Активность NO-синтазы у больных артериальной гипертензией с сопутствующим ожирением Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© Демиденко A.B. УДК 616.12-008.331.1-098

АКТИВНОСТЬ NO-СИНТАЗЫ У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ С СОПУТСТВУЮЩИМ ОЖИРЕНИЕМ

Демиденко A.B.

Харьковский государственный медицинский университет, г. Харьков

При досл1джент показнитв синтезу та метаболизму оксида азоту встановлено тдвищення pie-ня Б-ттрозотюлу. Hайбiльшi показники встановлет в групах з АГ та ожиртням 2 та 3 ст. (0,45±0,11 мМоль/л и 0,45±0,04 мМоль/л). При ствставленш показнитв активностi eNOS практично незмтний синтез спостерйався в груш хворих з АГ та ожиртням 1 ст. - 0,769± 0,119 пмоль/хв * мг быка, у хворих з АГ та нормальною вагою тыа та з надмipною -пдвищений синтез N0, (0,821± 0,145 и - 0,820± 0,138 пмоль/хв * мг быка). Зниження активност1 eNOS - в группах з АГ та ожиртням 2 и 3 ст. (0,737± 0,111 и 0,683± 0,145 пмоль/хв * мг быка). Найбыбша активащя iNOS спостерйалась в групах гiпеpтоникiв з нормальною масою тыа та надмipною (0,601± 0,084 и 0,609± 0,117 пмоль/хв * мг быка). В групах з 1, 2 та 3 ст. ожиртня також вiдмiчалась надмipна активащя iNOS (0,587± 0,091, 0,560± 0,081, 0,527± 0,103 пмоль/хв * мг быка). У хворих на аpтеpiальну гiпеpтензiю з нормальною та надмipною вагою тыа спостерйалась експреЫя ендотелиальног NO-синтази, що повязано з компенсаторними механизмами. Зниження активностi eNO-синтази в групах хворих на АГ з ожиртням 2 та З ст. свiдчить об ендотелiальнiй дисфункщг. У хворих на АГ з супуттм ожиртням спостерйа-еться активащя окислювального метаболизму Ь-аргтта iз змтенням спiввiдношення активно-стi iзофоpм NO-синтаз у плазмi аpтеpiальног кpовi у бт превалюванням iNO-синтази. Пiв-ищення S-штрозотюлу в nлазмi кpовi свiдчить про стан оксидантного стресу, тдвищенном piвнi выьних pадикалiв та зниженш бiодостуnностi оксида азоту.

Ключов1 слова: артер1альна ппертенз1я, пщвищена масатта, оксид азоту, NO-синтаза, ендотелиальна дисфункця, антиоксидантна система.

Эндотелий - высокоактивный эндокринный орган, обеспечивающий регуляцию тонуса сосудов, процессов гипертрофии и пролиферации гладко мышечных клеток, модуляцию свертывания крови и фибриноли-за, а также процессы воспаления [1]. Эндотелий сосудов является основным "органом-мишенью" при артериальной гипертензии с сопутствующим ожирением [2]. Проблема метаболического синдрома и артериальной гипертензии стала актуальной в последнее время, в связи с проведением ряда исследований, которые показали тесную взаимосвязь между артериальной гипертензией и компонентами метаболического синдрома, а так же, в связи с широким распространением метаболического синдрома [3,4] В настоящее время известно, что из большого числа биологически активных веществ, секретируемых эндотелием, именно оксид азота (N0) регулирует активность других медиаторов и дисфункция эндотелия, возникающая при артериальной гипертензии, связана со снижением синтеза или биодоступности N0 [5,6]. Метаболическая активность N0 модулирует окисление липидов плазмы, деградацию циркулирующих катехоламинов и кининов, и тем самым, вовлекается в процесс регуляции процесса атерогенеза [7]. Установлено, что специфическая инактивация эндотели-альной NO-синтазы сопровождается повышением систолического артериального давления на 15-20 мм рт.ст [8]. Хроническое ингибирование NO-синтазы в эксперименте приводит к атеросклерозу и поражению органов-мишеней [9]. Доказано, что увеличение вазо-констрикторных простагландинов и свободных радикалов приводит к снижению активности NO [10].

