CC BY
69
УДК 571.27; 578.224
Активация TLR2-зависимого сигнального пути в клетках WEHI-3B миеломоноцитарного лейкоза мышей приводит к подавлению развития в них апоптоза и к стимуляции прогрессии опухоли в условиях in vivo
Д. В. Щебляков*, Д. Ю. Логунов, И. В. Раковская, М. М. Шмаров, Б. С. Народицкий, А. Л.Гинцбург
Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский
институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи МЗ и СР РФ, 123098, Москва,
ул. Гамалеи, 18
*E-mail: sdmitryv@yahoo.com
Поступила в редакцию 26.08.2011 г.
реферат Толл-подобные рецепторы (TLR) являются главными компонентами системы врожденного иммунитета, которые выполняют важные функции в формировании реакций иммунной защиты организма против развивающейся бактериальной или вирусной инфекции. Связывание TLR с собственными ли-гандами приводит к активации ряда адапторных белков и протеинкиназ, которые участвуют в индукции ключевых провоспалительных факторов. В итоге такой индукции развивается как врожденный иммунный ответ, обусловленный усилением экспрессии ряда провоспалительных цитокинов, антибактериальных белков, так и приобретенный иммунный ответ через созревание дендритных клеток, презентации антигенов и т.д. Благодаря своей способности усиливать специфические и неспецифические иммунные реакции агонисты Толл-подобных рецепторов нашли применение не только в терапии инфекционных заболеваний, но и в химиотерапии различных злокачественных новообразований. Однако различные агонисты TLR могут обладать как противоопухолевым действием (липополисахарид, имиквимод, CpG), так и, напротив, в определенных условиях повышать устойчивость опухолевых клеток к апоптозу и стимулировать их пролиферацию (липополисахарид, липопептид). Нами показано, что активация TLR2-зависимого сигнального пути в клетках миеломоноцитарного лейкоза мышей WEHI-3B при добавлении агониста TLR2 - синтетического липопептида Pam2CSK4, или инфицировании опухолевых клеток Mycoplasma arginini приводит к конститутивной активации в них фактора транскрипции NF-kB, подавлению развития апоптоза, а также к усилению прогрессии миеломоноцитарного лейкоза в условиях in vivo.
ключевые слова Толл-подобный рецептор 2, синтетический диациллипопептид Pam2CSK4, миеломоно-цитарный лейкоз мыши WEHI-3B, фактор транскрипции NF-kB, апоптоз, прогрессия опухолей. список сокращений TLR2 - Толл-подобный рецептор типа 2; NF-kB - ядерный фактор транскрипции kB; PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны; DAMP - молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением; оцРНК - одноцепочечная рибонуклеиновая кислота; ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией; TNFa - фактор некроза опухолей a; IL - ин-терлейкин; MCP1 - фактор хемотаксиса моноцитов 1.
введение
Как известно, Толл-подобные рецепторы (^И) - это основные компоненты системы врожденного иммунитета, участвующие в распознавании консервативных молекулярных структур различных патогенов (РАМР), а также молекул, ассоциированных с по-
вреждением (DAMP) [1, 2]. При этом взаимодействие бактериальных структур или DAMP со специфическими Толл-подобными рецепторами инициирует развитие реакций как врожденного, так и приобретенного иммунного ответа, приводя в конечном итоге к элиминации возбудителя из организма [3, 4].
В настоящее время известно 13 Толл-подобных рецепторов человека (TLR1-13), большинство из которых представлены на поверхности различных клеток иммунной системы (макрофаги, дендритные и тучные клетки, нейтрофилы, В- и Т-клетки, натуральные киллеры), а также на таких неиммунных клетках, как фибробласты, эпителиальные клетки, кератино-циты и т.д. [5-7]. Взаимодействие Толл-подобных рецепторов со специфическими лигандами инициирует каскад сигналов, берущих начало от цитоплазмати-ческих TIR-доменов TLR [8]. Сигнал от TIR-домена через адапторные молекулы MyD88 (myeloid differentiation factor 88), TIRAP (TIR-доменсодержащие адапторы), TICAM1 (TRIF), TICAM2 (TIR-containing adaptеr molecule) передается на соответствующие киназы (TAK, IKK, TBK, MAPK, JNKs, p38, ER K, Akt и др.), которые дифференциально активируют факторы транскрипции (NF-kB, AP-1 и IRF), ответственные за экспрессию различных провоспали-тельных и антимикробных факторов (IL-6, IL-8, TNF, IL-1P) и активацию антигенпредставляющих клеток [7, 9].
Показано, что Толл-подобные рецепторы играют центральную роль в регуляции адаптивного иммунного ответа. Так, TLR-зависимая активация антиген-представляющих дендритных клеток является определяющим моментом в нескольких принципиальных для развития адаптивного иммунитета процессах: активации зрелых T-клеток; процессинга и презентации микробных антигенов; повышении экспрессии костимуляторных молекул (CD80, CD86), необходимых для активации наивных CD4+-T-клеток; подавлении регуляторных T-клеток посредством продукции IL-6 [8, 10]. Известно также, что TLR-зависимая активация важна для созревания В-клеток во время инфекции [11]. Таким образом, ^R выполняют в организме важную роль, которая заключается в развитии воспалительных реакций (активации врожденного иммунитета) в ответ на попадание в организм самых разных патогенов (простейших, грибов, бактерий, вирусов) [12].
