CC BY
5тонии (МОГ) /Артериальная гипертония / Под ред. Р.Г. Оганова, Д.В. Небиеридзе, Ю.М. Позднякова. - 1999. - С. 13-18.
10. Романова Ю.В., Мурузюк Н.Н., Буганов А.А. // Мед. труда. - 2005. - 1. - С. 15-19.
11. Сборник научных трудов ГУ НИИ МПКС РАМН за 2003 год. - Вып. 2 / Под ред. А.А. Буганова. - М.: Спутник, 2004. - С. 182-190.
12. Сидоренко Г.И., Захарченко М.П., Морозов В.Г. и др. Эколого-гигиенические проблемы исследо-
вания иммунного статуса человека и популяции. — М.: «Промедэк», 1992.
13. Скворцов Р.Г., Стефаниди A.B. // Сибирский мед. журн. — 1997. — 1—2. — С. 22—24.
14. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. — М., 1995.
15. Mancini G, Nach D.K, Heremans J.S. // Im-munochem. — 1970. — Vol. 7. — P. 261—264.
Поступила 23.11.05
УДК 613.63:616.15+612.42
М.В. Долгушин, A.M. Соседова
АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ В АИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ МОДЕАИРОВАНИИ АААЕРГОПАТОАОГИИ, ВЫЗВАННОЙ СОЧЕТАННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЕМ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ФАКТОРОВ БИОАОГИЧЕСКОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ
Ангарский филиал — НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН,
г. Ангарск
Реакция лимфоцитов периферической крови в виде снижения активности сукцинатдегидрогеназы, неспецифической эстеразы и стимуляции лактатдегидрогеназы при сочетании биологического и химического воздействия указывает на прогрессирование аллергического процесса, зависит от тяжести антигенной нагрузки и не обнаруживается при изолированном влиянии факторов различной природы.
Ключевые слова: лимфоциты, метаболизм, цитохимия, аллергия, диоксид серы.
M.V. Dolgushin, L.M. Sosedova. Activity of enzymes in peripheral lymphocytes in simulated allergic disease caused by combined effects of chemical and biologic occupational factors. Peripheral lymphocytes reaction — lower succinate dehydrogenase activity, nonspecific esterase activity and stimulated lactate dehydrogenase — after combined biologic and chemical influence suggests progressive allergic process, depends on severity of antigen load and is not detected for separate factors influence.
Key words: lymphocytes, metabolism, cytochemistry, allergy, sulphur dioxide.
В ходе исследования ответной реакции организма на воздействие продуктов биотехнологического производства представляется це-лесообразнъм учитывать возможность дополнительного техногенного влияния химических факторов [14, 15]. Отмечено, что химические соединения даже в незначительных дозах и концентрациях способны потенцировать эффекты биологических аллергенов, усиливая развитие гиперчувствительности как по немедленному, так и по замедленному типам [9, 19]. Экспериментальное моделирование различных сочетаний биологического и химического факторов в зависимости от их последовательности и интенсивности действия позволяет изучать характер формирования аллергической перестройки организма [14, 15].
Важную информацию о функциональных нарушениях в организме, в том числе и о состоянии иммунной системы, можно получить на основании оценки активности ферментов в лимфоцитах периферической крови [1, 12]. Метаболизм лимфоцитов зависит от характера воздействия, а также от особенностей возникающих патологических и реактивных состояний. Показано, что использование данных о ферментативных изменениях в клетках крови имеет значение в диагностике, определении прогноза и эффективности терапии профессионально обусловленных заболеваний [13].
Основная цель настоящей работы состояла в том, чтобы оценить зависимость обменных сдвигов в иммунокомпетентных клетках от степени выраженности реакций гиперчувствитель-
ности при моделировании различных состояний аллергопатологии, способных к развитию в реальных условиях. Определение активности ферментов проводилось до момента постановки аллерготестов, что позволяло получить информацию о возможности использования внутриклеточных метаболических параметров в прогнозировании особенностей течения аллергического процесса.
М а т е р и а л ы и м е т о д и к и. В опыте было использовано 130 морских свинок массой 250—350 г, предоставленных ГНЦ ВБ «Вектор». Постановка эксперимента осуществлялась по ранее разработанной схеме, позволяющей моделировать степень выраженности реакций гиперчувствительности в зависимости от интенсивности и последовательности поступления биологического и химического факторов [15]. Согласно условиям данной модели в качестве сенсибилизирующего агента использовали белоксодержащую пыль (БСП), приготовленную из готового продукта биотехнологического производства кормовых дрожжей, а в качестве химического — диоксид серы (SO2). Ингаляцию диоксидом серы проводили в течение 10 дней, по 4 ч ежедневно, в концентрации 2—4 мг/м3 (на уровне ПДК для рабочей зоны).
