CC BY
50
УДК 616.12-005.4:613.816:615.009:340.67 Кубанский научный медицинский вестник № 5 (134) 2012
А. В. ИЛЬИНА, В. А. ПОРОДЕНКО, Е. Н. ТРАВЕНКО, Е. И. БЫСТРОВА,
А. П. СТОРОЖУК, П. Г. СТОРОЖУК
АКТИВНОСТЬ АЛКОГОЛЬОКИСЛЯЮЩИХ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ МИОКАРДА ПРИ ИшЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА И НА ФОНЕ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Кафедра судебной медицины ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России,
Россия, 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 262-20-50. E-mail: [email protected]
Значимость внезапной смерти с учетом ее места в структуре общей смертности, многоаспектность этого вопроса приобретают все большую актуальность. Одним из условий успешной разработки данной проблемы, в том числе мер ее профилактики, является достоверная судебно-медицинская диагностика. В работе используются гистохимические методы исследования и исследования активности фермента в алкогольокисляющих ферментных системах при ишемической болезни сердца и на фоне алкогольной интоксикации.
Ключевые слова: скоропостижная смерть, ишемическая болезнь сердца, алкогольокисляющие ферментные системы, интоксикация.
A. V. ILINA, V. A. PORODENKO, E. N. TRAVENKO, E. I. BYSTROVA,
A. P. STOROZHUK, P.G. STOROZHUK
ALKOGOLOKISLYAYUSCHIH ENZYMATIC ACTIVITY SYSTEMS INFARCTION IN CORONARY ARTERY
DISEASE BACKGROUND AND ALCOHOL INTOXICATION
Department of forensic medicine GBOU VPO KubGMU Ministry of Russia,
Russia, 350063, Krasnodar, str. Sedin, 4, tel. (861) 262-20-50. E-mail: [email protected]
The significance of sudden death because of its place in the structure of total mortality, multiple aspects of the issue of increasing importance. One of the conditions for the successful development of the problem, including measures for its prevention is a reliable forensic diagnostics. We use research methods and histochemical study of the activity of the enzyme in alkogolokislyayuschih enzyme systems in coronary artery disease and against drunkenness.
Key words: sudden death, coronary heart disease, alcoholokislyayuschie enzyme systems intoxication.
Введение
В настоящее время Российская Федерация занимает первое место среди европейских стран по заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, которые на протяжении последних 6 лет составляют 75-76%. Повышенное содержание этилового алкоголя обнаруживается у 29-30% умерших от болезней системы кровообращения [6].
Ненасильственная смерть в 2007 г. в РФ занимала 51,7% [3], на Кубани - 46% от общей смертности [4]. В Краснодарском крае доля ненасильственной смерти от сердечно-сосудистых заболеваний в 2010 г. составила 6298 случаев, что соответствует 76,6% от всей ненасильственной смерти [4].
Ишемическая болезнь сердца как причина смерти в международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10), выделена как самостоятельная нозологическая единица под рубрикой I 25.0 [5]. В многочисленных исследованиях отмечена тенденция к постоянному росту ишемической болезни сердца (ИБС), которая протекает на фоне алкоголизации населения [8, 9, 12].
Сложность в посмертной дифференциальной диагностике данного состояния представляет недостаточно изученный механизм танатогенеза, наличие алкоголь-
ной интоксикации, отсутствия четких критериев индивидуальной толерантности к алкоголю.
Целью работы явилось изучение гистохимической активности алкогольокисляющих ферментных систем (АОФС) - алкогольдегидрогеназной (АДГ), микросо-мальной этанолокисляющей, маркерным ферментом которой является никотонамидаденин-динуклеотид-фосфат-диафораза (НАДФ-Д), каталазно-пероксидаз-ной (КТ-ПО) - в миокарде скоропостижно умерших лиц для расширения возможностей судебно-медицинской диагностики ишемической болезни сердца и ишемической болезни сердца на фоне алкогольной интоксикации. Преимуществом гистохимических методов является возможность одновременного изучения патоморфологии исследуемого органа (сердца) и активности ферментов в нем.