В настоящее время широко обсуждается влияние экспрессии и активации Толл-подобных рецепторов на прогрессию опухолей. Показано, что в зависимости от различных факторов (типа TLR и лиганда, типа опухоли, способа введения, концентрации лигандов) Толл-подобные рецепторы могут оказывать на опухолевые клетки двойственный эффект [13]. Показано, что TLR способны активировать противоопухолевый иммунитет [14, 15]. Сейчас проводятся клинические испытания многих агонистов ТLR в качестве противоопухолевых средств. Так, природные (оцРНК) и синтетические (имиквимод) агонисты ТLR7 и -8 показали высокую активность в отношении хрони-
ческого лимфоцитарного лейкоза и опухолей кожи [16]. Лиганд TLR9 - CpG, способен подавлять рост лимфом, опухолей головного мозга, почек, кожи [14]. А лиганд TLR3 - poly(Ic), обладает проапоптотиче-ским действием не только в отношении опухолевых клеток, но и клеток, окружающих опухоль (например, эндотелиальных).
Однако, несмотря на данные о противоопухолевой активности агонистов TLR, в последнее время появляется большое число публикаций, показывающих, что лиганды TLR способны стимулировать прогрессию опухолей различного типа [15-17]. Известно, что уровень ТLR повышен в клетках различных опухолей, а у мышей с нокаутом генов TLR снижена частота образования индуцируемых опухолей [18]. Более того, повышение экспрессии ТLR на поверхности клеток опухолей предстательной железы или опухолей головы и шеи может стимулировать пролиферацию этих клеток [19, 20]. Huang и соавт. [20] показали, что Listeria monocytogenes обладает прямым опухолестимулирующим действием, связанным со способностью активировать TLR2-зависимые сигнальные пути в клетках рака яичника. Более того, TLR2-зависимая активация NF-kB, вызванная L. monocytogenes, повышала устойчивость опухолевых клеток к действию химиотерапевтиче-ских средств [16]. Взаимосвязь TLR2 с прогрессией опухолей подтверждена в работе Karin и соавт. [21], в которой доказана ключевая роль этого рецептора в метастазировании рака легкого.
Таким образом, двойственный эффект TLR говорит о его более сложной функциональной роли в биологии опухоли и требует системного изучения на различных моделях.
В нашей работе проведен анализ экспрессии TLR2 в различных опухолевых линиях. На модели миело-моноцитарного лейкоза мышей (WEHI-3B) показано, что активация TLR2-зависимого сигнального пути в результате добавления синтетического диацилли-попептида Pam2CSK4 приводит к подавлению апоп-тоза, а также к усилению опухолевого роста в условиях in vivo. При этом подобный эффект наблюдался и при заражении клеток WEHI-3B Mycoplasma argi-nini. Нами установлено, что микоплазменная инфекция или добавление к клеткам WEHI-3B агониста TLR2 - диациллипопептида Pam2cSK4, приводит к TLR2-зависимой активации фактора транскрипции NF-kB в опухолевых клетках и к подавлению развития апоптоза, вызванного действием различных противоопухолевых средств. Более того, на модели миеломоноцитарного лейкоза мышей in vivo нами показано, что внутримышечное введение Pam2cSK4 приводило к повышению устойчивости опухоли к действию 5-фторурацила, усилению опухолевого
роста и к сокращению продолжительности жизни мышей. Анализ механизма описанного эффекта аго-ниста TLR2 на клетки WEHI-3B показал, что ключевую роль в стимуляции прогрессии опухоли играет активация фактора NF-kB, а также стимуляция секреции ряда провоспалительных цитокинов, являющихся факторами роста и прогрессии опухолей миеломоноцитарного происхождения.
экспериментальная часть
Клеточные линии
Экспрессию TLR2 анализировали в клетках миело-моноцитарного лейкоза мышей WEHI-3B, в трансформированных макрофагах мыши В10М, фибробла-стах мыши L929, в клетках моноцитарной лимфомы человека U937, в клетках рака легкого человека линий A549 и H460, клетках H1299 немелкоклеточного рака легкого человека, HCT116 рака толстой кишки человека и MCF-7 - рака молочной железы человека. Активность NF-kB, каспаз-3/7, жизнеспособность, уровень трансмембранного митохондриального потенциала, скорость пролиферации анализировали в клетках WEHI-3B.
Клетки WEHI-3B культивировали в среде RPMI с добавлением 10 об.% фетальной бычьей сыворотки (кат. номер SV30160.03, «Hyclone», США), 1 мг/мл глутамина (кат. номер. Ф032, «ПанЭко», Россия), 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (кат. номер А065, «ПанЭко», Россия) при 37°С, в атмосфере 5% СО2. Клетки рассевали в отношении 1 : 6 на вторые сутки.
Бактериальные штаммы
В работе использовали штамм микоплазмы Mycoplasma arginini, любезно предоставленный И.В. Ра-ковской (лаборатория микоплазм и Л-форм бактерий ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).
Реактивы
В работе использовали синтетический диациллипо-пептид Pam2CSK4 («Invivogen», США). Концентрацию хемокинов и цитокинов определяли с использованием набора для проточной цитофлуориметрии FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия).
