactions in neurogenesis. J. Neurochem. 2010; 114(5): 1277—90.
4. Fuster-Matanzo A., Llorens-Martin M., Hernandez F., Avila J. Role neuroinflammation in adult neurogenesis and Alzheimer disease: therapeutic approaches. Mediators inflamm. 2013: ID 260925.
5. Phani S., Loike J.D., Przeborski S. Neurodegeneration and inflammation in Parkinson desease. Parkinsonism Relat Disord. 2012; 18: S207-9.
6. Tallerova A.V., Ivanova E.A., Kapitsa I.G., Kovalenko L.P., Val'dman E.A., Voronona T.A. Influence of antiparkinsonian drug heantane on the level of cytokines in experimental models. Immunologiya. 2013; 34(5): 254—7. (in Russian)
7. Fleischer B. CD26: a surface protease involved in T-cell activation. Immunol Today. 1994; 15(4): 180—4.
8. Gorrel M.D. Dipeptidyl peptidase IV and related enzymes in cell biology and liver disorders. Clin. Sci. (Lond). 2005; 108(4): 277—92.
9. Mannisto P.T., Venalainen J., Jalkanen A., García-Horsman J.A. Pro-lyl oligopeptidase: a potential target for the treatment of cognitive disorders. Drug News Perspect. 2007; 20: 293—305.
10. García-Horsman J.A., Mannisto P.T., Venalainen J.I. On the role of prolyl oligopeptidase in health and disease. Neuropeptides. 2007; 41: 1—24.
11. Tenorio-Laranga J., Peltonen I., Keskitalo S., Duran-Torres G., Nat-arajan R., Mannisto P.T. et al. Alteration of prolyl oligopeptidase and activated a-2-macroglobulin in multiple sclerosis subtypes and in the clinically isolated syndrome. Biochem. Pharmacol. 2013; 85(12): 1783—94.
12. Penttinen A., Tenorio-Laranga J., Siikanen A., Morawski M., Rossner S., García-Horsman J.A. Prolyl oligopeptidase: a rising star on the stage of neuroinflammation research. CNS Neurol. Disord. Drug. Targets. 2011; 10: 340—8.
13. O'Reilly P.J., Hardison M.T., Jackson P.L., Xu X., Snelgrove R.J., Gaggar A. et al. Neutrophils contain prolyl endopeptidase and generate the chemotactic peptide, PGP, from collagen. J. Neuroimmunol. 2009; 217(1-2): 51—4.
14. Kahne T., Lendeckel U., Wrenger S., Neubert K., Ansorge S., Reinhold D. Dipeptidyl peptidase IV: a cell surface peptidase involved in regulating T cell growth (review). Int. J. Mol. Med. 1999; 4(1): 3—15.
15. Lambeir M., Durinx C., Scharpe S., De Meester I. Dipeptidyl-pep-tidase IV from bench to bedside: an update on structural properties, functions, and clinical aspects of the enzyme DPP IV. Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2003; 40(3): 209—14.
16. Ansorge S., Reinhold D. Immune peptides related to dipeptidylam-inopeptidase IV/CD26. In: Kastin A.J., ed. The handbook of biologically active peptides. Amsterdam: Academic Press; 2006: 567—72.
17. Yamada Y., Jang J.H., De Meester I., Baerts L., Vliegen G., Inci I. et al. CD26 costimulatory blockade improves lung allograft rejection and is associated with enhanced interleukin-10 expression. J. Heart Lung Transplant. 2016; 35(4): 508—17.
18. Parish S.T., Kim S., Sekhon R.K., Wu J.E, Kawakatsu Y., Effros R.B. Adenosine deaminase modulation of telomerase activity and replica-tive senescence in human CD8 T lymphocytes. J. Immunol. 2010; 184(6): 2847—54.
19. Cannon J.R., Tapias V.M., Na Hye Mee, Honick A.S., Drolet R.E., Greenamyre J.T. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 2009; 34(2): 279—90.
20. Zolotov N.N., Kutenova O.A., Voronina T.A., Pozdnev V.F., Smirnov L.D., Diumaev K.M. The possible participation of brain peptidases in regulating the memory function during aging. Dokl. Akad. Nauk SSSR. 1991; 317(1): 234—7. (in Russian)
21. Kaplan N.O., Colowick S.P., Ciotti M.M. Enzymatic deamination of adenosine derivatives. J. Biol. Chem. 1952; 194: 579—91.
22. Duty S., Jenner P. Animal models of Parkinson's disease: a source of
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
novel treatments and clues to the cause of the disease. Br. J.. Pharmacol. 2011; 164: 1357—91.
23. Myöhänen T.T., Hannula M.J., Van Elzen R., Gerard M., Van Der Veken P., Garcia-Horsman J.A. et al. A prolyl oligopeptidase inhibitor, KYP-2047, reduces a-synuclein protein levels and aggregates in cellular and animal models of Parkinson's disease. Br. J. Pharmacol. 2012; 166(3): 1097—113.
24. Nassar N.N., Al-Shorbagy M.Y., Arab H.H., Abdallach D.M. Saxa-gliptin: A novel antiparkinsonian approach. Neuropharmacol. 2015; 89: 308—17.
