CC BY
39
УДК 639.31:612.128
АКТИВНОСТЬ ГЕПАТОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ОСЕТРОВЫХ РЫБ В НЕРЕСТОВЫЙ ПЕРИОД
Н. В. БАРУЛИН
УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия» г. Горки, Могилевская область, Республика Беларусь, 213407
(Поступила вредакцию 02.09.2013)
Резюме. В статье приводятся результаты исследований активности гепатоспецифических ферментов в сыворотке крови осетровыхрыб в нерестовый период. Исследуется acnapmamaмuнompaнcфepaзa, аланинаминотрансфераза, щелочная фосфата-за. Установлено, что в нерестовый период самки, отрицательно ответившие на стимулирующие инъекции, характеризуются достоверным повышением концентрации гепатоспецифических ферментов, что может свидетельствовать о нарушении в работе печени.
Ключевые слова: ферменты, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза, нерестовый период, печень.
Summary. This paper presents the results of research into the activity of hepato-specific enzymes in blood serum of sturgeon fishes during the spawning season. Aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, alkaline phosphatase are under investigation. It has been established that during the spawning season females with negative reaction to stimulating injections exhibit significant increase in hepato-specific enzymes, which can imply liver function abnormality.
Key words: alkaline phosphatase, alanine aminotransferase, spawning season, females, liver.
Введение. Черная икра является наиболее ценным продуктом, получаемым от осетровых рыб. Однако получение пищевой икры в условиях аквакультуры сталкивается с серьезными трудностями, прежде всего с физиологической готовностью самок к нересту, т. к. современная технология икорно-товарного осетроводства предусматривает сокращение сроков половой зрелости в 2-2,5 раза, что часто негативно сказывается на рыбоводно-биологических показателях и физиолого-репродуктивных характеристиках как производителей, так и их потомства, что ведет к значительному ухудшению качества получаемого рыбопосадочного материала.
Как известно, печень играет важную роль в процессе полового созревания рыб, при этом от работы этого органа зависят не только сроки полового созревания рыбы, но и качество получаемого потомства. Болезни печени и желчевыводящих путей широко распространены среди рыб, выращенных в условиях интенсивной аквакультуры. В решении этой проблемы современные биохимические методы исследований могут оказать весьма существенную помощь.
Правильная расшифровка результатов биохимического анализа крови является важным условием формирования целесообразной стратегии лечебно-профилактических мероприятий, а также необходима в выборе технологических элементов формирования и эксплуатации икорно-маточных стад осетровых рыб.
Анализ источников. Анализ показателей крови является одним из наиболее ценных современных методов определения физиологического состояния рыб [8, 10]. Биохимические параметры сыворотки крови позволяют прижизненно выявлять патологические изменения, которые произошли в результате заболевания или другого отрицательного фактора, действующего на организм гидробионтов [1, 9]. Необходимость прижизненного выявления патологических состояний, а также оперативность его коррекции, обусловлена высокой ценностью ремонтных и маточных стад осетровых рыб и индивидуальным подходом к каждой рыбе. Вариации параметров сыворотки крови рыб не только видоспеци-фичны, но и зависят от пола, стадий зрелости и готовности к нересту [2].
В печени как в важном органе, влияющем на созревание рыб, через гонадно-гипофизарно-гипоталамо-печеночную ось происходит синтез белков вителлогенина (Vtg) и zona radiata (Zr) [3]. Специфический белок Vtg является структурным компонентом желткового белка и под воздействием эстрогенных гормонов транспортируется с кровью из гепатоцитов печени в яичники, где поглощается ооцитами в процессе вителлогенеза. Аномальный синтез Vtg может приводить к появлению интер-сексов и индуцировать патологические изменения в семенниках, печени и почках [12]. Белки Zr входят в состав внеклеточной структуры окружающей ооцит рыб, а также являются ответственными за их нормальное оплодотворение [13].
В состав современных клинико-биохимических методов включено измерение активности некоторых ферментов сыворотки крови в качестве диагностических инструментов для оценки дисфункции органов рыб [11]. Для диагностики заболеваний печени используют специфические маркеры, включающие ферментный блок из аспартатаминотрансферазы (AST), аланинаминотрансферазы (ALT), щелочной фосфатазы (ALP) [1, 5, 7, 8, 9, 10, 11].
Цель работы - изучить концентрацию «печеночных» ферментов в сыворотке крови икорно-маточных стад осетровых рыб в нерестовый период в условиях замкнутого водоснабжения.