Оксид азота синтезируется в организме ферментативным путем при участии NO-синтазы (NOS) и ряда кофакторов, путем окисления терминального атома азота гуанидина в L-аргинине под каталитиче-

ским влиянием Са/капьмодулин-зависимой изоформы фермента NO-cинтaзы с образованием L-цитpyллинa и N0 [11]. L-apгинин является так же субстратом для аргиназы, осуществляющей неокислительный гидролиз с образованием L-opнитинa и мочевины. Вследствие декарбоксилирования из L-opнитинa образуется путресцин - предшественник синтеза полиаминов, которые являются мощными факторами роста и пролиферации. Их содержание отражает интенсивность протекания в организме катаболических процессов. Таким образом L-apгинин - субстрат для двух ферментативных реакций ^0-синтазной и аргиназной), которые соответственно конкурируют за субстрат.

Цель исследования: исследование синтеза и метаболизма оксида азота на основании оценки активности эндотелиальной и индуцибельной N0-cинтaз и определения S-нитpoзoтиoлa в плазме крови.

Материалы и методы исследования

Обследовано 83 пациента с артериальной гипертензией и избыточной массой тела. Мужчин - 30, женщин - 53. Средний возраст - 51 ±11 лет. Длительность артериальной гипертензии: до 5 лет - 25 пациентов, 5-10 лет - 35, больше 10 лет - 23. Контрольную группу составили 20 практически здоровых людей, сопоставимых по полу и возрасту. Вычислялся индекс массы тела (ИМТ - вес(кг)/рост2 (м)). Больные разделены на группы. 1 группа - больные с артериальной гипертензией и нормальным весом (п=20), 2 группа -пациенты с AГ и предожирением (п=17), 3 группа -больные с АГ и ожирением 1 степени (п=18), 4 группа -пациенты с АГ и ожирением 2 степени (п=15), 5 группа - больные с АГ и ожирением 3 степени (п=13). В исследование не включали пациентов с сахарным диабетом, распространенным атеросклерозом, пороками сердца, хроническими и обструктивными болез-

нями легких, застойной сердечной недостаточностью, хроническими заболеваниями печени и почек, с онкологическими и инфекционными заболеваниями.

Активность NO-синтазы определялась биохимическим методом. Суммарную активность NOS оценивали по количеству образованного после инкубации нитрит-аниона методом Грина с помощью реактива Грисса [12]. Состав инкубационной смеси (1мл) содержал 50mM KH2PO4 (рН = 7,0), 1mM MgCl2, 2mM CaCl2, 1mM NADPH, 2mM L-аргинина и 0,2мл пробы. Для определения iNOS, учитывая кальцийнезависи-мую активность, в инкубационную смесь вместо CaCl2 добавляли 4mM EDTA. Активность eNOS определяли как разницу активности суммарной NOS и iNOS. Содержание белка определяли унифицированным методом по биуретовой реакции [13]. Уровень S-нитрозотиола определяли в плазме крови флюоро-метрическим методом [14]. С целью исключения влияния медикаментозной коррекции АД на систему генерации N0, забор крови для исследования проводился в первые дни пребывания пациентов в стационаре, т.е. до назначения плановой антигипертензив-ной терапии. При этом, все больные находились в условиях одинаковой двигательной активности и не принимали нитратсодержащих препаратов.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0 for Windows. Исследуемые величины представлены в следующем виде: выборочное среднее значение±стандартное отклонение среднего значения. При проверке статистических гипотез нулевую гипотезу отбрасывали при уровне значимости менее 0,05. Корреляционный анализ в случае нормального распределения данных

проводился с использованием коэффициента корреляции Пирсона (г), в случае несоответствия нормальному распределению - с определением величины ранговой корреляции Спирмена (К).