Реакция обратной транскрипции
Экспрессию генов TLR2 в различных линиях клеток человека/мыши определяли методом ОТ-ПЦР. Суммарную РНК выделяли с помощью реагента TRIZOL («Invitrogen»). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора реагентов RT System («Promega»). кДНК генов TLR2 и GAPDH человека/мыши амплифицировали методом ПЦР
с использованием следующих праймеров: ген TLR2 мыши - прямой праймер 5'-gtttccttctgaccaggatc-3', обратный праймер 5'-gaataaaaggcgtctccctc-3'; ген TLR2 человека - прямой праймер 5'-acctgtgt-gactctccatcc-3', обратный праймер 5'-gcagcatcattgt-tctcttc-3'; ген GAPDH человека - прямой праймер 5'-tctagacggcaggtcaggtccacc-3', обратный праймер 5'-ccacccatggcaaattccatggca-3'; ген GAPDH мыши -прямой праймер 5'-gcatcttcttgtgcagtgcc-3', обратный праймер 5'-tcacacccatcacaaacatg-3'.
Измерение активности в-галактозидазы
Через 24 ч после добавления исследуемых препаратов к клеткам культуральную среду удаляли и добавляли лизирующий буфер с субстратом для в-галактозидазы (1 мМ MgCl2; 0.25 M Трис-HCl pH 7.4; 0.02% NP40; 2 г/л о-нитрофенил-P-D-галактопиранозид (кат. номер 102473, «MP Biomedicals», США)). Активность в-галактозидазы определяли спектрофотометрически (414 нм) по превращению субстрата - о-нитрофенил-в-D-галактопиранозида, в окрашенный продукт о-нитрофенол.
Анализ жизнеспособности клеток
Выживаемость клеток оценивали по соотношению (%) интенсивности окраски метиленовым синим клеток, обработанных цисплатином, таксолом, фторура-цилом в различных концентрациях, и контрольных необработанных клеток (метиленовый синий экстрагировали 0.1% SDS, его количество определяли спек-трофотометрически).
Измерение активности каспаз-3/7
Уровень каспаз-3/7 измеряли, используя специфичный для каспазы-7 флуорогенный субстрат Ac-DEVD-AMC (30 мкM в лизирующем буфере рН 7.0, содержащем 10 hM HEPES, 0.4 hM EDTA, 0.1% CHAPS, 2% глицерин, 2 mM DTT). После 16 ч инкубации клеток с препаратами, индуцирующими апоптоз, измеряли флуоресценцию в точке 0 и спустя 6 ч после добавления субстрата, используя мульти-волновой спектрофотометр Wallac 1420 plate reader («Perkin Elmer»).
Измерение уровня митохондриального трансмембранного потенциала (Дфт)
Уровень трансмембранного митохондриального потенциала (Д^ ) оценивали по связыванию флуоро-генного красителя DioC6 («Sigma», США), степень специфического связывания которого с мембранами митохондрий зависит от величины Д^т. Клетки, инфицированные M. arginini, вносили в 24-луноч-ный планшет (105 клеток/лунка). После индукции
wehi-3b b^ l929 u937 a549 h460 h1299 hct116 mcf-7
TLR2
GAPDH
Рис. 1. Анализ экспрессии Толл-подобного рецептора 2 в различных опухолевых клеточных линиях.
апоптоза к клеткам добавляли Dioc6 в концентрации 40 нМ. Клетки инкубировали в течение 30 мин при +370С, после чего дважды промывали фосфатным буфером. Затем измеряли флуоресценцию при помощи мультиволнового спектрофотометра Wallac 1420 plate reader.
Измерение концентрации цитокинов
Мышам линии BALB/c внутримышечно вводили по 5 мкг Pam2CSK4. У мышей отбирали кровь и в полученной сыворотке методом проточной цитофлуо-риметрии с использованием набора FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия) определяли концентрации 14 хемокинов и цитокинов (IL-1, -2, -4, -5, -6, -10 и -12, TNFa, MCP-1 и -3, MIP-1a, -1b, RANTES, интерферона-y).
Лабораторные животные
В работе использовали 6-недельных (к началу экспериментов) самок мышей линии BALB/c, а также бестимусных мышей линии D2&I.
Анализ выживаемости мышей линии BALB/c
Для оценки влияния диациллипопептида Pam2CSK4 на скорость прогрессии опухолевого роста мышам линии BALB/c, разделенным на различные группы, вводили внутрибрюшинно клетки WEHI-3B по 2 х 106 клеток/мышь. Через 1, 3, 5 сут после перевивания опухоли мышам вводили по 5 мкг Pam2CSK4. Через 20 сут мышей безболезненно умерщвляли с помощью диэтилового эфира и извлекали печень и селезенку, которые использовали для макроскопического и гистологического исследования. Дополнительно в каждой экспериментальной группе определяли средний вес селезенки.
Влияние совместного введения Pam2CSK4 и клеток опухоли на выживаемость животных изучали на мышах линии BALB/c, которым внутрибрюшинно прививали клетки WEHI-3B (2 х 106 клеток/мышь), а через 24 ч системно вводили синтетический диа-циллипопептид (Pam2CSK4) в дозе 5 мкг/мышь. Спустя 2 сут мышам в течение 3 дней также вводили Pam2CSK4, а мыши из групп, подвергнутых химио-
терапии, получали еще и по 0.6 мг 5-фторурацила. В контрольные группы вошли животные, которым отдельно вводили Pam2CSK4 и 5-фторурацил. Каждая группа состояла из 10 мышей. Животных наблюдали до момента гибели последней мыши (32 дня), регистрируя их общее состояние.
