Активність ферментів антиоксидантного захисту за дії іонізуючого випромінення та фосфоліпідвмісного препарату Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Фізика живого, Т. 16, N02, 2008. С.65-69.

© Хижняк С.В., Грищенко В.А., СтепановаЛ.І., Прохорова А.О., Литвиненко О.М.

УДК 577.446. 616.36.341

АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ ЗА ДІЇ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЕННЯ ТА ФОСФОЛІПІДВМІСНОГО ПРЕПАРАТУ

Хижняк С.В.1, Грищенко В.А.2, Степанова Л.І.1, Прохорова А.О.1, Литвиненко О.М.2

1 Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

2Національний університет біоресурсів і природокористування України

Надійшла до редакції 15.11.2008

Досліджено вміст ТБК-активних продуктів, відновленого глутатіону, активність каталази, супероксиддисмутази та ферментів глутатіонової системи в різних органах щурів як за окремого впливу іонізуючої радіації, так і на тлі введення БАД БЬР-МБ. Виявлені зміни досліджуваних показників вказують на порушення окисно-антиоксидантного стану клітинних мембран за дії іонізуючого випромінення. Пероральне введення впродовж п‘яти діб до початку опромінення в організм тварин фосфоліпідвмісного препарату БАД БЬР-МБ, нормалізує процеси пероксидного окиснення, що свідчить про антиоксидантні властивості препарату.

Ключові слова: іонізуюча радіація, пероксидне окиснення ліпідів, антиоксидантна система, БАД БЬР-МБ :

ВСТУП

Провідну роль у формуванні радіаційно-індукованих змін у різних системах, органах і клітинах відіграють процеси вільнорадикального пероксидного окиснення [1]. Субстратом пероксидного окислення ліпідів ( ПОЛ ) є поліненасичені жирні кислоти, які входять до складу фосфоліпідів біологічних мембран [2]. Система ПОЛ

- багатоетапний ланцюговий механізм, який знаходиться під контролем різноманітних антиоксидантних захисних систем. Зрив такого контролю призводить до інтенсифікації процесів ПОЛ, збільшенню концентрації та накопиченню в організмі продуктів ліпопероксидації, які володіють високою реакційною спроможністю та можуть чинити системну пошкоджуючу дію на клітину [3].

Ключову роль в регуляції рівня активної форми кисню в тканинах виконує фермент -супероксиддисмутаза, який безпосередньо забезпечує обрив кисневозалежних вільнорадикальних реакцій. Синергістом супероксиддисмутази в клітині виступає каталаза, яка приймає участь у знешкодженні гідрогену пероксиду (Н2О2). Серед інших систем антиоксидантного захисту суттєве місце займає глутатіонова система: глутатіонпероксидаза,

глутатіонредуктаза та глутатіонтрансфераза, яка перешкоджає накопиченню токсичних продуктів ПОЛ [4].

Актуальною проблемою є створення та використання різноманітних препаратів, що здатні зменшити ризики радіаційного пошкодження клітини, у тому числі клітинних мембран. Встановлено ефективність застосування препаратів

на основі фосфоліпідів, які прискорюють регенеративні процеси в пошкоджених органах і тканинах шляхом інтенсифікації відновлення ліпідного складу органів, для яких є характерним ендогенний синтез та кумуляція екзогенних фосфоліпідів, при патологіях різного етіопатогенезу [5]. Створена біологічно активна добавка (БАД БЬР-МБ), що поєднує у своєму складі отримані з природної і дешевої сировини (маслянки) фосфоліпіди, які за своїм жирнокислотним спектром відповідають мембранним фосфоліпідам паренхіми печінки, моно- і поліненасичені жирні кислоти та жиророзчинні а-токоферол і ретинолу ацетат [6], показала ефективність при застосуванні препарату для відновлення ліпідного складу та фізико-хімічних та структурно-динамічних властивостей клітинних мембран ентероцитів за ентеропатології [7, 8]. Відомо, що у патогенезі дегенеративних процесів за розвитку ентеропатології важливого значення набувають порушення структурно-функціонального стану клітинних мембран епітеліоцитів кишечнику та печінки, що є наслідком посиленого пероксидного окиснення мембранних ліпідів та фосфоліпідного гідролізу [9]. У зв’язку із вищенаведеним, враховуючи компонентний склад препарату БАД БЬР-МБ та опираючись на дані стосовно його мембраностабілізуючих властивостей, передбачається можливість прояву і антиоксидантної здатності препарату.