Материалы и методы исследования
На материале практических судебно-медицинских экспертиз трупов, выполненных на кафедре судебной медицины, проведено комплексное исследование трупов лиц, умерших скоропостижно от ишемической болезни сердца (ИБС) и ИБС на фоне алкогольной интоксикации. В группу исследования вошло 241 наблюдение, 78,5% из которых составили лица мужского пола со средним возрастом 45-65 лет. В качестве
контрольной группы (К) изучены трупы 16 лиц, смерть которых наступила от механической травмы, признаки алкогольной интоксикации отсутствовали.
Активность АОФС изучали с помощью гистохимических исследований, которые выполняли сразу после исследования трупов. Давность наступления смерти, как правило, не превышала 1-1,5 суток.
Изучен комплекс патоморфологических изменений в сердце (макро- и микроскопическое исследования), прослежена динамика активности АОФС в миокарде с помощью постановки гистохимических реакций. Кусочки сердца размером 1,0х1,0х0,5 см вырезали в каждом случае из двух отделов сердца: передней стенки левого желудочка и задней стенки левого желудочка [11].
Макроскопическое исследование сердца проводили по методике А. И. Абрикосова [1]; при атеросклеротическом поражении венечных артерий их степень учитывали по методике Г. Г. Автандилова [2]. Гистохимическую реакцию на АДГ проводили методом Hess, Scarpelli, Pears [14] в модификации [7]. Реакцию на маркерный фермент МЭОС - НАДФ-Д выполняли по Hess, Scarpelli, Pears [14]. Об активности ферментов судили по интенсивности формазановой реакции с красителем -нитросиним тетразолием. Специфичность реакции в нашей методике была достигнута кратковременной предварительной фиксацией в холодном ацетоне, оптимальным подбором концентрации кофактора, субстрата, соли тетразолия, рН инкубационной среды [8].
При постановке гистохимических реакций использовали криостатные срезы толщиной 10 мкм, которые готовили из блоков миокарда в следующей последовательности: 1) стандартные блоки миокарда вырезать толщиной не более 3-4 мм; 2) перенести их на полоски фильтровальной бумаги и погрузить на 10 секунд в ацетон, охлажденный жидким азотом в камере криостата при температуре -25° С; 3) оставить охлажденным блок тканей в криостате на 10-15 минут, а затем поместить его с помощью тонкой подложки (из ткани печени) на хранившийся в камере криостата металлический держатель; 4) изготовить криостатные срезы толщиной 10 мкм, расправить их на охлажденном стекле в капле холодного ацетона и оставить в камере криостата для высушивания на 10 минут; 5) готовые препараты подсушить при комнатной температуре и поместить для гисто-
химической окраски в инкубационную среду, подогретую до 37° С; 6) после инкубации в термостате срезы на стеклах осторожно промыть в дистиллированной воде и заключить в желатиновый гель стандартной прописи.
Активность КТ-ПО выявляли с помощью разработанного на кафедре ортодианизидинового метода, который предусматривает этапы: 1) получение блоков тканей (сердца); 2) фиксацию их в охлажденном до 4 градусов 4%-ном растворе формальдегида, забу-ференном ацетатом кальция (1,5%) при постоянном кондиционировании среды в течение 3 часов; 3) промывку блоков в 7,5%-ном растворе охлажденной сахарозы; 4) изготовление криостатных срезов толщиной 10 мкм при температуре -25° С; 5) инкубацию в течение 30 минут свободных срезов в подогретой до 37° С смеси (5 мл этилового спирта, 20 мг ортодианизидина, 4,9 мл буфера трис-Н рН 9,0 0,2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода); 6) промывку в воде и постфиксацию в кальцийформоле.
Всего изготовлено и исследовано 1200 гистохимических препаратов. Активность АОФС и ее оценку проводили методом количественной морфометрии продукта гистохимических реакций. Ввод микроскопических изображений срезов миокарда в компьютер осуществляли с помощью платы фрейм-граббера «Октет 512», установленной на ПЭВМ «IBM 286-12.16 PX-116 G», и телеустановки ПТУ-61, сопряженной с МБИ-15. Контроль за поступлением телевизионного сигнала вели по экрану отдельного монитора. Ввод телесигналов выполняли программными пакетами записи и анализа графических изображений «IML» и «NASA».