результаты и обсуждение
Анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов 2 и 6 в различных опухолевых линиях клеток
Модель для изучения влияния TLR2 на пролиферацию опухолевых клеток, а также на прогрессию опухоли в условиях in vivo мы выбирали, анализируя экспрессию Толл-подобного рецептора 2 в различных линиях опухолевых клеток (WEHI-3B, B10M, L929, U937, A549, H460, H1299, HCT116, MCF-7) методом обратной транскрипции с последующей ПЦР на ген TLR2 (рис. 1).
Показано, что в пяти из девяти проанализированных клеточных линий (WEHI-3B, B10M, U937, H1299 и MCF-7) экспрессируется Толл-подобный рецептор 2. При этом наибольшая экспрессия этого рецептора наблюдалась в клетках миеломоноцитарного лейкоза мыши (WEHI-3B), которые и были выбраны в качестве модели для использования в экспериментах in vitro и in vivo.
Агонист TLR2 активирует NF-kB и подавляет развитие апоптоза в опухолевых клетках WEHI-3B, экспрессирующих Толл-подобный рецептор 2
На следующем этапе работы для оценки влияния аго-нистов TLR2 на апоптоз, вызванный действием хими-отерапевтических препаратов, в клетках WEHI-3B, экспрессирующих Толл-подобный рецептор 2, измеряли следующие параметры: определяли активность фактора NF-kB (рис. 2), выживаемость клеток, уровень каспаз-3/7 (рис. 3), а также величину трансмембранного митохондриального потенциала (Д^ ) (рис. 4). Клетки WEHI-3B инфицировали M. arginini или добавляли агонист TLR2 - синтетический диа-циллипопептид (Pam2CSK4), после чего обрабатывали цисплатином, таксолом или фторурацилом. После инкубации в течение 16-18 ч измеряли указанные параметры.
Нами показано, что микоплазменная инфекция опухолевых клеток WEHI-3B, содержащих Толл-подобный рецептор 2, вела к активации в них фактора транскрипции NF-kB (рис. 2). Аналогичные результаты получены при добавлении синтетического диациллипопептида Pam2cSK4.
На рис. 2А приведены полученные методом проточной цитофлуориметрии с использованием специфичных антител к TLR2 данные, подтверж-
100 101 102 103 К- M. arginini
TLR2-PE
Рис. 2. Активация NF-kB в клетках WEHI-3B в ответ на микоплазменную инфекцию или добавление диацилли-попептида Pam2CSK4. А — Экспрессия TLR2 в клетках WEHI-3B. Экспрессия основного рецептора диациллипо-пептидов микоплазмы подтверждена методом проточной цитофлуориметрии. Клетки WEHI-3B инкубировали с антителами, специфичными к TLR2 («eBioscience», США). Контрольные клетки инкубировали с изотипическим контролем (анти-IgG). Исходя из фоновой флуоресценции отрицательного контроля определен процент TLR2-позитивных клеток (измерение TLR2 проведено в полном соответствии с рекомендациями производителя). Б - NF-kB-зависимая экспрессия гена люциферазы. В клетки WEHI-3B методом лентивирусной трансфекции был введен элемент, реагирующий на NF-kB, под контролем которого находится ген люциферазы. Клетки инфицировали M. arginini или добавляли синтетический диациллипопептид Pam2CSK4, после чего в инфицированных и контрольных (неинфицированных) клетках, используя стандартную методику, определяли уровень NF-kB-зависимой экспрессии гена люциферазы.
дающие экспрессию TLR2, основного рецептора диациллипопептидов микоплазмы, а также данные по активации NF-kB TLR2-зависимым способом в клетках WEHI-3B (рис. 2Б).
На рис. 3 показана выживаемость и уровень активности основных эффекторных каспаз-3/7 при индукции апоптоза химиотерапевтическими средствами в клетках WEHI-3B, инфицированных M. arginini или при добавлении к ним Pam2CSK4. Уровень каспаз-3/7 измеряли спектрофотометри-чески, используя специфический флуорогенный субстрат Ac-DEVD-AMc. Как видно из представленных результатов, микоплазменная инфекция или добавление липопептида Pam2CSK4 приводили к статистически значимому (р < 0.005) повышению выживаемости клеток WEHI-3B и снижению уровня активации каспаз-3/7 на 25-30% при различных внутриклеточных повреждениях по сравнению с неинфицированными клетками (белые столбцы).
В клетках WEHI-3B измеряли также величину трансмембранного митохондриального потенциала (Д^), падение которого в ответ на различные стрес-сорные воздействия служит основным маркером апоптоза.
С этой целью на инфицированные или обработанные Pam2CSK4 клетки воздействовали цисплатином в различной концентрации и через 16 ч измеряли уровень трансмембранного митохондриального потенциала (Дф ) (рис. 4).
Уровень Дф оценивали по связыванию флуоро-генного красителя DioC6, степень специфического связывания которого с мембранами митохондрий зависит от величины Дф .
Как видно из представленных результатов, в обработанных цисплатином инфицированных M. аrginini клетках WEHI-3B величина трансмембранного ми-тохондриального потенциала была на 25-30% выше, чем в неинфицированных клетках (белые столбцы), что свидетельствует о подавлении апоптоза в инфицированных клетках. Аналогичные результаты получены и при использовании синтетического диа-циллипопептида Pam2CSK4.
Таким образом, в первой части экспериментов in vitro показано, что микоплазменная инфекция или добавление структурных компонентов микоплаз-мы к клеткам WEHI-3B, экспрессирующим Толл-подобные рецепторы 2 и 6, приводит к активации в них фактора транскрипции NF-kB и подавлению апоптоза при различных внутриклеточных повреждениях.