Показники, які визначають рівень

вільнорадикальних процесів та стан антиоксидантної системи і характеризують функціонування захисно-пристосувальних механізмів організму на клітинному рівні [10], виступають чутливими тестами на дію

Хижняк С.В., Грищенко В.А., Степанова Л.І., Прохорова А.О., Литвиненко О.М.

різних екзогенних чинників, у тому числі іонізуючої радіації.

Мета роботи полягала в дослідженні активності ферментів антиоксидантної системи слизової оболонки тонкої кишки, печінки та сироватки крові щурів за дії іонізуючої радіації в дозі 2 Гр та перорального введення фосфоліпідвмісного препарату БАД БЬР-МБ.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дослідження були проведені на лабораторних щурах масою 180 - 200 г. Тварин поділяли на групи: 1- ша група - контрольні тварини; 2 - га група -тваринам вводили БАД БЬР-МБ протягом 5 діб; 3 -тя група - тварин тотально одноразово опромінювали рентгенівськими променями в дозі 2,0 Гр; 4 - та група

- тваринам вводили БАД БЬР-МБ протягом 5 діб, а на 5-й день піддавали рентгенівському опроміненню в дозі 2,0 Гр. Щурів декапітували через 6 діб після початку експерименту чи через 1 добу після опромінення ( 3 та 4-та групи тварин).

Опромінення проводили на установці РУМ-17 з тубусом за наступних умов: потужність дози 0,17 Гр/кв, фільтри 0,5 мм Си та 1 мм А1, сила струму 10 мА, напруга 220 кВ, шкіро-фокусна відстань 50 см. Фосфоліпідвмісний препарат БАД БЬР-МБ вводили перорально із розрахунку 2,7 мг на одну тварину, згідно [6].

Гемолізат крові отримували згідно [11]. Отримання гомогенної фракції слизової оболонки тонкої кишки та печінки проводили згідно [12]. Вміст ТБК-активних продуктів визначали за методом [13]. Спектрофотометрично визначали активність каталази ( КФ 1.11.1.6 ) (КТ) [14] та супероксиддисмутази (КФ 1.15.1.1) (СОД) [15]. Активність глутатіон-

пероксидази (КФ 1.11.1.9) (ГП) та глутатіон-

трансферази (КФ 2.5.1.18) (ГТ) визначали згідно [11]. Вміст відновленого глутатіону (ГЛ) визначали згідно [16]. Вміст білку в досліджуваних препаратах визначали за методом Лоурі та ін. [17].

Експериментальні дані оброблялись загальноприйнятими методами статистики [18].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Іонізуючій радіації притаманна висока

біологічна активність: вона здатна викликати іонізацію будь-яких хімічних сполук біосубстратів, утворення активних радикалів і цим індукувати тривалі реакції в живих тканинах [1, 19]. Активація ПОЛ - є однією із основних причин порушення бар’єрної та матричної функцій ліпідного шару біологічних мембран при пошкодженні клітин. За дії іонізуючого випромінювання порушується рівновага в системі “вільнорадикальні процеси -антиоксидантна активність“ [20].

Таблиця 1

Вміст ТБК-активних продуктів та активність супероксиддисмутази (СОД) та каталази (КТ) крові та клітин печінки і епітелію тонкої кишки (М ± т, п = 8)

Умови досліду ТБК-активні продукти (мкмоль/мг білка) СОД (ум. од./мг білка) КТ (мкмоль/хв мг білка)

Печінка

Контроль 0,80 ± 0,04 3,42 ± 0,25 0,127 ± 0,006

БАД 0,83 ± 0,05 3,22 ± 0,19 0,120 ± 0,009

2 Гр 1,10 ± 0,09* 3,10 ± 0,15 0,215 ± 0,011*

2 Гр + БАД 0,70 ± 0,06 3,16 ± 0,18 0,134 ± 0,009

Тонка кишка

Контроль 0,218 ± 0,021 2,20 ± 0,15 0,028 ± 0,002

БАД 0,230 ± 0,015 2,14 ± 0,20 0,029 ± 0,003

2 Гр 0,366 ± 0,021* 1,80 ± 0,15* 0,040 ± 0,003*

2 Гр + БАД 0,236 ± 0,013 2,35 ± 0,18 0,043±0,005*

К ров

(ммоль/л) (ум.од.) (мкмоль/ хв л)