В зависимости от характера изолированного воздействия БСП вызывали состояние сенсибилизации, низкодозной толерантности (НДТ) и высокодозной толерантности (ВДТ), взяв за основу модель, предложенную A.A. Дуевой с соавт. для промышленных аллергенов [2]. Способы индукции всех трех типов иммунного реагирования с использованием БСП были отработаны ранее в предварительных экспериментах [16]. Контроль возникающих состояний (сенсибилизация, НДТ, ВДТ) проводили на основании аллергоимму-нологических тестов.
Все взятые в опыт животные были разделены на 13 групп (по 8—12 особей в каждой). При этом 1-я группа была контрольной, а на особей 2-й группы оказывали изолированное химическое воздействие. Морским свинкам 3—6-й групп однократно вводили 500 мкг БСП в смеси с неполным адъюван-том Фрейнда под апоневроз задней лапки.
W О о
тивотные 3-й группы подвергались изолированному воздействию БСП, а 4—6-й групп — сочетанному влиянию БСП и SO2. При этом ингаляционную экспозицию диоксидом серы начинали проводить за 14 дней до введения БСП (4-я группа), в день введения БСП
(5-я группа) или через 14 дней после введения БСП (6-я группа).
Животные, составляющие 7—9-ю группы, были использованы для оценки метаболических изменений в лимфоцитах при сочетанном воздействии БСП и диоксида серы после индукции низкодозной толерантности (НДТ). С целью моделирования НДТ морским свинкам всех трех групп однократно внутрисердечно вводили 100 мкг водорастворимого полисаха-ридного антигена (ПСА), приготовленного из БСП, а через 14 дней — 500 мкг БСП в смеси с неполным адъювантом Фрейнда под апоневроз задней лапки. Животные 7-й группы подвергались воздействию ПСА и БСП, а особи 8-й и 9-й групп дополнительно получали ингаляции диоксидом серы в различной последовательности.
На морских свинках, входящих в 10—13-ю группы, изучали характер ответной реакции лимфоцитов на сочетанное воздействие БСП и химического (Б02) факторов на фоне высоко-дозной иммунологической толерантности (ВДТ), вызванной БСП. Для создания модели ВДТ всем животным однократно внутри-сердечно вводили 5000 мкг ПСА, а через 14 дней — БСП. Особи 10-й группы подвергались только воздействию ПСА и БСП, тогда как животные 11, 12 и 13-й групп — сочетан-ному влиянию биологического и химического факторов в различной последовательности.
При экспозиции диоксида серы на животных, подвергнутых воздействию ПСА с целью индукции НДТ и ВДТ, период начала ингаляции приходился на 14-е сутки после введения ПСА (9-я и 11-я группы), на следующий день после поступления ПСА (8-я и 12-я группы) и за 14 дней до введения ПСА (13-я группа).
Метаболические показатели в лимфоцитах подопытных животных оценивали после прекращения ингаляции диоксидом серы (2-я и 6-я группы) или через 14 дней после введения БСП (в остальных группах). Определение активности ферментов проводили на мазках периферической крови с использованием цитохимических методов. Выявляли уровень сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [5], лактатде-гидрогеназы (АДГ) [17], лизосомальной кислой фосфатазы (КФ) [18], а также неспецифической эстеразы (НЭ), используя в качестве субстрата нафтол-АБ-О-ацетат [5]. Результаты определения активности СДГ, АДГ и КФ выражали полуколичественно, в условных единицах цитохимического индекса [5], а
уровня НЭ — в процентах положительно реагирующих клеток.
После забора крови осуществляли постановку тестов немедленной и замедленной гиперчувствительности. Оценивали уровень кож-но-сенсибилизирующих антител, выявляемых при помощи реакции пассивной кожной анафилаксии (РПКА) [20], выраженность положительных внутрикожных аллергических проб [7], интенсивность реакции антигенспецифи-ческого розеткообразования (РАСРО) [6] и реакции торможения миграции лейкоцитов со специфическим антигеном (РТМЛ) [8]. Результаты определения аллерготестов выражали в сантиметрах по величине прокрашивания кожи (РПКА) или по величине отека и эритемы (внутрикожные аллергические пробы), в процентах розеткообразующих лимфоцитов (РАСРО), а также в процентном числе положительных реакций (РТМЛ). Достоверность полученных данных оценивали при помощи непараметрического критерия Вилкоксона— Манна—Уитни.