л
Цисплатин
Б Цисплатин
X .0 120
CO
I* 100-
О * 80
¡5 (3 % ¡Ё £ * 60 40
с О 20
0
с
о
m
I*
О * ¡5 (3
120 10080604020 0
0 мкМ 20 мкМ 100 мкМ
5-Фторурацил
K- 30 мкМ 60 мкМ 150 мкМ Таксол
ч 1
<D
0) и
1 "
* о
ID О
T ^
70-, 60 5040 3020 10-
50 40 30 20 10 0
И
ш Ж К
10 мкМ 20 мкМ 100 мкМ
5-Фторурацил
i~Wn ЫЙ иаг-:--I д 11,1 И11 , I ИIII , ИIII
K- 30 мкМ 60 мкМ 150 мкМ Таксол
Рис. 3. Выживаемость и активность каспаз-3/7 в клетках WEHI-3B миеломо-ноцитарного лейкоза мышей, подвергнутых воздействию химиоте-рапевтических средств в различных концентрациях. А - Выживаемость клеток WEHI-3В; Б - активность каспазы-3/7. Данные по каждой точке получены в результате трех независимых опытов (р < 0.005).
SS? О *
с
о
120 10080 60 40 20 0
ч 1
<D
0) и
1 "
* о
ID °
T >■
50 40 30 20 10 0
K- 10 пМ 20 пМ 100 пМ K-
П - Интактные клетки Ц - M. arginini [0 - Pam2CSK4
10пМ 20пМ 100пМ
Кинетика роста опухолевых клеток WEHI-3B при инфекции M. arginini или добавлении диациллипопептида Pam2CSK4 в эксперименте
in vitro
Фактор транскрипции NF-kB участвует в регуляции экспрессии целого ряда белков, среди которых белки, контролирующие клеточную пролиферацию и апоп-тоз [19].
На следующем этапе работы мы решили посмотреть как микоплазменная инфекция или структурные компоненты микоплазмы наряду с антиапоп-тотической активностью могут влиять на кинетику и скорость пролиферации опухолевых клеток WEHI-3B в норме и/или при индукции в этих клетках апоп-тоза.
С этой целью к клеткам WEHI-3B, выбранной в качестве модели, добавляли M. arginini или Pam2CSK4, после чего подтверждали активацию NF-kB в этих клетках. Далее клетки высаживали на 96-луночный планшет (103 клеток на лунку) и добавляли апоптоз-индуцирующие препараты - цисплатин и таксол. Ки-
2500
WEHI-3B
.0
и ф 0
2000
1500
1000
500
К-
10 мкМ 20 мкМ 100 мкМ
отрицательный контроль Ш- М. аrginini 03 - Pam2CSK4
Рис. 4. Уровень трансмембранного митохондриаль-ного потенциала (Д^т) в клетках WEHI-3B, обработанных цисплатином в различных концентрациях. Данные по каждой точке получены в результате трех независимых опытов (р < 0.005).
0
нетику роста клеток определяли по накоплению клеточной биомассы (окрашивание метиленовым синим) в течение 72 ч в отсутствие или при наличии стимула апоптоза.
Из рис. 5 видно, что в клетках, инфицированных микоплазмой и/или при добавлении Pam2CSK4, наблюдалось блокирование апоптоза и не наблюдалось повышения скорости пролиферации.
Таким образом, показано, что обусловленное активацией фактора транскрипции NF-kB подавление апоптоза в клетках, инфицированных микоплазмой, не приводило к повышению скорости пролиферации клеток in vitro.
Влияние агониста TLR2 - диациллипопептида Pam2CSK4 - на пролиферацию и резистентность клеток WEHI-3B к химиотерапевтическим средствам в эксперименте in vivo Нами изучено влияние циркулирующих в организме мышей антигенов - агонистов TLR2, на пролиферацию и устойчивость клеток миеломоноцитарного лейкоза мышей WEHI-3B к химиотерапевтическим средствам in vivo.
На первом этапе мы оценили влияние диацилли-попептида Pam2CSK4 на скорость опухолевой прогрессии. В эксперименте участвовало 40 животных (мыши линии BALB/с, самки) массой 18-20 г. Животных разделили на четыре группы по 10 особей в каждой. Контрольную группу (первую) составили интакт-ные мыши. Во вторую группу вошли мыши, которым трехкратно внутримышечно вводили Pam2CSK4. Третья группа состояла из мышей, которым перевили клетки WEHI-3B (2 х 106 клеток/мышь). Мышам четвертой группы внутрибрюшинно перевили клетки WEHI-3B в той же дозе. Мышам этой группы через 1, 3, 5 сут после перевивания опухоли вводили по 5 мкг Pam2CSK4. Для оценки прогрессии опухоли через 20 сут мышей безболезненно умерщвляли с помощью диэтилового эфира и извлекали печень и селезенку, которые использовали для макроскопического и гистологического исследования. В каждой экспериментальной группе определяли средний вес селезенки (рис. 6А-В). По данным макроскопического исследования у мышей из групп 1 и 2 отсутствовали видимые патологические изменения (рис. 6А), но наблюдалось незначительное увеличение среднего веса селезенки у животных группы 2 (рис. 6Б). Макроскопическое исследование печени и селезенки мышей, которым был перевит миеломоноцитарный лейкоз (группа 3), выявило характерные для лейкоза изменения: увеличение селезенки и некоторое увеличение печени. На поверхности печени и селезенки обнаружены редкие опухолевые образования. При макроскопическом исследовании печени и селезенки мышей, которым
был перевит лейкоз и введен Pam2CSK4 (группа 4), также обнаружены характерные для лейкоза изменения. Селезенка была сильно увеличена. На поверхности селезенки и печени обнаружены рыхлые образования (которые при гистологическом исследовании оказались лейкозными миелоцитарными клетками).