Контроль 0,580 ± 0,035 1,67 ± 0,08 6,81 ± 0,47

БАД 0,591 ± 0,028 1,62 ± 0,09 7,81 ± 0,39

2 Гр 0,960 ± 0,055* 1,61 ± 0,07 13,90 ± 1,10*

2 Гр + БАД 0,491 ± 0,025 1,58 ± 0,09 15,10 ± 0,86*

Примітки: * - р< 0,05 - відносно контрольних значень

Стан ПОЛ оцінували по накопиченню ТБК-активних продуктів у крові та клітинах слизової оболонки тонкої кишки та печінки. Встановлено (табл.1), що через 1 добу після опромінення тварин в дозі 2 Гр, зростає накопичення ТБК-активних продуктів у клітинах епітелію тонкої кишки в середньому на 68%, а у клітинах печінки - на 38%

відносно контролю. Відмічено також зростання вмісту ТБК-активних продуктів у препаратах крові після опромінення на 66%, можливо як за рахунок окиснення ліпідів крові чи виходу продуктів із інших тканин. За введення БАД БЬР-МБ перед опроміненням вміст ТБК-активних продуктів у

препаратах не відрізняється від відповідних величин в контролі (табл.1).

Отримані результаті по визначенню активності СОД та КТ свідчать (табл.1), що за умов опромінення активність СОД змінюється незначно, в той час як активність каталази зростає у клітинах печінки на 69%, епітелію тонкої кишки на 43% та крові у 2 рази. За умов введення БАД БЬР-МБ перед опроміненням спостерігається лише зростання активності КТ клітин епітелію тонкої кишки та крові. Слід відмітити, що введення тваринам протягом 5 діб лише БАД БЬР-МБ не викликає суттєвих змін досліджуваних показників.

Крім того, досліджували активність ферментів глутатіонової антиоксидантної системи різних органів щурів (табл. 2). Для клітин печінки

встановлено зниження вмісту відновленого ГЛ на 25% та зростання активності ГП на 12 % після опромінення в дозі 2 Гр. Для клітин епітелію тонкої кишки спостерігається зниження вмісту відновленого ГЛ (у середньому на 20% після опромінення), а активність ГП за цих умов зростає на 50%. Вміст відновленого ГЛ у крові знижується, у середньому на 15% після опромінення. При цьому активність ГП зростає на 24%, а активність ГТ знижується на 22%. За умов введення тваринам БАД БЬР-МБ перед опроміненням вміст відновленого ГЛ у досліджуваних препаратах також знижується, у порівнянні із контролем. Активність ГТ та ГП за цих умов не відрізняється від контрольних значень.

Аналізуючи отримані результати слід відмітити інтенсифікацію процесів вільнорадикального окис-нення та порушення функціонування антиоксидантної системи організму за дії іонізуючої радіації, причому характер цих змін має особливості для різних органів. Можливо це свідчить про порушення

взаємодії її функціонування за даних умов. Активність СОД пов’язана з інтенсивністю ПОЛ і залежить від накопичення інтермедіатів останнього [21]. Нагромадження токсичних пероксидних продуктів викликає пригнічення активності СОД та інших антиоксидантних ферментів. Водночас,

виявлене зростання активності КТ можна розглядати як реакцію антиоксидантної системи організму на інтенсифікацію процесів вільнорадикального окиснення і активацію багатьох метаболічних процесів. Однією із універсальних систем розкладу і знешкодження пероксидів є глутатіонпероксидазна система, функціонування якої запобігає ініціації вторинних реакцій окиснення ліпідів [22]. Активність ГП також зростає після опромінення, особливо у клітинах слизової оболонки тонкої кишки та крові. При цьому вміст відновленого ГЛ - основного компонента глутатіонової системи, знижується після опромінення, тобто зростає його використання ферментами глутатіонової системи.

За використання БАД БЬР-МБ перед

опроміненням зміни у показниках, що

характеризують стан окисно-антиоксидантної рівноваги не так виражені, у порівнянні із контролем. Вміст ТБК-активних продуктів не відрізняється від контрольних значень для всіх досліджених

препаратів. Активність каталази та ГП зростає незначно лише у препаратах крові та слизової оболонки тонкої кишки, відносно контрольних значень, що може свідчити про активацію антиоксидантної системи захисту. Спостерігається зниження вмісту відновленого ГЛ, однак, враховуючи його участь у багатьох метаболічних процесах, це може свідчити про інтенсивність використання цієї сполуки за даних умов.

