CC BY
8
ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРА ЭФР НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ЭНДОМЕТРИАЛЬНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
М.В. Харченко1, Р.С. Каменцева1, Е.С. Корнилова1, 2
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: mariannakharchenko@gmail.com
Ключевые слова: эндометриальные мезенхимные стро-мальные клетки, рецептор эпидермального фактора роста, дифференцировка, пролиферация, EGF, TGF-a, AREG, Hyper.
Общепринятые представления о передаче сигнала и эндоцитозе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) получены при исследовании постоянных линий трансформированных клеток эпителиального происхождения (например, линий HeLa и A549), обладающих повышенной экспрессией рецептора. Однако, по нашим данным, повышенная экспрессия EGFR наблюдается также и в эндометриальных мезенхимных стромальных клетках (энМСК) человека, а также в МСК других типов. Поскольку МСК можно рассматривать как модель нормальных клеток в культуре, актуальной задачей является изучение роли сигнальной системы, опосредуемой EGFR, в регуляции функционирования этих клеток. Известно, что сигналы EGFR стимулируются его лиган-дами, различающимися, в частности, по аффинности к рецептору. Так, в отличие от EGF и TGF-a, низкоаффинный лиганд амфирегулин (AREG) не вызывает интерна-лизацию EGFR как в энМСК, так и в HeLa. Также обнаружено, что AREG не влияет на пролиферацию в энМСК, тогда как EGF и TGF-a ее ускоряют. Опухолевые клетки, напротив, быстрее пролиферируют в присутствии AREG. Методом проточной цитометрии мы оценили концентрацию пероксида водорода в цитоплазме клеток HeLa и энМСК, которые были трансфекцированы лентиви-русами, несущими ген сенсора к H2O2 — белка Hyper. Образование H2O2 в ходе эндоцитоза связано с активацией NADPH-оксидазы на мембранах эндосом и ли-зосом. Повышение цитоплазматической концентрации H2O2 приводит к увеличению интенсивности эмиссии Hyper при его возбуждении монохроматическим излучением 488 нм и к уменьшению — при возбуждении световой волной 405 нм. Hyper-ratio (F488/F405) прямо пропорционально концентрации H2O2. Так, в суспензионных пробах клеток линии HeLa, к которым был добавлен EGF, Hyper ratio оказался выше, чем в контрольных, уже через 10 мин после добавления фактора роста и продолжает увеличиваться, выходя на плато после 30 мин. В то же время, добавление EGF в энМСК не отразилось на Hyper ratio. Инкубация энМСК с 8-Br-cAMP и прогестероном приводила к стимуляции децидуальной диффе-ренцировки клеток. Однако, добавление EGF и TGF-a одновременно с 8-Br-cAMP и прогестероном препятствует стимуляции децидуальной дифференцировки, причем этот эффект опосредуется EGFR-зависимыми сигнальными путями, поскольку блокируется AG1478 — ингибитором тирозинкиназной активности EGFR. Кроме того, AG1478 значительно повышает секрецию IGFBP1 даже при дифференцировке в отсутствие лигандов EGFR. В отличие от первых двух лигандов, AREG не препятствовал дифференцировке. Мы предполагаем, что эффект EGF и TGF-a регулируется на уровне эндоцитоза лиганд-ре-цепторных комплексов, подавляя дифференцировку
на пролиферативной стадии цикла, в то время как AREG функционирует на секреторной стадии. Работа поддержана грантом РФФИ № 20-04-00927.
АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ NOTCH
В ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ПРИВОДИТ
К ИЗМЕНЕНИЮ РЕПЕРТУАРА ГИСТОНОВ 1
И.А. Хворова1, Е.А. Репкин2, Д.А. Переплетчикова1,
Д.А. Костина1, А.Б. Малашичева1, А.А. Лобов1
1 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: irina.khvorova99@gmail.com
Ключевые слова: Notch, гистон 1, эндотелий, HUVEC, гисто-
новый код, эпигеном, секретом, напряжение сдвига.
Эндотелий, выстилающий стенки сосудов и капилляров, играет ключевую роль в функционировании сердечно-сосудистой системы и передачи сигналов из кровотока в подлежащие ткани. Нарушения функции эндотелия, эндотелиальная дисфункция, связана с широким спектром заболеваний и восстановление функции эндотелия — это перспективная терапевтическая мишень [1].
Известно, что поддержание базового уровня активации сигнального пути Notch в эндотелии необходимо для поддержания эндотелиального фенотипа, а дисре-гуляция Notch связана с эндотелиальной дисфункцией [2]. Сигнальный путь Notch имеет дозозависимый эффект [3], и мы предполагаем, что длительная гиперактивация этого сигнального пути может приводить к накоплению эпигенетических изменений, которые значительно повышают риски развития сердечно-сосудистых заболеваний.
Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели анализ пост-трансляционных модификаций гистонов и изменений секретомного профиля эндотелиальных клеток в ответ на активацию сигнального пути Notch. Активацию Notch проводили при помощи лентивирусной трансдук-ции эндотелиальных клеток пупочного канатика человека (HUVEC) конструкцией для сверхэкспрессии внутриклеточного домена NOTCH1 (N1ICD). После трансдукции N1ICD или контрольной конструкцией, проводили сбор секретома и выделение гистонов, после чего образцы анализировали при помощи протеомики-дробовика на платформе TimsToF Pro (Bruker).