Измерение средней массы селезенки показало значимое увеличение веса этого органа у мышей с лейкозом (группы 3 и 4) по сравнению с мышами контроль-
о4 *
о н
Ф Ц
.0 m X
X
о m н
и ф
X X
с
о
К
о4 *
о н
Ф Ц
.0 m X
X
о m н
и ф
т
X
с
о
К
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
0 ч
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0 0 ч
24 ч
-M. arginini Pam2CSK4
48 ч
72 ч
цисплатин ~M. arginini цисплатин -Pam2CSK4 цисплатин
24 ч
-*-M. arginini ^Pam2CSK4
48 ч 72 ч
таксол
-M. arginini таксол, -Pam2CSK4 таксол
Рис. 5. Кинетика роста клеток WEHI-3B. К - контрольные клетки; M. arginini - клетки, инфицированные M. arginini; Pam2CSK4 - клетки, обработанные диа-циллипопептидом микоплазмы; цисплатин - контрольные клетки, обработанные цисплатином; M. arginini цисплатин - инфицированные M. arginini клетки, обработанные цисплатином; Pam2CSK4 цисплатин -последовательно обработанные диациллипопептидом микоплазмы и цисплатином клетки; таксол - контрольные клетки, обработанные таксолом; M. arginini таксол - инфицированные M. arginini клетки, обработанные таксолом; Pam2CSK4 таксол - обработанные диациллипопептидом микоплазмы и таксолом клетки (р < 0.005).
А
0.8 0.7 0.6 3 0.5 и 0.4 5 0.3 < 0.2 0.1 0
«к то кг
К- Рат2СБК4 WEHI-3B К- WEHI-3B + Рат2СБК4
Средняя масса селезенки
—I——1—Т— ^—I
WEHI-3BK- WEHI-3B + Pam2CSK4
К- Рат2СБК4 WEHI-3B К- WEHI-3B + Рат2СБК4
WEHI-3B + Pam2CSK4
WEHI-3B
Б
В
Время, дни
■*-WEHI-3B + Рат2СБК4 WEHI-3B К- WEHI-3B + Рат2СБК4 + 5-Fu -е- WEHI-3B + 5-Fu — Рат2СБК4
Рис. 6. Влияние диациллипо-пептида Pam2CSK4 на пролиферацию опухолевых клеток WEHI-3B и их резистентность к химиотерапевтическим средствам. А — Макрофотографии органов мышей. Слева представлены макрофотографии селезенки, справа - участков печени с инфильтратами. К - группа интактных мышей, инъецированных фосфатно-солевым буфером; Pam2CSK4 - группа мышей, инъецированная диа-циллипопептидом Pam2CSK4; WEHI-3В - группа мышей с перевитыми клетками WEHI-3B; WEHI-3В + Pam2CSK4 - группа мышей с перевитыми клетками WEHI-3B, инъецированная диациллипопептидом Pam2CSK4. Б - Средняя масса селезенки. Селезенки извлекали из анестезированных мышей. Экспериментальные группы мышей идентичны описанным выше. Для определения средней массы использовали селезенку пяти мышей из каждой группы. В - Микрофотографии срезов печени. Извлеченные образцы печени помещали в 10% формалин для фиксации. Далее по стандартной методике образцы заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Г — Диаграмма выживаемости мышей линии BALB/с. WEHI-3В К - группа мышей, которым внутрибрю-шинно ввели клетки WEHI-3B; WEHI-3В + Pam2CSK4 -группа мышей, которым внутрибрюшинно ввели клетки WEHI-3B и внутримышечно - Pam2CSK4; WEHI-3В + 5-Ры - группа мышей с внутрибрюшинным введением клеток WEHI-3B, получавших 5-фторурацил; WEHI-3В + Pam2CSK4 + 5-Ры -группа мышей с внутрибрю-шинным введением клеток WEHI-3B и внутримышечным введением Pam2CSK4, получавших 5-фторурацил. (р < 0.001 по лог-ранговому тесту.)
ных групп 1 и 2. Введение Pam2CSK4 мышам группы 4 еще более увеличивало среднюю массу селезенки (p < 0.05) по сравнению с массой у животных группы 3 (рис. 6Б).
Гистологическое исследование селезенки и печени мышей из групп 1 и 2 не выявило патологических изменений. В селезенке мышей из групп 3 и 4 картина была сходной. Наблюдалась диффузная плотная инфильтрация пульпы лейкозными миелоцитарны-ми элементами; лимфатические фолликулы были атрофированы. Наибольшими были отличия между образцами печени мышей из групп 3 и 4. В печени мышей из группы 3 присутствовали многочисленные мелкие лейкозные миелоцитарные инфильтраты, тогда как в группе 4 инфильтраты были значительно крупнее (рис. 6В) Инфильтраты располагались преимущественно по ходу синусоидов. Скопления лей-козных клеток обнаруживались также в отдельных кровеносных сосудах. У мышей группы 4, в отличие от группы 3, наблюдалась выраженная поверхностная инфильтрация печени лейкозными клетками.