Материал и методика исследований. Исследования выполнялись на кафедре ихтиологии и рыбоводства и на кафедре биотехнологии и ветеринарной медицины УО БГСХА в течение 2011-2013 гг. Биохимические исследования проводились в лаборатории прикладной эндокринологии, биотехнологии и ветеринарной медицины УНИИЖиВМ при УО БГСХА (аттестат № BY/112.02.1.0.1691 от 23 мая 2011 г.). Гидрохимические исследования выполнялись в ГУ «Дзержинский районный центр гигиены и эпидемиологии» (аттестат № ВУ/112.02.1.0.0094). Производственные исследования выполнялись в рыбном цеху осетрового завода «Акватория», на базе фермерского хозяйства «Василек» (д. Наквасы, Путчинский с/с, Дзержинский р-н, Минская обл.); в рыбном цеху ООО «Ремона» (г. Могилев); в рыбном цеху ООО ТМ (г. Минск), работающим по принципу установки замкнутого водоснабжения (УЗВ), а также в хозрасчетном участке «Вилейка» РУП «Институт рыбного хозяйства» РУП «Научно-практический центр по животноводству Национальной академии наук Беларуси» (Молодечненский р-н, Минская обл.).
Биохимическими методами исследовалась кровь осетровых рыб различного вида (стерлядь, ленский осетр, различные гибридные формы) в нерестовый период.
Отбор крови осуществлялся прижизненно из хвостовой вены с соблюдением ветеринарно-санитарных правил и принципов гуманного отношения к животным. Кровь отбирали в утреннее время, до кормления. Для получения сыворотки крови антикоагулянт не добавляли.
В полученной сыворотке крови изучалась активность ферментов AST (КФ 2.6.1.1), ALT (КФ 2.6.1.2), ALP (КФ 3.1.3.1), активность определения которых основана на кинетическом методе, рекомендованном Международной Федерацией Клинической Химии (IFCC). Исследования проводили на свежей сыворотке, без следов гемолиза. Антикоагулянты не использовались. Все исследования мы проводили при температуре 25 °С с использованием реактивом фирмы Cormay.
Для статистической обработки использовали компьютерные статистические пакеты STATISTICA 8, BioStat 2009, OriginPro 8, Stat Plus 2007. Для соблюдения условий возможности применения параметрических статистических методов мы осуществляли проверку анализируемых данных на подчинение закону нормального распределения (распределение Гаусса). Для этого использовали тест Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса, а также W-критерий Шапиро-Уилка. Дополнительно, для проверки закона нормального распределения, мы использовали график нормальный вероятностей, или т. н. график «вероятностной бумаги». Проверку гипотезы о равенстве дисперсий осуществляли с помощью F-критерия. Проверку гипотезы о равенстве нескольких дисперсий осуществляли с помощью критерия Кохрэна. Учитывая, что условиям распределения Гаусса, а также равенству дисперсий удовлетворяла лишь часть эмпирических распределений признаков, проверку гипотезы о равенстве генеральных дисперсий во всех случаях проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни для независимых переменных. Для проверки гипотезы об отсутствии различий между сравниваемыми группами в целом (если число сравниваемых выборок было больше двух) использовали параметрический од-нофакторный дисперсионный анализ при условии нормального распределения анализируемого признака и однородности дисперсий. В данном случае для проверки однородности дисперсий использовали тест Левена, а для проверки нормальности распределения анализируемых данных использовали опции «Distribution of variables within groups» программы STATISTICA. Для оценки различий показа -телей у более двух исследовательских групп использовали методы множественных сравнений, которые включали в себя поправку Бонферрони (число сравнений менее 8), критерий Ньюмена-Кейлса (число сравнений более 8), критерий Даннета (при сравнении нескольких групп с единственной контрольной) при условии нормального распределения и независимости выборок. В случае несоблюдений условий нормальности распределения использовали дисперсионный анализ Фридмана (для зависимых выборок) или H-тест Крускала-Уоллиса (в других вариантах) с использованием медианного теста [4, 6].
Результаты исследований и их обсуждение. Рыбоводно-технологический процесс получения половых продуктов от производителей осетровых рыб включает в себя ряд последовательных этапов, каждый из которых оказывает важное влияние на конечный результат. Работа с производителями включает в себя: осеннюю бонитировку, зимовку производителей, весеннюю бонитировку, преднерестовое выдерживание производителей, гормональную стимуляцию нереста производителей, получение зрелых половых продуктов. На каждом из этапов мы осуществляли гидрохимический контроль за основными параметрами водной среды (растворенный кислород в воде, азот нитритный, азот нитратный, азот аммонийный).