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе синтеза оксида азота в различных по возрасту группах, нами не установлено существенных различий в активности еМОБ и ¡N08, а так же уровня Б-нитрозотиола (8-нитрозотиол- 0,42±0,20 мМоль/л, е-МОБ 0,761 ±0,130 пмоль/мин * мг белка, ¡-N08 0,565±0,093 пмоль/мин * мг белка) у пациентов зрелого возраста (30-59 лет) против (8-нитрозотиол-0,38±0,19 мМ/л, е-МОБ - 0,675±0,098 пмоль/мин * мг белка, ¡-N08 0,547±0,112 пмоль/мин * мг белка) в группе больных пожилого возраста (>60 лет); р1-2>0,05), но следует отметить тенденцию к снижению активности эндотелиальной МО-синтазы с возрастом.

При оценке показателей синтеза и метаболизма оксида азота в целом в выборке пациентов нами установлено повышение уровня Б-нитрозотиола -0,42±0,21 мМоль/л, а также активности ¡МОБ (0,572±0,122 пмоль/мин * мг белка) в сравнении с группой контроля (0,22± 0,04 мМоль/л и 0,191 ± 0,064 пмоль/мин * мг белка соответственно), (р-|-2<0,001). При сравнении активности еМОБ в группе пациентов с АГ в целом и в группе контроля, достоверные различия не найдены, 0,768±0,120 пмоль/мин * мг белка и 0,779± 0,040 пмоль/мин * мг белка соответственно, р1-2>0,05.

Результаты определения Б-нитрозотиола, а также активности еМОБ и ¡МОБ у больных с АГ в зависимости от степени ожирения представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительная характеристика показателей синтеза и метаболизма оксида азота у больных АГ с различной степенью ожирения и у пациентов контрольной группы (М±3й)

Группы Показатели Контрольная группа (n=20) Больные АГ (n=83)

n и > АГ з предожирением (n=17) АГ з ожирением 1 ст. (n=18) АГ з ожирением 2 ст. (n=15) АГ з ожирением 3 ст. (n=13)

S-нитрозотиол, мМоль/л 0,22± 0,04 0,42± 0,16" 0,42± 0,17" 0,41± 0,16" 0,45± 0,11" 0,45± 0,04"

e-NOS, пмоль/мин* мг белка 0,779± 0,040 0,821± 0,145 0,820± 0,138 0,769± 0,119 0,737± 0,111 0,683± 0,145*

i-NOS, пмоль/мин* мг белка 0,191± 0,064 0,601±0,084" 0,609± 0,117" 0,587± 0,091" 0,560± 0,081" 0,527± 0,103"

Примечание: статистическая достоверность отличий между группой с АГ и контрольной: * - р<0,05; ** - р<0,01; - р<0,001.

Анализируя показатели синтеза и метаболизма оксида азота в группах с АГ и различной степенью ожирения, нами выявлено, что в группе больных АГ с нормальной массой тела и предожирением уровень Б-нитрозотиола составлял - 0,42±0,16 мМоль/л и -0,42±0,17 мМоль/л соответственно, в группах с АГ и ожирением 1 ст. - 0,41 ±0,16 мМоль/л, а наиболее высокие показатели выявлены в группах с АГ и ожирением 2 и 3 степени (0,45±0,11 мМоль/л и 0,45±0,04 мМоль/л соответственно).

Это связано с тем, что в организме МО может связываться в относительно стабильные соединения и депонироваться в клетках или транспортироваться в места потребности в нем. В качестве депо МО выступают динитрозольные комплексы железа с серусо-держащими лигандами и Б-нитрозотиолы. При этом депонирование МО в сосудистой стенке начинается при каком-либо повышении его уровня в организме, независимо от причины, а высвобождение опосредовано ионами металлов, аскорбатом, тиоловыми соединениями и несколькими ферментами, например

каталазой и глутатионпероксидазой [15]. В последние годы большая роль в снижении эндотелийзависимой вазодилатации отводится оксидантному стрессу, приводящему к ускоренной инактивации N0 супероксидным анион-радикалом, в результате чего образуется пероксинитрит, который в свою очередь, может вступать с реакцию с тирозиновыми остатками белков с образованием нитротирозина и с тиолами альбумина или глутатиона, образуя S-нитрозотиолы. Таким образом, взаимодействие с тиолами может предотвратить токсические эффекты пероксинитрита, но при этом снижается биодоступность оксида азота при его неизмененном синтезе [16,17,18].

