CC BY
108
УДК 577.152:582.951.4:595.768
АКТИВНОСТЬ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ «ЭСТЕРАЗЫ -ИНГИБИТОРЫ ЭСТЕРАЗ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА» В ТКАНЯХ КАРТОФЕЛЯ
© Н. Д. Шевченко*, Р. И. Ибрагимов, И. А. Шпирная,
И. А. Умаров, Р. Ф. Хамадалиев
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел. +7 (347) 273 6712.
E-mail:[email protected]
Статья посвящена исследованию активности компонентов системы «эстеразы — ингибиторы эстераз колорадского жука». Показано, что экстракты тканей личинок и имаго колорадского жука, листьев и клубней картофеля обладают эстеразной активностью. Установлено, что клубни и листья различных сортов и гибридов картофеля содержат ингибиторы, подавляющие активность эстераз колорадского жука. Показатели активности ингибиторов эстераз в тканях растений могут служить в качестве критерия их устойчивости к фитофагам.
Ключевые слова: эстеразы, ингибиторы, картофель, колорадский жук, устойчивость растений.
Гидролитическим ферментам и их ингибиторам принадлежит весьма важная роль во взаимоотношениях фитофагов и растений. В процессе коэволюции с растениями, насекомые-фитофаги сформировали набор пищеварительных гидролаз, обеспечивающих усвоение питательных веществ из определенных видов растений и их отдельных органов, тканей. В свою очередь, у растений сформировались защитные механизмы, подавляющие обменные процессы вредителей, и обеспечивающие таким образом их устойчивость. К числу таких защитных агентов относятся и ингибиторы, подавляющие активность экзогенных гидролитических ферментов [1, 2]. С этих позиций, наиболее изученными являются протеиназы и амилазы насекомых-вредителей [3, 4]. Важную роль во взаимодействиях растений и насекомых выполняют и другие гидролитические ферменты, в частности эстеразы, расщепляющие сложноэфирные связи в органических соединениях. Сведения о функционировании эсте-раз насекомых и их ингибиторов из растений пока немногочисленны [5-9]. В связи с этим, нами исследована активность компонентов комплекса «эстеразы - ингибиторы эстераз» в тканях картофеля и колорадского жука.
Материалы и методы
Источниками эстераз и их ингибиторов служили личинки колорадского жука (Leptinotarsa de-cemlineata Say), клубни и листья трехнедельных проростков картофеля (Solanum tuberosum L.) сортов Башкирский, Невский, Удача и экспериментальных гибридов 4292, 4281, 4407. Для экстракции белков образцы насекомых и растений заливали холодным раствором 0.05 М трис-HCl буфера, рН 8.2, в соотношении 1:1, гомогенизировали 2-3 мин.
Гомогенат выдерживали 3 ч при 4 °С. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин на центрифуге MPW-310 (Польша), в течение 10 мин. Полученный экстракт замораживали и использовали в дальнейшей работе. Активность эстераз и их ингибиторов определяли методом агарозных пластин по гидролизу субстрата твин-20, включенного в гель
агарозы [10]. Активность фермента рассчитывали по размеру площади гидролизованного участка геля вокруг лунки. За 1 единицу активности (Е) принимали такое количество фермента, которое необходимо для гидролиза субстрата на участке геля размером 1 мм2. За 1 единицу активности ингибитора (ИЕ) принимали такое его количество, которое подавляло 1Е активности фермента. Каждый опыт проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Excel пакета Microsoft Office.
Результаты и их обсуждение
В наших экспериментах показано, что в экстрактах клубней картофеля, имаго и личинок колорадского жука выявляется эстеролитическая активность. По скорости гидролиза субстрата твин-20, показатели активности насекомых и клубней картофеля сопоставимы с активностью высокоочи-щенного коммерческого препарата эстеразы из свиной печени. Наибольшая активность эстераз определялась в тканях личинок. Имаго, по сравнению с ними, обладали меньшей активностью данных ферментов (табл. 1). Как видно, замораживание насекомых при температуре -12 °С не влияет на ферментативную активность экстрактов, что позволяет сохранять экстракты длительное время.
В листьях картофеля активность эстераз нами не была обнаружена, тогда как клубни характеризовались их высокой активностью. Исследуемые ферменты насекомых и картофеля были термолабильны. Так, прогревание экстрактов при температуре 50 °С сопровождалось снижением их активности на 40-50%, а прогревание при 70 °С - приводило к полной потере ферментативной активности Экстракты клубней исследуемых сортов картофеля характеризовались различным уровнем эстеразной активности. Наибольшая активность выявлялась в клубнях картофеля сорта Луговской, наименьшая -в клубнях гибрида 4281. (рис. 1). Все сорта повторно анализировали после семи месяцев хранения.
* автор, ответственный за переписку
Таблица 1
Активность эстераз личинок и имаго колорадского жука и в тканях картофеля (сорт Луговской)
Источник эстераз
Вариант опыта
Активность эстераз, Е/ г сырой массы
Личинки 3-го возраста свежесобранные после замораживания 21.4±1.76 20.1±1.69
Личинки 4-го возраста свежесобранные после замораживания 16.4±1.44 16.0±1.53
Имаго свежесобранные 13.7±1.17
Листья картофеля - 0
Клубни картофеля - 12.65±1.05
Препарат липазы (1 мг/мл) - 65.94±4.17
Препарат эстеразы (1 мг/мл) - 51.02±5.23
Дистиллированная вода (контроль) - 0
Активность эстераз в клубнях значительно снижалась у одних сортов и практически не изменялась у других. Так, например, у сорта Невский активность эстераз, после хранения, снизилась на 45%, у сортов Башкирский и Луговской - на 25% по сравнению со свежевыкопанными клубнями (рис. 1). Интересно отметить, что эти сорта обладали наибольшей эстеразной активностью, по сравнению с другими исследованными сортами, при этом именно для них показано максимальное снижение активности при хранении. Сорт Удача и гибрид 4281 сохранили активность на прежнем уровне.