Как показали результаты наших исследований, на всех этапах рыбоводно-технологического процесса получения половых продуктов гидрохимические показатели соответствовали нормативным значениям: кислород - 7,0-8,0 мг/л, азот нитритный - до 0,005-0,01 мг/л, азот аммонийный - 0,20,4 мг/л. Концентрация азота нитратного в воде в период исследований составила от 30 до 50 мг/л (при нормативном значении 10 мг/л). Такая концентрация нитратов в воде является характерной для условий замкнутого водоснабжения.
В процессе наших исследований с целью стимуляции нереста производителей мы использовали суперактивный аналог гонадотропин-релизинг-гормона млекопитающих сурфагон (GnRHa), расчет дозировки которого осуществляли в зависимости от вида рыбы, температуры воды, коэффициента поляризации ооцитов, внешнего физиологического состояния. Для исследований мы отбирали внешне здоровых производителей, без аномалий в строении тела, с гармоничным телосложением.
Среднее время наступления первой овуляции при температуре 14 °С-16 °С составило 24 часа с момента разрешающей гонадотропной инъекции. Просмотр рыб начинали в соответствии с расчетным временем созревания первых самок. Небольших рыб сгибали в латеральном направлении и оценивали степень овуляции по выделению овариальной жидкости. С целью отбора овулировавшей икры, мы использовали метод надрезания яйцеводов с последующим сцеживанием икры (метод С. Б. Подушки). При использовании этого метода самке через половое отверстие вводили скальпель, направленный режущей поверхностью вверх (ширина лезвия должна быть меньше диаметра генитального отверстия оперируемой рыбы) и делали надрез длиной 1-2 см в каудальной части стенки одного или обоих яйцеводов, открывая тем самым небольшое отверстие в брюшной полости. Через полученный разрез икру сцеживали, аккуратно массируя заднюю треть брюшка.
Исследование активности аспартатаминотрансферазы (AST). Как показали результаты проведенных исследований активность AST (рис. 1) у самок осетровых рыб, отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста, была в среднем на 46,7 % выше активности AST самок осетровых рыб, положительно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста (P=0,006776). Эти различия зависели от вида осетровых рыб: у бестера (рис. 2) активность AST, у рыб, отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста, была на 82,8 % выше (P=0,016704); у ленского осетра (рис. 3) на 92,8 % выше (P=0,008151).
Рис. 1. Сравнение активности AST между Рис. 2. Сравнение активности AST между
самками осетровых рыб, положительно ответившими самками гибрида бестера, положительно ответившими
на стимулирующую инъекцию во время нереста, и самками на стимулирующую инъекцию во время нереста, и сам-
осетровых рыб, отрицательно ответившими на ками гибрида бестера, отрицательно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста стимулирующую инъекцию во время нереста
Boxplot by Group Variable: AST, МЕ/л
самки после нереста_+_ (ЛО, to 29)
Median □ 25%-75%
самки после нереста_отриц._ (ЛО, to 34) ^ Min-Max группы
50
Boxplot by Group Variable: ALT, МЕ/л
самки после нереста_+_ (ЛО, to 29)
самки после нереста_отриц._ (ЛО, to 34)
□ Median
25%-75% X Min-Max
5
Рис. 3. Сравнение активности AST между самками ленского осетра, положительно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста, и самками ленского осетра, отрицательно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста
Рис. 4. Сравнение активности ALT между самками ленского осетра, положительно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста, и самками ленского осетра, отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста
Исследование активности аланинаминотрансферазы (ALT). Активность ALT (рис. 4) у самок ленского осетра, отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста, была в среднем на 70,5 % выше активности ALT самок ленского осетра, положительно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста (P=0,037636).
Исследование активности щелочной фосфатазы (ALP). Активность ALP (рис. 5) у самок осетровых рыб, отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста, была в среднем на 40,2 % выше активности ALP самок осетровых рыб, положительно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста (P=0,002559). Эти различия зависели от вида осетровых рыб: у гибрида РОЛО активность ALP у отрицательно ответивших на стимулирующую инъекцию во время нереста была на 88,1 % выше (P=0,005137), чем у рыб, положительно ответивших на инъекцию (рис. 6).