Таблиця 2

Вміст відновленого глутатіону (ГЛ) та активність глутатіонових ферментів крові та клітин печінки і

епітелію тонкої кишки (М ± т, п = 8)

Умови досліду ГТ (ммоль/хв мг білка) ГП (мкмоль/ хв мг білка) ГЛ (мкмоль/мг білка)

Печінка

Контроль 0,272 ± 0,014 0,242 ± 0,025 0,927 ± 0,015

БАД 0,300 ± 0,015 0,221 ± 0,019 0,920 ± 0,012

2 Гр 0,251 ± 0,009 0,270 ± 0,015* 0,699 ± 0,016*

2 Гр + БАД 0,303 ± 0,015 0,261 ± 0,018 0,700 ± 0, 014*

Тонка кишка

Контроль 0,043 ± 0,006 0,022 ± 0,005 0,677 ± 0,010

БАД 0,033 ± 0,004 0,034 ± 0,005 0,669 ± 0,011

2 Гр 0,047 ± 0,04 0,033 ± 0,006* 0,524 ± 0,018*

2 Гр + БАД 0,041 ± 0,003 0,035 ± 0,008 0,543 ± 0,009*

К ров

ммоль/хв л ммоль/хв л мкг/л

Контроль 47,5 ± 0,5 0,191 ± 0,016 140,8 ± 15,0

БАД 40,5 ± 0,8 0,221 ± 0,014 134,8 ± 16.3

2 Гр 38,2 ± 0,4* 0,236 ± 0,017* 118,9 ± 12,1*

2 Гр + БАД 37,5 ± 0,5* 0,178 ± 0,09 98,1 ± 11,2*

Примітки:* - р< 0,05 - відносно контрольних значень.

Хижняк С.В., Грищенко В.А., Степанова Л.І., Прохорова А.О., Литвиненко О.М.

Таким чином, отримані результати вказують, що БАД БЬР-МБ може проявляти захисну дію стосовно протікання окисних процесів в умовах опромінення. Перш за все це обумовлено складом БАД БЬР-МБ, оскільки основною компонентою препарату є фосфоліпіди, які з одного боку стабілізують клітинні мембрани, а з іншого - піддаються окисненню за дії радикалів кисню, а також вітаміни, що володіють антиоксидантними властивостями.

ВИСНОВКИ

У результаті проведеного дослідження встановлено порушення стану окисно-антиоксидантної системи організму щурів за дії іонізуючого випромінення, що обумовлено накопиченням ТБК-активних продуктів, зниженням вмісту відновленого глутатіону та змінами активності каталази та глутатіонових ферментів в препаратах крові, клітин епітелію тонкої кишки і печінки.

Пероральне надходження впродовж п‘яти діб перед опроміненням до організму тварин фосфоліпідвмісного препарату БАД БЬР-МБ впливає на нормалізацію досліджуваних показників, тобто препарат проявляє антиоксидантні властивості та регулює мембранотропні процеси в клітинах опромінених тварин.

Литература

1. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиокислительный гомеостаз в норме и патологии. -К.:Чернобыльинтерформ, 1997. - ч.1.- 202 с., ч.2.-220 с.

2. Владимиров ЮА., Азизов О А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика - 1992.- Т. 29. - С. 3-250.

3. Барабой В.А., Орел В.Э., Карнаух И.М. Перекисное окисление и радиация. - Киев: Наукова Думка, 1991. -С. 256

4. Барабой, Биоантиоксиданты.- К.:Книга плюс, 2006.

- 462 с.

5. Гула Н.М. Мембранні ліпіди як об’єкт фармакологічного дослідження // Фарм.вісник. - 1997. -№ 6. - С. 40 -45.

6. Пат. № 78306 - Україна. Ветеринарна біологічно активна добавка та спосіб репаративної терапії при диспепсії новонароджених телят. Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко. А. 61К 35/20. - № 20041108957; Заявл. 02.11.2004; Опубл. 15.03.2007, Бюл. № 3.

7. Степанова Л.І., Грищенко ВА., Реброва З., Хижняк С.В. Фосфоліпідний склад мембран ентероцитів при дії добавки БАД БЬР-МБ // Вісник Кіївського

національного університету імені Тараса Шевченка, 2007. - Вип. 12. - С. 24 - 2б.