При сопоставлении показателей активности эндотелиальной NOS нами установлен практически неизмененный синтез в группе больных с АГ и ожирением 1 степени - 0,769± 0,Й9 пмоль/мин * мг белка, у пациентов с АГ и нормальной массой тела а так же с предожирением - повышенный синтез N0. Активность eNOS в этих группах составляла - 0,821± 0,145 пмоль/мин * мг белка и - 0,820± 0,138 пмоль/мин * мг белка соот-

ветственно. Снижение активности eNOS наблюдалось в группахсАГ и ожирением 2 и 3 степени (0,737± 0,111 пмоль/мин * мг белка и 0,683± 0,145 пмоль/мин * мг белка соответственно). Недостаточное образование или повышенное разрушение N0 способствует миграции и росту гладкомышечных клеток (ремоделиро-ванию сосудов), в то же время доказано, что использование экзогенного N0 (¡п уКго) и назначение L-аргинина в различных экспериментальных моделях замедляет липогенез и пролиферацию неоинтимы [19]. Кроме того, повышенная экспрессия eN0-cинтaзы в месте сосудистого поражения ослабляет пролифе-ративные процессы в интиме сосудов при гиперхоле-стеринемии [20,21,22].

Наиболее выраженная активация iN0S наблюдалась в группах больных с нормальной массой тела (0,601± 0,084 пмоль/мин * мг белка) и предожирением (0,609± 0,117 пмоль/мин * мг белка). В группах с 1-й, 2-й и 3-й ст. ожирения так же отмечалась активация iN0S (0,587± 0,091, 0,560± 0,081, 0,527± 0,103 пмоль/мин * мг белка соответственно). Существуют данные, что повышенная продукция iN0S у пациентов с АГ сопровождается выраженным ростом уровня N0 в миокарде и развитием кардиодепрессивного эффекта [23]. Механизмы, с помощью которых активация iN0s приводит к апоптозу сопровождаются предварительным увеличением количества N0, су-пероксиданиона (0-2) пероксинитрита ^N00^, которые вызывают нитацию протеинов, ингибируют синтез и повреждают ДНК, снижают ее репаративные способности, инактивируют ДНК-лигазы и оказывают депрессивное действие на кардимиоциты [24]. 0N00H считается мощным окислителем, необратимо инактивирующий рианодиновые рецепторы, что приводит к увеличению выброса Са + из саркоплазмати-ческого ретикулума кардиомиоцитов, росту уровня Са2+ в цитоплазме и нарушению дыхательной функции митохондрий, что приводит к нарущению сократительной функции миокарда [25]. Следует отметить, что наряду с отрицательными эффектами показаны и положительные эффекты активации iN0S, сопровождающиеся низкими уровнями N0 [24, 26, 27]. Положительная роль активации iN0S при заболеваниях сердечно-сосудистой системы отмечается в механизмах неспецифической защиты организма против инородных клеток, при адаптациик факторам окружающей среды и ишемическому повреждению, в антиатеро-генных, антиоксидантных, антиапоптических, противовоспалительных и цитопротекторных эффектах.

В то же время, утрата протекторных антитромбо-цитарных и антипролиферативных эффектов, связанных со снижением активности eN0s либо чрезмерной активации iN0S, могут обуславливать развитие ремоделирования сердечно-сосудистой системы у больных и возникновение ассоциированной патологии в виде атеросклероза, ишемической болезни сердца [8,9,11]. Развитие этих осложнений, наверное, является критическим моментом в поддержании и стабилизации заболевания, независимо от его этиологии, в связи с дальнейшим влиянием и прогресси-рованием эндотелиальной дисфункции и увеличения дисбаланса между N0 и вазоконстрикторами. Именно поэтому исследование функционального состояния сосудистого эндотелия и системы N0 приобретает

ведущее значение в кардиологии и требует дальнейшего изучения.

Выводы:

1. У больных артериальной гипертензией с нормальной массой тела и с предожирением выявлена экспрессия эндотелиальной NO-синтазы, что связано с включением компенсаторных механизмов.