Boxplot by Group Variable: ALP, МЕ/л
самки после нереста_+_ (№28,29,31,32)
□ Median
самки после нереста отриц. (33,34,35,36) Q 2,5 %°75%0 г Min-Max
группы
140
80
60
40
20
Boxplot by Group Variable: ALP, МЕ/л
самки после нереста_+_ (РОЛО, № 28)
самки после нереста_отриц._ (РОЛО, № 33)
□ Median
25%-75% X Min-Max
80
60
40
20
0
Рис. 5. Сравнение активности ALP между самками осетровых рыб, положительно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста, и самками осетровых рыб, отрицательно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста
Рис. 6. Сравнение активности ALP между самками гибрида РОЛО, положительно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста, и самками гибрида РОЛО, отрицательно ответившими на стимулирующую инъекцию во время нереста
Заключение. Комплекс проведенных исследований и анализ данных показывают, что печень оказывает существенное влияние на эффективность искусственного воспроизводства осетровых рыб в условиях икорно-товарной аквакультуры. Об этом свидетельствует динамика активности и концентрации гепатоспецифических маркеров: у рыб, показавших отрицательный результат в период нерестовой компании, активность AST, ALT и ALP достоверно выше, чем у нормально созревших производителей, что косвенно может свидетельствовать о нарушении функциональных особенностей печени (некроти-
ческом поражении гепатоцитов, жировой дистрофии). Данное утверждение подтверждалось ультразвуковыми исследованиями и будет подробно рассмотрено в следующих публикациях.
В результате проведенных исследований получены новые данные для составления гепатоспецифи -ческого метаболического профиля осетровых рыб, который будет использоваться для комплексной оценки функционального состояния печени в зависимости от вида, возраста, пола, технологии выращивания.
Исследования выполнялись при финансировании Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (тема №Б11-058, научный руководитель - А. П. Курдеко, доктор вет. наук, профессор).
ЛИТЕРАТУРА
1. A comparative study of some hematological features in young reare sturgeons (Acipenser persicus and Huso huso) / M. Bah-mani [et al.]. - Fish Physio Biochem. - 2010. - Vol. 24. - P. 135-140.
2. Anver, C. E. Blood chemistry (electrolytes, lipoprotein and enzymes) values of black scorpion fish (Scorpaena porcus, 1758) in the Dardnelles. / C. E. Anver // Turkey. J Biol Sci. - 2004. - Vol. 4. - P. 716-719.
3. Arukwe, A. Eggshell and egg yolk proteins in fish: hepatic proteins for the next generation: oogenetic, population, and evolutionary implications of endocrine disruption / A. Arukwe, A. Gokseyr // Comparative Hepatology. - 2003. - Vol. 2. - P. 1 - 21.
4. Glantz, S. A. Primer of Biostatistics. / S. A. Glantz. - McGraw-Hill: New York., 2011. - 320 p.
5. Hall, P. What is the Real Function of the Liver 'Function' Tests? / P. Hall, J. Cash // Ulster Med J. - 2012. - Vol. 81(1). -P. 30-36.
6. Hill, T. Statistics: Methods and Applications / T. Hill, P. Lewicki. - StatSoft, Inc., 2005. - 800 p.
7. Murakami, J. Hepatic manifestations in hematological disorders / J. Murakami, Y. Shimizu // International journal of hepatology. - 2013. - Vol. 1. - DOI: 10.1155/2013/484903.
8. Serum biochemical parameters of Acipenser persicus / F. Asadi [et al.] // Fish Physiology and Biochemistry. - 2006. - Fish Physiology and Biochemistry (2006). - Vol. 32. - P. 43-47.
9. Serum biochemical parameters of farmed carp (Cyprinus carpio) / Tanti Patriche [et al.] // AACL BIOFLUX. - 2011. - Vol. 4. -Is. 2. - P. 137 - 140.
10. Serum biochemical parameters of Huso huso / F. Asadi [et al.] // Comp Clin Pathol. - 2006. - Vol. 15. - P. 245-248.
11. Shahsavani, D. Determination of normal values of some blood serum enzymes in Acipenser stellatus Pallas / D. Shahsavani, M. Mohri, H. Gholipour Kanani // Fish Physiol Biochem. - 2010. - Vol. 36. - P. 39-43.
12. Shved N., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) measurement of vitellogenin in plasma and liver histopathology in barfin plaice Liopsetta pinnifasciata from Amursky Bay, Sea of Japan / N. Shved [et al.] // Fish Physiol. Biochem. - 2011. - Vol. 37. -№ 4. - P. 781-799.
13. Zona pellucida domain proteins / L. Jovine [et al.] // Annu. Rev. Biochem. - 2005. - Vol. 74. - P. 83-114.