8. Мельничук Д.О., Хижняк С.В., Грищенко В.А., Кисіль О.О.,Войціцький В.М. Структурно-динамічні властивості апікальної та мітохондриальної мембран ентероцитів при експериментальній ентеропатології та спосіб її корекції //Український біохімічний журнал, 2008, у друці.

9. Шевченко В.І., Заярнюк В.П., Панченко В.І. та ін. Шлунково-кишкові хвороби новонароджених телят. Білі Церква: БДАУ, 1997. - 87 с.

10. Колесов О.Е., Маркин АА., Федорова Т.Н. Перекисное окисление липидов и методы определения продуктов липопероксидации в биологических средах // Лабораторное дело.- 1984.- №9.- С. 540-54б.

11. Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслегина А.И. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лаб. дело.-1990.-№8.- С. 19-21.

12. Практикум по биохимии // Под редакцией С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой.- М.: Из-во МГУ, 1989.

- С. 509.

13. Орехович В. Н. Современные методы в биохимии. -М.:Медицина, 1977. - 268с.

14. Королюк МА. Метод определения активносты каталазы в биологическом материале // Лабораторное дело. -1988. - №2. - С. 31-34.

15. Методы биохимических исследований. / Под ред. Прохоровой М.Н. - Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1982.

- 272 с.

16. Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys. - 1959. - Vol. 82 (1). - Р. 70-77.

17. Lowry O.H., Rosenbrouch N.J., Fair A.L. et.al. Protein measurement with the Folin Phenol reagent // J.Biol.Chem.

- 1951. - Vol.193, № 1. - P. 265 -275.

18. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень.- К.: Фітосоцюцентр, 2001.- С. 109-152.

19. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Горбунова Н.Б. Особенности биологического действия малых доз облучения. // Радиобиология. - 1996.- Т.36, №4.

- С. 610-623

20. Серкиз Я.И. Оценка биологической эффективности радиационного воздействия в результате аварии на Чернобыльской АЭС // Докл. АН Украины. - 1992. -№1. - С. 162-170.

21. Hadgson E.K., Fridovich I. The interaction of bovine erythrocyte superoxide dismutase with hydrogen peroxide: inactivation of the inzyme // Biochemistry. -1975.- Vol.14, №24.- P.5294-5299.

22. J.Martensson, A.Jain Glutatione is required for intestinl

function // Biochemistry. - 1990. - Vol.87. -

P. 1715 - 1719.

АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ОБЛУЧЕНИЯ И ФОСФОЛИПИДСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА

Хижняк С.В., Грищенко В.А., Степанова Л.И., Прохорова А.А., Литвиненко О.Н.

Исследовано содержание ТБК-активных продуктов, восстановленного глутатиона, активности каталазы, супероксиддисмутазы и ферментов глутатионовой системы в разных органах крыс как при действии только ионизирующей радиации, так и на фоне введения БАД FLP-MD. Выявленные изменения исследуемых показателей указывают на нарушение окисно-антиоксидантного состояния клеточных мембран в результате облучения. Пероральное введение на протяжении пяти суток до начала облучения в организм животных фосфолипидсодержащего препарата БАД FLP-MD нормализует процессы пероксидации, что свидетельствует об антиоксидантных свойствах препарата.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система, БАД FLP-MD.

THE ENZYME ACTIVITIES OF ANTIOXIDANT PROTECTION UNDER IONIZING IRRADIATION ACTION AND PHOSPHOLIPIDS CONTENT PREPARATION

Khyzhnyak S., Gryshchenko V., Stepanova L., Prokhorova A., Lytvinenko O.

The content of lipid peroxidation production and reduced glutathione, the activity of catalase, superoxide dismutase and the enzymes of glutathione system in the rats different organs both under ionizing irradiation influence only and on BAA FLP-MD action background were investigated. The established changes of the analyzed measures show on the violation of the oxy-antioxidant state of cellular membranes after ionizing radiation action. The introduction of liposomic form on the milk phospholipids (FLP-MD) to the animals for 5 days before ionizing radiation action normalize the peroxidation processes, it indicates the antioxidant property of the preparation.

Key words: ionizing radiation, lipid peroxidation, antioxidant system, BAA (FLP-MD)