25. Ferre S., Herrera-Marschitz M., Grabowska-Anden M., Ungerstedt U., Casas M., Anden N.E. Postsynaptic dopamine/adenosine interaction: I.
Adenosine analogues inhibit dopamine D2-mediated behaviour in short-term reserpinized mice. Eur. J. Pharmacol. 1991; 192(1): 25—30.
26. Richardson P. J., Gubitz A.K., Freeman T.C., Dixon A.K. Adenosine receptor antagonists and Parkinson's disease: actions of the A2A receptor in the striatum. Adv. Neurol. 1999; 80: 111—9.
27. Schwarzschild M.A., Agnati L., Fuxe K., Chen J.F., Morelli M. Targeting adenosine A2A receptorsin Parkinson's disease. Trends Neu-rosci. 2006; 29(11): 647—54.
28. Boison D. Modulators of Nucleoside Metabolism in the Therapy of Brain. Curr. Top. Med. Chem. 2011; 11(8): 1068—86.
Поступила 25.03.17 Принята в печать 14.04.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.379-008.61-092:612.119]-092.9
Орловская И.А.1, Топоркова Л.Б.1, Феофанова НА.1, Бажан Н.М.2
РОЛЬ КОСТНОМОЗГОВОГО ГЕМОПОЭЗА В ФОРМИРОВАНИИ ВОСПАЛЕНИЯ У МЫШЕЙ С МЕЛАНОКОРТИНОВЫМ ОЖИРЕНИЕМ (ДИАБЕТ 2-го ТИПА)
1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, Новосибирск, Россия;
2 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук», Новосибирск; Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, Россия
Вовлечение ранних гемопоэтических предшественников в патогенез воспалительных заболеваний обусловлено способностью гемопоэтической стволовой клетки (ГСК) прямо и немедленно отвечать на воспалительные сигналы активацией пролиферации, дифференцировки и миграции. Воспалительная природа диабета 2-го типа (Д2) характеризуется рядом иммунных механизмов. У людей среди других форм монолокусного ожирения наиболее часто встречается меланокортиновое (МК) ожирение. Удобной моделью для изучения МК ожирения служат мыши с мутацией Yellow в локусе агути (Ау/а мыши), которая снижает активность МК-рецепторов во всех клетках организма; с возрастом у Ау/а мышей развивается ожирение и Д2. В настоящей работе исследовался костномозговой гемопоэз в динамике формирования ожирения и Д2 у Ау/а мышей: до развития ожирения (10 нед), при умеренном ожирении (15 нед) и при развитом ожирении и Д2 (30 нед). На фоне развитого ожирения (30 нед) у Ау/а мышей был повышен объём популяции ранних (КОЕ-ГЭмМ) предшественников, что может свидетельствовать об увеличении пролиферативной активности ГСК и задержке мобилизации ГСК. Уже в возрасте 10 нед у Ау/а мышей было обнаружено повышенное относительно контрольных мышей количество эритроидных колоний (БОЕ-Э + КОЕ-Э) и усиление гранулоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГМ) направления дифференцировки ГСК. Полученные данные могут свидетельствовать о формировании блока эритроидной дифференцировки и воспалительного статуса у Ау/а мышей задолго до ожирения и Д2.
Ключевые слова: костномозговой гемопоэз; воспаление; A мыши.
Для цитирования: Орловская И.А., Топоркова Л.Б., Феофанова Н.А., Бажан Н.М. Роль костномозгового гемопоэза в формировании воспаления у мышей с меланокортиновым ожирением (диабет 2-го типа). Иммунология. 2017; 38(4): 218-223. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-4-218-223
Orlovskaya I.A.1, Toporkova L.B.1, Feofanova N.A.1, Bazhan N.M.2
ROLE OF BONE MARROW HEMATOPOIESIS IN THE ONSET OF INFLAMMATION IN MICE WITH MELANOCORTIN OBESITY (TYPE 2 DIABETES)
1 Federal State Budgetary Institution «Research Institute of Basic and Clinical Immunology», Novosibirsk, Russian Federation;
2 Federal State Budget Scientific Institution «The Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences» (Laboratory of physiological genetics), Novosibirsk State University, Russian Federation
Hematopoietic stem cells (HSCs) directly and immediately respond to inflammatory signals by activation of proliferation, differentiation and migration, therefore early hematopoietic progenitors become involved in the pathogenesis of inflammatory diseases. The inflammatory nature of D2T is characterized by a number of immune mechanisms. In humans, among other forms of monolocus obesity, melanocortin-dependent obesity is the most common form. Animal model for studying melanocortin-dependent obesity is mouse strain with heterozygous mutation yellow at the agouti locus (Ay/a mice). Due to this mutation melanocortin receptors activity is constitutively reduced, Ay/a mice are prone to the development of obesity and DT2 at certain age. In present study we investigated bone marrow hematopoiesis during development of obesity and DT2 in Ay/a mice at age 10 weeks (no obesity), 15 weeks (moderate obesity), and 30 weeks (manifestation of obesity and DT2). At 30 weeks, in Ay/a mice the number of early (CFU-GEMM) progenitors was increased, which may occur due to enhanced proliferative
Для корреспонденции: Орловская Ирина Анатольевна, д-р мед. наук, профессор, руководитель лаб. иммунобиологии стволовой клетки, E-mail: irorl@mail.ru