2. Снижение активности эндотелиальной NO-синтазы в группах больных с артериальной гипертензией и ожирением 2 и 3 ст. свидетельствует об эндотелиальной дисфункции, утрате протективных свойств оксида азота.

3. У больных артериальной гипертензией с сопутствующим ожирением происходит активация окислительного метаболизма L-аргинина с изменением соотношения активности изоформ NO-синтаз в плазме артериальной крови в сторону преобладания индуци-бельной NO-синтазы.

4. Повышение количества S-нитрозотиола в плазме крови свидетельствует об оксидантном стрессе, повышенном образовании свободных радикалов и снижении биодоступности оксида азота.

Литература

1. Munzel Т., Daiber A., Ulrich V. Vascular consequences of e-NOS uncoupling for the activity and expression of soluble guanylyl cyclase and GMP-dependent protein kinase//Arterioscler. Tromb. Vase. Biol.- 2005.-Vol.25(8).-P. 1551-1557.

2. Kreutzeberg S.V., Kiwawuka E., Tiengo A. Visceral obesity is characterized by impaired oxide-independent vasodila-tion//Eur. Heart J.-2003.-№13.-254-259.

3. Naruse M., Tanabe A., Takagi S., Tago K., Takano K. Insulin resistance and vascular functioiV/Diabetes.-2000.-№58(2).-P.344-347.

4. Perticone F, Ceravolo R, Candigliota M et al. Obesity and body fat distribution induce endothelial dysfunction byoxida-tive stress: protective effect of vitamin C//Diabetes.-2001.-№50(1 ).-P. 159-165.

5. Michael Т., Gewalting P., G. Kojda. Vasoprotection by nitric oxide: mechanisms and therapeutic poten-tial//Cardiovascular Research. - 2002. -V. 55, - P. 250-260.

6. Halcox JPJ, Nour KRA, Zalos G, Quyyumi AA. Coronary Vasodilation and Improvement in Endothelial Dysfunction With Endothelin ETA Receptor Blockade. Circ Res 2001;89:969-76.

7. Bakker SJ, Ijzerman RG, Teerlink T et al. Cytosolic triglycerides and oxidative stress in central obesity: the missing link between excessive atherosclerosis, endothelial dysfunction, and beta-cell failure// Atherosclerosis. -2000. -№148. -P. 17-21.

8. Michael Т., Gewalting P., G. Kojda. Vasoprotection by nitric oxide: mechanisms and therapeutic poten-tial//Cardiovascular Research. - 2002. -V. 55,-P. 250-260.

9. Grieve D.J., MacCarthy P.A., Gall N.P. at al. Divergent Biological Actions of Coronary Endothelial Nitric Oxide During Progression of Cardiac Hypertrophy//Hypertension. -2001. - V. 38. - P. 267.

10. Stocker R., Keaney J.F. Role of oxidative modifications in aterosclerosis//Physiol. Rev.-2004.-№84(4).-P. 1381 -1478.

11. Lind L., Granstam S.O., Millgard J. Endothelium-dependent vasodilatation in hypertension: a review//Blood Pressure. -2000. - V.9. - P.4-15.

12. Степанов Ю.М., Кононов И.Н., Журбина А.И. Аргинин в медицинской практике//Журн. АМН Украины.-2004.-Т.10,№2.- С.339-351.

13. Меньшикова В.В. Лабораторные методы исследования в кпинике//М.-Медицина.-1987.- С. 174-175.

14. Goldman R., Vlessis A., Trunkey D. Nitrosotiol quantification in human plasma//Analytical Biochemistry.-1998.-№259.-P.98-103.

15. Симирин Б.В., Ванин А.Ф., Малышев И.Ю. Депонирование оксида азота в кровеносных сосудах in vivo //Бюлл. экспер. биол. и мед. -1999. -№127(6). - С.629-632.

16. Недоспасов А. А. Биогенный N0 в конкурентных отношениях //Биохимия. - 1988 - Т.63. - Вып.7. - С.881-905.

17. Реутов В.П. Медико-биологические аспекты циклов оксида азота и супероксидного анион-радикала//Вестник Российской АМН. - 2000. №4.-С. 35-41.