Р е з у л ь т а т ы. Согласно полученным результатам, изменения активности ферментов в лимфоцитах периферической крови подопытных животных по отношению к контролю зависели от характера воздействия (табл. 1). Влияние диоксида серы на метаболический статус лимфоцитов морских свинок, не подвергавшихся воздействию биологического аллергена (2-я группа), а также на животных, сенсибилизированных БСП, было связа-
но с изменением активности дегидрогеназ, тогда как эффект Б02 на морских свинок с индуцированной НДТ затрагивал активность гидролитических ферментов. Ответная реакция лимфоцитов на воздействие Б02 у морских свинок с ВДТ была наиболее разнообразной, и затрагивала изменения как на уровне гид-ролаз, так и дегидрогеназ.
Метаболический сдвиг (в виде активации СДГ и снижении уровня ЛДГ), отмеченный при ингаляции диоксида серы на интактных животных, не был выявлен при сочетанном воздействии биологического и химического факторов. При этом параллельное снижение активности дегидрогеназ, связанное с изолированным введением аллергена (группы 3 и 7), в ряде случаев сохранялось и после дополнительной ингаляции Б02 (группы 4, 8 и 9). Возрастание активности ЛДГ при одновременном снижении интенсивности реакции на СДГ наблюдалось лишь при сочетанном воздействии аллергена и диоксида серы.
Снижение числа лимфоцитов, положительно реагирующих на НЭ, было характерно для животных, испытывающих влияние Б02 на фоне индукции состояния толерантности (НДТ и ВДТ), и сопровождалось отсутствием активации КФ по отношению к контролю (группы 8, 9, 13). Кроме того, при воздействии Б02 на морских свинок с ВДТ отмечена одинаковая направленность в характере ответной реакции со стороны НЭ и СДГ, выражающаяся в достоверном уменьшении актив-
Группа, характер воздействия СДГ (в усл. ед.) ЛДГ (в усл. ед.) КФ (в усл. ед.) НЭ, %
1 Контроль 0,60 ± 0,07 0,75 ± 0,05 0,56 ± 0,04 10,2 ± 0,9
2 Б02 0,89 ± 0,06* 0,55 ± 0,05* 0,76 ± 0,03* 12,2 ± 2,5
3 БСП (изолированное введение) 0,17 ± 0,07* 0,38 ± 0,05* 1,13 ± 0,08* 13,2 ± 1,4
4 Б0 2 + БСП (последовательно) 0,19 ± 0,04* 0,25 ± 0,04* 1,05 ± 0,06* 8,7 ± 1,1
5 БСП + Б0 2(одновременно) 0,65 ± 0,03 0,82 ± 0,03 1,05 ± 0,06* 8,0 ± 1,5
6 БСП + Б0 2(последовательно) 0,34 ± 0,03* 0,96 ± 0,05* 0,90 ± 0,05* 10,3 ± 1,7
7 НДТ 0,16 ± 0,02* 0,41 ± 0,07* 0,85 ± 0,08* 11,0 ± 1,1
8 НДТ и Б0 2 (одновременно) 0,32 ± 0,05* 0,48 ± 0,07* 0,50 ± 0,08 4,5 ± 0,9*
9 НДТ + Б0 2(последовательно) 0,30 ± 0,04* 0,31 ± 0,03* 0,57 ± 0,03 4,7 ± 1,2*
10 ВДТ 0,90 ± 0,06* 1,43 ± 0,12* 0,88 ± 0,01* 9,1 ± 2,7
11 ВДТ + Б0 2 (последовательно) 0,74 ± 0,06 1,32 ± 0,12* 0,83 ± 0,08* 8,8 ± 1,8
12 ВДТ и Б0 2 (одновременно) 0,36 ± 0,03* 1,27 ± 0,04* 0,71 ± 0,02* 3,8 ± 1,7*
13 Б02 + ВДТ (последовательно) 0,25 ± 0,04* 1,30 ± 0,07* 0,55 ± 0,04 3,3 ± 0,6*
* р < 0,01 (по отношению к контрольной группе).
Т а б л и ц а 1
Изменения активности ферментов в лимфоцитах периферической крови морских свинок при изолированном и сочетанном воздействиях белоксодержащей пыли (БСП) и диоксида серы (Б02)
ности этих ферментов по отношению к контролю (12-я и 13-я группы). При этом выявлена положительная корреляционная связь между средними значениями данных ферментативных параметров в опытных группах (+
0,981; Р < 0,05).