Для выполнения количественной морфометрии и первичной статистической обработки полученных данных применяли специально разработанную компьютерную программу «Morfolog» [8], которая позволяет вычислять площадь и оптическую плотность (ОП) продуктов гистохимических реакций по 16 и 256 градациям цвета. Сканирование изображений осуществляли по 16 цветовым градациям ОП - с 0 по 15. Для АДГ и НАДФ-Д ОП формазана находилась в пределах шести градаций -с 0 по 5. Для обработки результатов выполненных исследований создана база данных и первичной группировки с использованием программного пакета «Microsoft Office Excel 2007». Данные обрабатывали с
показатели общей (суммарной) активности АОФС в миокарде
группы наблюдений Отделы сердца Общая активность АОФС
Адг % к К надф-н % к К кт-по % к К
Контроль Передняя стенка 1,16 - 1,08 - 1,06 -
(n=16) Задняя стенка 1,17 - 1,39 - 1,68 -
ИБС Передняя стенка 0,90 85 1,28 118 2,14 201
(n=57) Задняя стенка 0,97 124 1,02 73 2,23 132
ИБС+незн. Передняя стенка 1,04 89 0,80 74 1,48 139
(n=9) Задняя стенка 0,84 71 0,79 56 1,57 93
ИБС+легк. Передняя стенка 1,51 130 1,44 133 1,60 150
(n=78) Задняя стенка 1,50 128 1,51 108 1,74 103
ИБС+сред. Передняя стенка 1,01 87 1,04 112 2,10 198
(n=34) Задняя стенка 0,84 71 1,01 72 2,09 124
ИБС+сил. Передняя стенка 1,51 130 1,50 138 1,62 152
(n=21) Задняя стенка 1,49 127 1,52 109 1,76 104
p<0,01 p<0,01 p<0,05
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (134) 2012
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (134) 2012
помощью программного пакета «StatSoft» <^а^юа» (версия 6.0). Различия считались достоверными, если вероятность ошибки равнялась р< 0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
При гистохимическом изучении состояния алко-гольокисляющих ферментных систем, в частности алкогольдегидрогеназы (АДГ), и анализе результатов компьютерной количественной морфометрии выявлено, что при смерти от ИБС в передней и задней стенках левого желудочка сердца активность фермента (средние абсолютные величины) распределялась относительно равномерно и составила 0,90 и 0,97 соответственно; к контрольной группе - 85% и 124% (таблица).
В группе случаев ИБС на фоне алкогольной интоксикации (незначительного его воздействия, до 0,3 промилле этилового алкоголя в крови) активность фермента АДГ в задней стенке левого желудочка несколько снижалась - до 0,84 и повышалась в области передней стенки левого желудочка до 1,04. В случаях ИБС при легкой степени алкогольной интоксикации (до 1,5 промилле этилового алкоголя в крови) и ИБС тяжелой степени алкогольной интоксикации (до 3 промилле этилового алкоголя в крови) показатели общей активности АОФС примерно находились на одном уровне: в передней стенке и задней стенке левого желудочка 1,51 и 1,50 при ИБС легкой степени, такие же цифры встречались при ИБС сильной степени алкогольной интоксикации. Аналогичная картина прослеживается и при исследовании активности фермента НАДФ-Д и КТ-ПО. Отличаются показатели общей активности в случаях ИБС на фоне средней степени алкогольной интоксикации (до 2,5 промилле алкоголя в крови), в сравнении с предыдущими группами показатели ферментной активности снижаются при АДГ в передней и задней стенках левого желудочка и составляют 1,01 и 0,84; при НАДФ-Н - 1,04 и 1,01 соответственно, однако общая активность (средние абсолютные величины) Кт-ПО была повышена по отношению к предыдущим группам и составила в передней стенке - 2,1 и в задней стенке левого желудочка сердца - 2,09.
