Научная статья на тему 'Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля'

Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
325
71
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ПЕКТИНАЗЫ / ЦЕЛЛЮЛАЗЫ / ИНГИБИТОРЫ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ / КОЛОРАДСКИЙ ЖУК / КАРТОФЕЛЬ

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Шевченко Н. Д., Шпирная И. А., Саляхова А. Ф., Цветков В. О., Марданшин И. С.

Одним из механизмов защиты растений от стрессовых воздействий является их способ5 ность подавлять активность гидролитических ферментов фитопатогенных организмов. Статья посвящена исследованию активности ингибиторов пектинолитических и целлюлолитических ферментов Leptinotarsa decemlineata из тканей картофеля. Установлено, что клубни и листья раз5 личных сортов и гибридов картофеля содержат ингибиторы, подавляющие активность гидролаз колорадского жука. Показатели активности ингибиторов целлюлаз и пектиназ в тканях растений могут служить в качестве критерия их устойчивости к фитофагам.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Шевченко Н. Д., Шпирная И. А., Саляхова А. Ф., Цветков В. О., Марданшин И. С.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля»

Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О., Марданшин И.С., Ибрагимов Р.И.

Башкирский государственный университет, г.Уфа

АКТИВНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ, ПЕКТИНАЗ В КЛУБНЯХ И ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ

Одним из механизмов защиты растений от стрессовых воздействий является их способность подавлять активность гидролитических ферментов фитопатогенных организмов. Статья посвящена исследованию активности ингибиторов пектинолитических и целлюлолитических ферментов Leptinotarsa decemlineata из тканей картофеля. Установлено, что клубни и листья различных сортов и гибридов картофеля содержат ингибиторы, подавляющие активность гидролаз колорадского жука. Показатели активности ингибиторов целлюлаз и пектиназ в тканях растений могут служить в качестве критерия их устойчивости к фитофагам.

Ключевые слова: пектиназы, целлюлазы, ингибиторы гидролитических ферментов, колорадский жук, картофель.

Растения противостоят инфекциям и стрессовым воздействиям окружающей среды посредством проявления комплекса физиолого-биохи-мических реакций [1] , важным составляющим которых является подавление активности гидролитических ферментов [2,3]. Ткани растений содержат соединения, способные ингибировать активность гидролаз патогенных микроорганизмов, насекомых, млекопитающих. Наибольшее число работ посвящено исследованию ингибиторов, подавляющих активность протеолитичес-ких ферментов [4, 5]. Сведения об ингибиторах, подавляющих активность других гидролаз пока в литературе малочисленны [2].

Целлюлазы (КФ 3.2.1.4 и 3.2.1.74) и пектиназы ( КФ 3.1.1.11) участвуют в гидролизе материала клеточных стенок растений, уровень активности этих ферментов является важным фактором агрессивности и патогенности микроорганизмов и насекомых — фитофагов [6]. Соответственно, уровень антицеллюлазной активности растительных тканей может служить одним из важных показателей их устойчивости к фитофагам. В связи с этим, исследование относительной активности ферментов и их ингибиторов в системе «растение - насекомое» представляется актуальным и имеет научное и практическое значение.

В данной работе определяли активность ингибиторов из листьев, клубней и проростков картофеля различных сортов, подавляющих действие ферментов колорадского жука.

Материалы и методы

В работе были использованы клубни, листья, проростки картофеля сортов и гибридных

сортообразцов (Невский, Луговской, Удача, 4292-149, 4281-7, 9513). Клубни картофеля были выращены в ОПХ Башкирского НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Бирск).

Для получения растворов с ферментативной активностью, навеску имаго колорадского жука (1г) гомогенизировали в ступке и экстрагировали охлажденной дистиллированной водой (5 мл) в течение 1 ч. Центрифугировали в центрифуге МРШ-310 (Польша) при 7000 об/ мин, 10 мин. Для получения растворов с ингибиторной активностью, 1г растительной ткани экстрагировали в 5 мл охлажденной дистиллированной воды, осадок отделяли центрифугированием при 7000 об/ мин, 10 мин.