Проведенные макро- и микроскопическое исследования образцов селезенки и печени мышей, которым внутрибрюшинно перевивали клетки WEHI-3B, позволили сделать заключение о том, что диациллипо-пептид микоплазмы способствует прогрессии опухолевого заболевания.
На следующей стадии мы оценили влияние диа-циллипопептида Pam2cSK4 на скорость прогрессии опухоли. Одновременно определяли каким образом Pam2cSK4 влияет на резистентность перевиваемых клеток к химиотерапевтическим средствам. Этот опыт проводили по схеме, приведенной в разделе «Экспериментальная часть». На рис. 6Г представлена диаграмма выживаемости мышей, участвующих в эксперименте.
Анализ кривых выживаемости Каплана-Мейера показал, что мыши, получавшие синтетический диа-циллипопептид, хуже отвечали на 5-фторурацил, чем мыши, не получавшие Pam2cSK4. Последняя мышь из группы, получавшей химиотерапию, пала на 33 день, в то время как мыши, одновременно с химиотерапией получавшие Pam2CSK4, пали уже на 26 день.
Выживаемость мышей in vivo полностью соответствовала результатам, полученным ранее на культурах клеток. Более того, как видно из диаграммы, все мыши, которым одновременно вводили клетки WEHI-3B и Pam2CSK4, умерли уже на 19 день, в то время как мыши, не получавшие Pam2CSK4, прожили 25 дней. Все это свидетельствует о том, что внутримышечное введение Pam2cSK4 приводило к усилению прогрессии опухоли и сокращению сроков жизни мышей. Примечательно, что результаты
этого эксперимента не согласовывались с данными, полученными на культуре клеток, где добавление Pam2CSK4 в культуральную среду не приводило к повышению скорости пролиферации клеток WEHI-3B.
Влияние диациллипопептида Pam2CSK4 на продукцию факторов, стимулирующих пролиферацию клеток WEHI-3B миеломоноцитарного лейкоза мышей in vivo Принимая во внимание основное отличие в скорости роста клеток WEHI-3B in vitro и in vivo в присутствии Pam2CSK4, мы предположили, что в организме экспериментальных животных после введения диациллипопептида может происходить выработка факторов, существенных для пролиферации клеток WEHI-3B, определяя тем самым кинетику их роста in vivo.
Для подтверждения выдвинутой гипотезы мы изучили как влияет сыворотка мышей, получавших Pam2CSK4, на скорость пролиферации клеток WEHI-3B. Для этого мышам линии BALB/c внутримышечно вводили по 5 мкг диациллипопептида Pam2CSK4. Через 24 ч после инъекции проводили отбор крови мышей для получения сыворотки. В качестве контроля использовали сыворотку мышей, получавших фосфатно-солевой буфер. Сыворотки использовали для приготовления 5% среды культивирования клеток WEHI-3B (RPMI). Среды добавляли к клеткам WEHI-3B, которые высаживали на 96-луночный планшет в концентрации 103 клеток/лунку. Кинетику роста клеток определяли по накоплению клеточной биомассы в реакции с субстратом МТТ в течение 72 ч (рис. 7).
Время, дни
-•-Контрольная сыворотка -с- Сыворотка (Рат2С5К4)
Рис. 7. Кинетика роста клеток WEHI-3B миеломоноцитарного лейкоза мышей, к которым добавили сыворотку мышей, получавших Рат2СБК4 (р < 0.005).
IL-6
MCP-3
70000
60000
с 50000 м
\ 40000 30000 20000 10000 0
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
PBS
■Pam2CSK4
0.3 0.66 12 4 6 Время после введения, ч
IL-10
PBS
Pam2CSK4
0.66 1 2 4 6 Время после введения, ч
7000 6000 5000 4000 3000 2000 10000
PBS
Pam2CSK4
0.3 0.66 1 2 4 24 Время после введения, ч
MCP-1
72
80000 -70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0
PBS
Pam2CSK4
0.66 1 2 4 6 16 Время после введения, ч
500 450 400 350 300 250200 15010050 0
TNFa
MIP-1 a
PBS
Pam2CSK4
0.3 0.66 1 2 4 6 16 Время после введения, ч
PBS
Pam2CSK4
0.3 0.66 1 2 4 6 Время после введения, ч
9000 8000 7000 л6000 ^ 5000 ¡= 4000 3000 2000 1000 0
MIP-1 р
35000
30000
25000
PBS л м 20000
Pam2CSK4 \ 15000
п
10000-
5000 0
RANTES
0.66 1 2 4 6 Время после введения, ч
PBS
Pam2CSK4
0.3 0.66 1 2 4 6 16 Время после введения, ч
Рис. 8. Определение концентрации цитокинов в сыворотках крови мышей, инъецированных Pam2CSK4. Мышам линии BALB/с вводили диациллипопептид Pam2CSK4 или фосфатно-солевой буфер (PBS), после чего через указанные интервалы времени отбирали кровь и приготавливали сыворотку. Образцы сыворотки использовали для определения уровня экспрессии цитокинов. Каждая точка представляет собой среднее значение из трех независимых повторов.
Как видно из рис. 7, добавление к клеткам WEHI-3B сыворотки крови мышей, получавших внутримышечно Pam2CSK4, способствовало увеличению скорости их пролиферации. Результаты этого опыта подтвердили высказанное ранее предположение о возможной выработке фактора, индуцирующего рост клеток миеломоноцитарного лейкоза мышей, в ответ на введение Pam2CSK4.