По полученным данным гистохимических исследований АОФС построены графики-модели общей (суммарной) активности АДГ, НАДФ-Д и КТ-ПО, которые могут быть использованы в качестве стандартов при проведении посмертной дифференциальной диагностики смерти от ИБС и ИБС на фоне алкогольной интоксикации (разных степеней), с целью объективизации судебно-медицинских экспертных выводов.
Таким образом, показатели общей активности ал-когольокисляющей ферментной системы миокарда -АДГ были выше в передней стенке левого желудочка по сравнению с задней стенкой левого желудочка сердца, а показатели активности МЭОС (НАДФ-Д) и КТ-ПО были незначительно выше в задней стенке левого желудочка сердца. При ИБС отмечается снижение общей активности АДГ, МЭОС (НАДФ-Д) и КТ-ПО миокарда по сравнению с повышением общей активности при ИБС на фоне алкогольной интоксикации (различной степени), что, возможно, связано с детоксикационными
свойствами печени и готовностью к участию утилизации этилового алкоголя из организма. Изменяется и соотношение продуктов гистохимических реакций различной оптической плотности (высокой и низкой) в отделах миокарда.
Комплексное патоморфологическое и гистохимическое исследование дает возможность оценить морфофункциональное состояние сердца, позволяет расширить представления о танатогенезе и объективизировать судебно-медицинскую диагностику скоропостижной смерти от ишемической болезни сердца при наличии или отсутствии алкогольной интоксикации.
литература
1. Абрикосов А. И. Техника патолого-анатомических вскрытий трупов. - М. - Л.: Медгиз, 1939. - 200 с.
2. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия: Руководство. -М.: Медицина, 1990. - 384 с.
3. Богомолов Д. В., Таборов Ю. Т. Новые критерии для диагностики скоропостижной сердечной смерти в судебной медицине // Судеб.-мед.экспертиза. - 2007. - № 4. - С. 16-19.
4. Госкомстат России. Российский статистический ежегодник. -М., 2009.
5. Трушевская А. Г. Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем: десятый пересмотр: в 3 т. Пер. с англ. - Женева: ВОЗ, 1995. - Т. 1. Ч. 1. - 698 с.
6. Пиголкин Ю. И. Характеристика смертности в Российской Федерации // Судеб.-мед. экспертиза. - 2011. - № 1. - С. 14-18.
7. Породенко В. А., Перова Т. П., Резников А. Ю. Способ гистохимического выявления каталазы и пероксидазы как диагностического показателя алкогольной интоксикации: Информ. письмо. -Краснодар, 1987. - 6 с.
8. Породенко В. А. Состояние этанолокисляющих ферментных систем при смертельных отравлениях алкоголем // Судеб.-мед. экспертиза. - 1997. - № 3. - С. 15-18.
9. Породенко В. А., Корхмазов В. Т. Моделирование показателей алкогольокисляющих ферментных систем и патоморфологических признаков при остром отравлении этанолом и ишемической болезни сердца // Судеб.-мед. экспертиза. - 2011. - № 4. -С. 4-6.
10. Породенко В. А., Корхмазов В. Т. О значении комплексного исследования для диагностики смерти от острого отравления этанолом и ишемической болезни сердца // Судеб.-мед. экспертиза. -2011. - № 3. - С. 36-38.
11. Породенко В. А., Быстрова Е. И., Ильина А. В. Активность алкогольокисляющих ферментных систем миокарда в диагностике алкогольной кардиомиопатии и ишемической болезни сердца // Альманах судебной медицины. - СПб: «Юридический центр Пресс». 2009. - № 3 (11). - С. 46-50.
12. Разводский Ю. В. Алкоголь и сердечно-сосудистая система: популяционный уровень взаимосвязи // Вопр. наркол. -2005. - № 2. - С. 59-68.
13. Сводные отчеты о деятельности региональных бюро судебно-медицинской экспертизы Российской Федерации за 2003-2008 гг. - М., 2009.
14. Hess R. D., Scarpelli A. G. Pearse The cytochemical localization of pyridine nucleotide-linked dehydrogenase // Nature. -1958. - Vol. 181. - P. 1531-1532.
Поступила 01.10.2012