При оценке метаболических изменений, выявленных в лимфоцитах при сочетанном воздействии биологического и химического факторов, принимали во внимание результаты аллерготестов к БСП, которые свидетельствовали о наиболее выраженных реакциях гиперчувствительности у животных в 6, 12 и 13-й группах (табл. 2). Сравнение показателей метаболического статуса и специфического иммунного ответа позволило сделать вывод о взаимосвязи внутриклеточных ферментативных изменений с характером аллергической перестройки организма. Снижение активности СДГ при параллельной стимуляции АДГ происходило в тех случаях, когда ингаляция диоксидом серы приводила к прогрессированию выраженности реакций гиперчувствительности по сравнению с изолированным введением БСП (группы 6, 12, 13). При этом наблюдалось возрастание уровня всех показателей гиперчувствительности как замедленного, так и немедленного типов. В то же время метаболические изменения у животных, с индукцией ВДТ и получивших ингаляции диоксида серы, не ограничивались вышеуказанной ре-
акцией со стороны дегидрогеназ, а сопровождались также снижением процентного числа клеток, обнаруживающих активность НЭ. В тех случаях, когда введение диоксида серы приводило к выраженному возрастанию значений лишь кожных аллергических проб, тогда как интенсивность остальных аллерготес-тов (РПКА, РАСРО и РТМА) повышалась до уровня, отмеченного при изолированном введении БСП, аналогичные изменения со стороны эстеразы происходили на фоне сохранения ингибирующей реакции по отношению к АДГ (группы 8 и 9).
Согласно результатам исследований, проведенных ранее, выявленные нами при воздействии БСП (3-я группа) и после индукции состояния НДТ (7-я группа) изменения со стороны СДГ, АДГ и КФ в лимфоцитах, по существу, отражают заключительную фазу ответной реакции на первичное введение антигена [12]. В то же время стимуляция этих ферментов у животных с развившейся ВДТ к БСП (10-я группа) может быть связана с начальной активацией лимфоцитов в ходе ответной реакции на антиген и, по всей видимости, обусловлена сохранением достаточной концентрации последнего в окружающей клетку среде [11]. Снижение уровня СДГ на фоне стимуляции АДГ и КФ в лимфоцитах периферической крови ранее было выявлено при силикозе, осложненном туберкулезной инток-
Т а б л и ц а 2
Изменения показателей специфического иммунного ответа у морских свинок при сочетанном воздействии белоксодержащей пыли (БСП) и диоксида серы (Б02)
Группа, характер воздействия Кожные пробы с аллергеном, см РПКА, см РАСРО, % РТМА, %
3 БСП (изолированное введение) 0,38 ± 0,04 0,28 ± 0,02 20,3 ± 1,8 75
4 БО 2 +БСП (последовательно) 0,35 ± 0,07 0,29 ± 0,04 23,7 ± 2,2 70
5 БСП + БО 2(одновременно) 0,64 ± 0,13 0,30 ± 0,03 23,7 ± 2,2 70
6 БСП+ БО 2(последовательно) 0,97 ± 0,15** 0,41 ± 0,06* 26,6 ± 1,4** 100
7 НДТ 0,17 ± 0,06 0,08 ± 0,02 6,7 ± 1,3 30
8 НДТ и БО 2 (одновременно) 0,55 ± 0,08* 027 ± 0,03** 11,6 ± 1,8* 50
9 НДТ + БО 2 (последовательно) 0,79 ± 0,11** 0,24 ± 0,02** 17,2 ± 2,0** 50
10 ВДТ 0,20 ± 0,05 0,23 ± 0,04 13,6 ± 2,7 57
11 ВДТ + БО 2 (последовательно) 0,38 ± 0,05 0,17 ± 0,04 42,3 ± 3,2** 50
12 ВДТ и БО 2 (одновременно) 0,68 ± 0,13** 0,27 ± 0,03 18,0 ± 0,1 100
13 БО2 + ВДТ (последовательно) 0,92 ± 0,15** 0,41 ± 0,03** 27,0 ± 1,4** 100
* р < 0,05; ** р < 0,01 по отношению к животным, подвергавшимся изолированному влиянию аллергена. Достоверность изменения показателей аллерготестов в группах 4 и 5 (БСП + Б02) оценивали по отношению к изолированному воздействию БСП (группа 3), показатели в группах 8 и 9 (воздействие Б02 на животных с НДТ) сравнивали со значениями в группе 7 (животные с индуцированной НДТ), а показатели в группах 11— 13 (воздействие Б02 на животных с ВДТ) сопоставляли со значениями в группе 10 (животные с индуцированной ВДТ).