Ингибиторы эстераз в тканях картофеля.
Как известно, в клубнях картофеля в больших количествах содержатся белки, подавляющие активность экзогенных протеиназ и амилаз [4]. Для определения активности ингибиторов эстераз проводили совместную инкубацию экстрактов из тканей картофеля и личинок колорадского жука. По остаточной активности эстераз судили о степени ингибирования. В табл. 2 представлены данные об ингибировании эстераз личинок белками из листьев и клубней картофеля сорта Луговской. Как видно, экстракты листьев ингибируют активность эстераз личинок лишь на 3-5%. В клубнях картофеля активность ингибиторов эстераз была достаточна высока и составила 1.01 сырой массы.
Сорт картофеля
Рис. 1. Изменение активности эстераз в клубнях при длительном хранении
Т аблица 2
МЛТГПТлЛ %
Источник ингибиторов Т °С инкубации экстракта Активность ингибиторов эстераз, ИЕ/г сырой массы % ингибирования
25 0.2 2.9
Листья
70 0.2 2.9
25 0 0
Клубни
70 1.01 14.7
* Активность эстераз колорадского жука 6.8±0.65 Е/г сырой массы.
По-видимому, в клубнях картофеля ферменты (эстеразы) и их ингибиторы могут находиться в составе неактивных комплексов. При нагревании происходит разрушение комплекса за счет денатурации молекул термолабильных ферментов. Освобождение термостабильных ингибиторов из состава комплекса приводит к повышению ингибиторной активности экстрактов.
Активность ингибиторов эстераз колорадского жука исследовали также в клубнях и листьях различных сортов и гибридов картофеля (рис. 2). Наибольшая ингибиторная активность показана для гибрида 4407, сорта Удача и гибрида 4292, при этом у данных объектов обнаруживался наиболее низкий уровень активности ферментов. Экстракты листьев также подавляли активность эстераз колорадского жука. Исследуемые образцы значительно различались по этому показателю. Наибольшая ингибиторная активность выявлена в листьях гибридов 4292 и 4407, тогда как в листьях сорта Башкирский такая активность отсутствовала.
В сортах Луговской, Удача, гибриде 4281 активность ингибиторов эстераз клубней значительно превышает таковую в листьях. Интересно отметить, что листья гибрида 4292 полностью подавляют эс-теразную активность колорадского жука, в то время как клубни лишь на 59%.
Как показали проведенные исследования, новые гибридные формы картофеля, по сравнению с широко распространенными сортами, характеризуются значительно большим уровнем активности ингибиторов эстераз колорадского жука. Ранее было показано, что эти формы картофеля проявляют высокую устойчивость к колорадскому жуку, в частности, они характеризуются низкими показателями заселенности и пищевой привлекательности личинками насекомых [11].
Т аким образом, естественная система «эстера-зы колорадского жука - белковые ингибиторы картофеля» является удобной моделью для изучения взаимоотношений насекомых и растений с целью выяснения механизмов проявления устойчивости картофеля к колорадскому жуку.
Башкирский Луговской Невский Удача 4281 4407 4292
Сорт картофеля
Рис. 2. Активность ингибиторов эстераз в клубнях и листьев картофеля
Исследования поддержаны грантом РФФИ-Поволжье № 08-0497015р_поволжье_а Физиологобиохимические и генетические механизмы формирования и проявления устойчивости картофеля к колорадскому жуку.
ЛИТЕРАТУРА
1. Конарев Ал. В. Системы ингибиторов гидролаз у злаков -организация, функции и эволюционная изменчивость // Автореф. дисс. докт. биол. наук. М.: 1992. -38 с.
2. Яруллина Л. Г., Ибрагимов Р. С. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам. Уфа: Гилем, 2006. -228 с.
3. Ибрагимов Р. И. // Докл. Россельхозакадемии. 1997. № 2. С. 15-17.
4. Мосолов В. В., Валуева Т. А. // Прикл. биох. и микробиол. 2005. Т. 41. №3. С. 261-282.
5. Серебров В В., Алексеев А. А., Глупов В. В. // Изв. РАН. Сер. биол. 2001. Т. 28. №5. С. 588-592
6. Prabhakaran S. K., Kamble S. T. // J. Econ. Entomol. 1993. V. 86. P. 1009-1013.
7. Shiotsuki T., Kato Y. // Insect Biochem. Molec. Biol. 1996. V. 29. P. 731-736.
8. Xia Y., Dean P., Judge A. J., Gillespie J. P., Clarkson J. M., Charnley A. K. // J. Insect Pysiol. 2000. V. 46. P. 1249-1257.
9. Серебров В. В., Гербер О. Н., Малярчук А. А., Мартемьянов В. В., Алексеев А. А., Глупов В. В. // Изв. РАН. Сер. биол. 2006. Т. 34. №6. С. 712-718.
10. Шевченко Н. Д., Шпирная И. А., Ибрагимов Р. И. , Умаров И. А. // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире». Улан-Удэ, 2007. С. 398-399.
11. Ибрагимов Р. И., Умаров И. А., Шпирная И. А., Мардан-шин И. С. // Пищевая активность колорадского жука на различных сортах картофеля. Сборник Ч. 1 «Вавиловские чтения-2008», СГАУ. С. 136-137.
Поступила в редакцию 01.10.2008 г. После доработки — 07.11.2008 г.