Способность экстрактов тканей картофеля подавлять активность целлюлаз определяли по разнице значений активности фермента с водой (контроль) и фермента с ингибитором (растительный экстракт). Активность ингибиторов определяли в экстрактах без нагревания и прогретых при 60°С в течение 10 мин.

Измерение ферментативной и ингибиторной активности проводили методом гелевых пластин [7]. В качестве субстрата для целлюлаз использовали 1% раствор карбоксиметил-целлюлозы, для пектиназ - 1% раствор яблочного пектина. За 1 миллиединицу активности фермента (мЕ) принимали такое его количество, которое гидролизовало субстрат геля размером 1 мм2. За 1 миллиингибиторную единицу активности (мИЕ) - количество ингибитора, необходимое для подавления 1 мЕ активности фермента в стандартных условиях (1ИЕ = 1000 мИЕ).

1 2 3 4 5

Рисунок 1. Гидролиз субстрата КМЦ, иммобилизованного в агарозный гель, ферментами колорадского жука и Trichoderma геезеі; 1,2 -колорадский жук; 3,4,5- Т. геезеі (коммерческий препарат, 1 мг/мл)

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлен результат измерения активности цел-люлолитических ферментов, гидролизующих иммобилизованную в агарозный гель карбоксиметилцел-люлозу. Как видно, экстракты го-могената колорадского жука обладают высокой целлюлолитической активностью, сопоставимой с активностью коммерческого препарата целлюлазы (ТпеЬоёегша гее8е1) в концентрации 1 мг/мл.

В листьях исследованных сортов картофеля выявлена активность ингибиторов, подавляющих действие целлюлолитических и пектинолитических ферментов (табл.1). Уровень ингибиторной активности в листьях значительно различается в зависимости от сорта. Так, экстракты листьев гибрида 4281-7 обладают наибольшей антицеллюлазной активностью, причем практически в равной степени подавляют активность целлюлаз колорадского жука и Т. гее8еь В сортах Невский, Удача активность свободных ингибиторов целлюлаз в листьях не выявляется. Антицел-люлазная активность у этих сортов выявляется лишь после прогревания экстрактов. В любом случае, прогревание экстрактов при-

водит либо к появлению, либо к повышению активности целлюлитических ферментов. По-видимому, определенная часть молекул ингибиторов целлюлаз в растительных тканях находится в составе комплексов с термолабильными компонентами клетки.

Наши эксперименты показывают, что ткани картофеля не обладали целлюлолитичес-кой активностью. Ранее показано, что белковые ингибиторы протеолитических ферментов из растений обладают высокой термостабильностью, и могут быть выделены из комплекса с ферментом путем селективной денатурацией конформационно лабильных молекул фермента при нагревании экстрактов [4]. По нашим данным, растительные ингибиторы целлюлаз

Таблица 1. Активность ингибиторов целлюлаз и пектиназ (ИЕ/г сырой массы) в листьях различных сортов картофеля

Сорт картофеля Ингибиторы целлюлаз Ингибиторы пектиназ

Trichoderma reesei Имаго Leptinotarsa decemlineata имаго Leptinotarsa decemlineata

1 2 1 2 1 2

Невский 0 11,8 ± 0,4 9,4 % 4,6 ± 0,9 3,9% 20,1 ± 0,7 17,0% 14,9± 0,8 19,0% 14,9±0,8 19,0%

Удача 0 5,6±0,6 4,4% 0 5 ,5 2 ± , ОО 6 0, % -н о оС 41 ,7 % 0% -н О ,9 9 4 1

Луговской 2,3 ±0,4 1,8% 14,8 ±0,7 11,8% 2,8±0,6 2,4% 19,7±0,8 16,6%) 21,8 ±0,5 27,8% 14,9±0,8 19,0%

4281-7 2,3± 0,3 1,8% 28,3 ±1,2 22,6% 5,6±0,5 4,7% 27,1±0,6 23,1% 11,4 ±0,6 14,4% 8 0, % -Н о оС 41

9513 0 5,6±0,5 4,4% - - ,8 0, % ■И 4 3, 18, 2 3,9±0,9 4,9%

Примечание: 1- экстракт без прогревания; 2-экстракт после прогревания при 60° С, 10 мин.