сикацией и предположительно рассматривалось в качестве одного из признаков прогрессиро-вания аллергического процесса [13]. Отмечено, что данное разнонаправленное изменение со стороны СДГ и АДГ характерно для менее дифференцированных лимфоидных клеток [17].
Ту" ^
Кроме того, пониженный уровень цитохимических показателей на НЭ и КФ также может быть связан с наличием менее дифференцированных лимфоцитов [3, 4]. Возрастание в периферической крови числа менее дифференцированных клеток и их предшественников является одним из признаков развития аллергического процесса и может свидетельствовать о функциональной неполноценности нормального иммунного ответа при аллергических расстройствах [1]. При этом отмеченная при сочетан-ном воздействии биологического и химического факторов независимость в развитии реакции со стороны СДГ и АДГ, а также реакции в виде снижения уровня НЭ и КФ, может указывать на неоднородность популяции незрелых лимфоидных клеток. Снижение в периферической крови числа лимфоцитов, положительно реагирующих на эстеразу и КФ, отмечается при вакцинации, и, по всей видимости, не всегда связано с возникновением иммунопатологических состояний [4]. Напротив, сдвиг в сторону незрелых лимфоидных клеток, связанный с возрастанием уровня АДГ, сопровождающийся увеличением показателя РТМА, является более неблагоприятным и свидетельствует, тем самым, о функциональном нарушении нормального иммунного ответа [10].
В ы в о д ы. 1. Метаболические изменения в лимфоцитах периферической крови при сочетанном воздействии биологического и химического факторов зависят от интенсивности аллергенной нагрузки и характера иммунопатологического процесса. 2. Возрастание интенсивности аллергической перестройки организма сопровождается снижением уровня сукцинатдегидрогеназы при одновременной активации лактатдегидроге-назы, уменьшением процентного числа эсте-разоположительных клеток. 3. Возможность обнаружения указанных ферментативных изменений до момента постановки аллерготестов указывает на перспективу использования цитохимических реакций на сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогена-зы и эстеразу в разработке дополнительных оценочных критериев при обследовании лиц, подверженных риску развития аллерго-патологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчи-ков А.В. Метаболические основы регуляции иммунного ответа. — Новосибирск: СО РАМН, 1999.
2. Дуева Л.А., Алексеева О.Г. // Гиг. и сан. — 1982. — 4. — С. 8 — 12.
3. Евсевьева А.И., Абраменко И.В. // Цитология. — 1989. — Т. 31, 5. — С. 569—515.
4. Захарова Т.Р., Болотовский В.М., Титова Н.С. и др. // Журн. микробиол. — 1992. — 2.
— С. 44—48.
5. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. — М.: Медицина, 1981.
6. Литовская А.В. // Лаб. дело. — 1986. — 2. — С. 105—101.
I. Методические рекомендации по изучению аллергенного действия при обосновании предельно-допустимых концентраций кормового белка в атмосферном воздухе. — М., 1983.
8. Методы лабораторной диагностики микогенной сенсибилизации и аллергических состояний, вызванных продуктами производства БВК: Методические рекомендации. — М., 1986.
9. Немыря В.И., Стомахина Н.В., Рябова М.А. // Гиг. и сан. — 1993. — 11. — С. 10—12.
10. Новиков В.С. // Физиол. человека. — 1996.
— Т. 22, 2. — С. 25—34.
II. Ревской С.Ю. // Там же. — 1984. — Т. 10, 6. — С. 1005—1018.
12. Робинсон М.В., Топоркова Л.Б., Труфакин
B.А. Морфология и метаболизм лимфоцитов. — Новосибирск: Наука, 1986.
13. Соколов В.В., Нарциссов Р.П., Иванова Л.А. Цитохимия ферментов в профпатологии. — М.: Медицина, 1915.
14. Соседова Л.М. // Гиг. и сан. — 2003. — 2. — С. 51—53.
15. Соседова Л.М., Бенеманский В.В. // Мед. труда. — 2000. — 8. — С. 21—24.
16. Соседова Л.М., Долгушин М.В., Ганичева
C.Э. // Региональные проблемы гигиены и экологии человека. — Иркутск, 1998. — С. 110—116.
11. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. — М.: Медицина, 1983.
18. Micu D,, Mihailescu E,, Cheta D. et al. // Rev. Roum. Med. — Med. Interne. — 1916. — Vol. 14.
— P. 103—101.
19. Newson R., Strachan L., Corden J. // Occup. Environm. Med. — 2000. — Vol. 31. — P. 186—192.
20. Ovary Z. // Int. Arch. Allergy. — 1952. — Vol. 3. — P. 393 —396.
Поступила 10.10.05