На следующем этапе была предпринята попытка идентификации факторов, способствующих усилению роста клеток WEHI-3B.
С этой целью мы проанализировали синтез хемо-кинов и цитокинов в организме в ответ на введение диациллипопептида (рис. 8). Экспрессию цитоки-нов определяли по методике, описанной в «Экспериментальной части». На рис. 8 представлены данные для цитокинов, уровень экспрессии которых изменялся в ответ на введение Pam2CSK4. Видно, что в ответ на введение Pam2CSK4 изменялась экспрессия восьми из 14 цитокинов. Анализ опубликованных данных показал, что пять из этих цитокинов способны прямо или опосредованно стимулировать рост опухолей - IL-6, MCP-1, MCP-3, RANTES, TNFa [21].
Таким образом, нами показано, что активация TLR2-зависимого сигнального пути в клетках WEHI-3B после добавления диациллипопептида Pam2CSK4 или клеток M. arginini ведет к конститутивной активации в клетках WEHI-3B фактора транскрипции NF-kB. В свою очередь, активация NF-kB приводит к повышению резистентности таких клеток к различным повреждениям, индуцируемым химиотерапевтическими средствами (цисплатином, таксолом, фторурацилом).
В экспериментах in vitro было показано, что подавление апоптоза в инфицированных M. arginini клетках, обусловленное активацией фактора транскрипции NF-kB, не влияло на скорость пролиферации клеток. Однако другие результаты получены in vivo: внутримышечное введение Pam2CSK4 стимулировало рост клеток WEHI-3B миеломоноцитарного лейкоза мыши в организме экспериментальных животных. Главным образом этот факт связывается со способностью Pam2CSK4 стимулировать экспрессию факторов (IL-6, MCP-1, MCP-3, RANTES, TNFa), усиливающих рост опухолевых клеток.
Результаты, полученные нами на модели клеток WEHI-3B, показывают, что активация Толл-подобного рецептора 2 в опухолевых клетках мие-ломоноцитарного происхождения, обусловленная микоплазменной инфекцией или прямым действием агониста TLR2 (диациллипопептида), стимулирует рост этих клеток. При этом изучение воздействия ми-коплазмы и ее структурного компонента диациллипо-пептида Pam2CSK4 на течение опухолевого процесса позволяет сделать заключение о том, что микоплаз-менная инфекция может не только влиять на скорость прогрессии заболевания, но и на эффективность противоопухолевой терапии. Представленное наблюдение может быть верным не только в отношении микоплазм, но и других патогенов, вызывающих различные инфекции у больных со злокачественными новообразованиями. При этом очевидно, что проведение эффективной терапии в случае лейкозов ми-еломоноцитарного происхождения возможно только при отсутствии стимуляции заболевания факторами патогенных микроорганизмов или их антигенами, циркулирующими в организме. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Medzhitov R. // Nat. Rev. Immunol. 2001. V. 1. P. 135-145.
2. Pasare С., Medzhitov R. // Nature. 2005. V. 438. № 7066. P. 364-368.
3. Uematsu S., Akira S. // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. V. 183. P. 1-20.
4. Bianchi M.E. //J. Leukoc. Biol. 2007. V. 81. P. 1-5.
5. Diebold S.S. // Handb. Exp. Pharmacol. 2009. V. 188. P. 3-30.
6. West A.P., Koblansky A.A., Ghosh S. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2006. V. 22. P. 409-437.
7. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинцбург А.Л. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 9. С. 1224-1243.
8. Aravind L., Dixit V.M., Koonin E.V. // Science. 2001. V. 291. P. 1279-1284.
9. Kawai Т., Akira S. // Semin. Immunol. 2007. V. 19. P. 24-32.
10. Iwasaki A., Medzhitov R. // Nat. Immunol. 2004. V. 5. № 10. P. 987-995.
11. Pasare С., Medzhitov R. // Adv. Exp. Med. Biol. 2005. V. 560. P. 11-18.
12. Palm N.W., Medzhitov R. // Immunol. Rev. 2009. V. 227. № 1.
P. 221-233.
13. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Тухватулин А.И., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. // Acta Naturae. 2010. Т. 2. № 3 (6). С. 14-23.
14. Krieg A.M. // J. Clin. Invest. 2007. V. 117. P. 1184-1194.
15. Chicoine M.R., Zahner M., Won E.K. // Neurosurgery. 2007. V. 60. P. 372-381.
16. Stockfleth E., Trefzer U., Garcia-Bartels C. // Br. J. Dermatol. 2003. V. 149 (Suppl. 66). P. 53-56.
17. Logunov D., Scheblyakov D., Zubkova O., Shmarov M., Ra-kovskaya I., Gurova K., Tararova N., Burdelya L., Naroditsky B., Ginzburg A., Gudkov A. // Oncogene. 2008. V. 27. № 33.
P. 4521-4531.
18. Harmey J.H., Bucana C.D., Lu W. // Int. J. Cancer. 2002. V. 101. P. 415-422.
19. Hayden M.S., Ghosh S. // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 2195-2224.
20. Huang B., Zhao J., Shen S. // Cancer. Res. 2007. V. 67. P. 4346-4352.
21. Karin M., Yamamoto Y., Wang Q.M. // Nat. Rev. Drug. 2004. V. 3. P. 17-26.