В процентах выражена доля подавления активности фермента.

Активность целлюлаз Т. теезеі - 125,2 Е/мг; активность целлюлаз Ь. йесетііпеаіа - 117,9 Е/г активность пектиназ Ь. decemlineata — 78,5 Е/г

Таблица 2. Активность ингибиторов целлюлаз (ИЕ/г сырой массы) колорадского жука

в клубнях и проростках картофеля

Сорт Проростки Клубни

1 2 1 2

Невский 13,3+ 0,5 13,3% 19,1+0,8 19,2% 9,3±0,4 9,3% 8 0, % ,1 6 6

Удача 0 11,4 + 0,5 11,4% 8,3+0,6 8,3% 13,5+0,7 13,5%

4281-7 0 10,6+ 0,5 11,8+0,4 10,2+0,4

10,6% 11,8% 10,2%

4292-149 0 12,1± 0,4 4,2+0,3 13,3± 0,5

12,1% 4,3% 13,3%

1- экстракт без прогревания; 2-экстракт после прогревания при 60 єС, 10 мин. Активность целлюлаз Ь. йесетИиеМа - 117,9 Е/г .

В процентах выражена доля подавления активности фермента

и пектиназ также термостабильны и не теряют активности при прогревании экстрактов.

Интересно отметить, что прогревание экстрактов листьев картофеля не приводит к повышению активности ингибиторов пектиназ. Этот факт свидетельствует о том, что в листьях картофеля ингибиторы не способны образовывать комплексы с эндогенными пектиназами, хотя пектинолитическая активность в листьях картофеля присутствует.

Проростки и клубни картофеля также обладают антицеллюлазной активностью (табл.2). Как видно, ингибиторы в проростках находятся в связанном состоянии и их активность определяется только после прогревания экстрактов. В

клубнях картофеля определяется активность как свободных, так и связанных ингибиторов. Изученные образцы картофеля характеризуются значительными различиями по показателям активности свободных и связанных ингибиторов целлюлаз в проростках и клубнях.

Таким образом, в тканях картофеля нами выявлены водорастворимые соединения, способные подавлять активность целлюлолити-ческих и пектинолитических ферментов ЬерйпоЬака йесешИпесйа и ТпоНойегша гее$е1. Изученные сорта и гибриды картофеля имеют существенные различия по уровню антицеллю-лазной и антипектиназной активности в клубнях и листьях.

Список использованной литературы:

1. Яруллина Л. Г., Ибрагимов Р.И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам.-уфа:Гилем, 2006.-232с.

2. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений //Успехи биологической химии.-2002.-Т.42.-С.193-216.

3. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белякова Г.А., Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Белозерский М.А. Ингибиторы протеиназ как антистрессовые белки высших растений //Прикладная биохимия и микробиология.-2005.-т.41№4 .-с.392-396.

4. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г., Ахметов Р.Р. Активность свободных и связанных ингибиторов протеиназ в проростках пшеницы при поражении корневой гнилью//Сельскохозяйственная биология.-2000.-№3.- С.89-92.

5. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Панина Я.С., Чаленко Г.И. Действие иммуномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophtora infestans // Физиология растений.-200б.- т.53 №4.- С. 546-553.

6. Абдеев Р.М., Голденкова К.А., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. Свойства термостабильной целлюлазы CeIE Clostridium thermocellum // Биохимия. - 2001. - Т.66 №7.- С. 991 - 992.

7. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Метод измерения пектиназ по гидролизу иммобилизованного субстра-та//Аграрная Россия.- 2009.-С.133

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.