18. Bouloumie A, Bauersachs J, Linz W, Scholkens BA, Wie-mer G, Fleming I, Busse R. Endothelial dysfunction coincides with an enhanced nitric oxide synthase expression and superoxide anion production//Hypertension. -1997.-V. 30. - P. 934-941.

19. Rakhit R. D., Marber M. S. Nitric oxide: an emerging role in cardioprotection//Heart. - 2001. -V. 86. - P.368-372.

20. Иванова O.B., Соболева Г.Н., Карпов Ю.А. Эндотели-альная дисфункция - важный этап развития атероскле-ротического поражения сосудов (обзор литературы -1)//Тер. архив. - 1996. - №6. -С. 75-88.

21. Шебеко В.И. Родионов Ю.Я. Дисфункция эндотелия при гиперхолистеринемии и атероскперозе//Мед. новости. -1997. -№11.-С.12-17.

Summary

THE AKTIVITY NO-SYNTHASE IN HYPENTENSIVE PATIENTS WITH OBESITY Demidenko A.V.

Key words: arterial hypertension, increased body weight, nitric oxide, N0-synthase, endothelial dysfunction, antioxidant system.

It was revealed, that the level of S-nitrosotiol was statistically higher, than in control ones. The highest level was in hypertensive group with 2 and 3 stage of obesity (0,45±0,11 and 0,45±0,04 mMol/1). Normal eNOS activity was found in hypertensive patients with obesity of 1 st. 0,769± 0,119 pmol/min * mg protein, the increased NO syntesis was revesled in hypertensive patients with normal body mass and overweight (0,821± 0,145, 0,820± 0,138 pmol/min * mg protein). The decrease of eNOS activity was found in hypertensive patients with obesity of 2 and 3 st.(0,737± 0,111 и 0,683± 0,145 pmol/min * mg protein). The most highest activation of iNOS was revealed in hypertensive patients with normal body mass and overweight (0,601± 0,084 и 0,609± 0,117 pmol/min * mg protein). There was higher activity of iNOS also in hypertensive patients with obesity of 1, 2 and 3 st. (0,587± 0,091, 0,560± 0,081, 0,527± 0,103 pmol/mm * mg protein). The expression of eNOS avtivity was found in hypertensive patients with normal body mass and overweight, that can be rre-lated with compensatory mechanisms. The decrease of eNOS activity was revealed in hypertensive patients with obesity of 2 and 3 st., that have been connected with endothelial dysfunction. The oxidative metabolysm of L-arginin was estimated with changes of isoform synthase activities in the side of iNOS. S-nitrosotiol decreasing is the evidence of oxidative stress, increasing of free radicals and decreasing of NO bioavailability. Ukrainian Ministry of the Health Public Service, Kharkiv State Medical University, Kharkiv

Mamepian надшшов до редакцй 1.02.07.

22. Alexander R.W., Theodore Cooper Memorial Lecture. Hypertension and pathogenesis of atherosclerosis. Oxidative stress and the mediation of arterial inflammatory response: a new perspective//Hypertension. -1995. -V.25.-P. 155161.

23. Gunett C.A., Lund D.D., McDowell A.K. Mechanisms of iNOS-mediated vascular dysfunction//Arterioscler. Tromb. Vase. Biol.-2005.-Vol.25(8).-P.1647-1622;

24. Гарматина О.Ю., Ткаченко M.H., Мойбенко A.A. Индуци-бельная синтаза оксида азота при патологии серд-ца//Журн. АМН Украины. - 2005.-T.11.№4.-C.645-659.

25. Xu L., Eu J., Meissner G. Activation of the cardium release channel (ryanodine receptor) by poli-S-nitrosylation//Science.-1998.-279.-P.234-237.

26. Bolli R. Cardioprotective function of inducible NOS and rolr of NO in myocardial ishemia and preconditionig: an overview of a decade researcli//J.Mol.Cell.Cardiol.-2001 .-33,№ll.-P.1897-1918.

27. Moncada S., Palmer R., Higgs E. Nitric oxide:physiology, pathophysiology and pharmacology//Pharmacol.Rev.-1991 .-43.-P.109-142.