Активация сигнального пути Notch приводила к понижению уровнях PTX3, SERPINE1 и THBS1 в секретоме эндотелиальных клеток. Секреция этих белков эндотелием играет важное значение в поддержании гомеостаза, и снижение их экспрессии под действием Notch хорошо согласуется с литературными данными о том, что дисре-гуляция этого сигнального пути приводит к эндотелиаль-ной дисфункции.
При анализе гистонов мы не нашли статистически достоверных различий в пост-трансляционных модификациях гистонов 2 и 3, однако выявили существенное изменение экспрессии нескольких гистонов 1 (H1). Активация сигнального пути Notch приводит к повышению экспрессии N-ацетилированных форм H1-0, H1-3, H1-4, H1-5, H1-10. Гистон 1 изучен меньше других ги-стонов, однако мы предполагаем, что как и в случае других гистонов, изменение репертуара гистонов 1 может быть связано с эпигенетической регуляцией экспрессии генов. Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 18-14-00152.
Литература:
1. Theodoris C.V., Zhou P., Liu L. et al. Science. 2021. V. 371. P. eabd0724.
2. Fontini F., Vieceli Dalla Sega F., Mannacino L. et al. Biomedicines. 2021. V. 9. P. 997.
3. Semenova D, Bogdanova M, Kostina A. et al. Cell Tissue Res. 2020. V. 379. P. 169.
ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ ТРАНСФЕКЦИИ
ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
ПЛАЗМИДНЫМИ КОНСТРУКЦИЯМИ
В СОСТАВЕ ГИДРОГЕЛЕВЫХ МАТРИКСОВ
М.А. Хворостина1, 2, Т.Б. Бухарова1, В.К. Попов2
1 Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова, Москва, Россия
2 Институт фотонных технологий ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, Москва, Россия
e-mail: mariYa.sva4ina@vandex.ru
Ключевые слова: ген-активированный матрикс, невирусная доставка генов, трансфекция, регенерация тканей.
Разработка трехмерных (3D) конструкций на основе биорезорбируемых полимеров с внедренными в них нуклеиновыми кислотами, кодирующими факторы роста, является наиболее перспективной стратегией для обеспечения эффективной регенерации пораженных участков ткани [1]. Ранее нами продемонстрирована принципиальная возможность формирования методом 3D криопечати универсальных систем на основе альгината натрия для локализованной доставки генетических конструкций в область дефекта [2].
В настоящей работе методами флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и ПЦР в реальном времени исследована кинетика трансфекции HEK293 при их инкубации с ген-активированными альгинатными матриксами разной степени сшивки и содержащими плазмиду с геном усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP).
Показано, что гидрогелевые матриксы способствуют эффективной трансфекции целевых клеток, обеспечивая сохранность и целостность высвобождающейся плазмидной конструкции. Увеличение степени сшивки приводит к уменьшению скорости трансфекции клеток. На 7 сутки плазмиды, высвободившиеся из матрикса, сшитого 2% раствором ионов кальция (Ca2+), проникли в 30 ± 5 тыс. клеток, в то время как плазмиды из альги-натного матрикса, сшитого 10% раствором ионов кальция, проникли в 21 ± 5 тыс. клеток. Это оказало непосредственное влияние на уровень экспрессии гена EGFP (для 2% Ca2+ он выше в 1,7 раз). Однако от степени сшивки также зависит полное время воздействия ген-активированных матриксов на клетки. Учитывая, что матриксы, сшитые 10% Ca2+, способствовали трансфек-ции клеток в течение более продолжительного времени (17 суток), по сравнению с матриксами, сшитыми 2% Ca2+ (7 суток) суммарное количество трансфицирован-ных составило 53 ± 6 тыс.кл. и 30 ± 5 тыс. клеток, а уровень экспрессии гена закономерно увеличился в 2 раза при увеличении степени сшивки.
Таким образом, контролируя процесс полимеризации альгинатных матриксов, возможно влиять на кинетику трансфекции клеток, подбирая тем самым необходимые условия для более эффективной регенерации различных типов тканей. Работа выполнена при
поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках работ по Государственному заданию ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН в части разработки процесса 3D криопечати гидрогелевых матриксов и работ по Государственному заданию ФГБНУ «МГНЦ» в части получения и характеристики плазмид.
Литература:
1. Laird N.Z. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 2021. V. 174. PP. 613-627.
2. Khvorostina M.A. et al. Gels. 2022. V. 8. № 7. P. 421.
ФИЛОСОФСКИЕ ОСНОВАНИЯ ПРАВОВОГО РЕГУЛИРОВАНИЯ ОТНОШЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ТЕХНОЛОГИЕЙ «ИСКУССТВЕННОЙ МАТКИ» (AWT)
С.А. Хмелевская
МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия e-mail: xmelevsk@mail.ru
Ключевые слова: технология AWT; эктогенез; правовое регулирование; философские основания; эмбрион; эктогене-тический субъект; правосубъектность.
Технология AWT («Artificial womb technology») активно разрабатывается в ряде научных центров [1]. Данная технология относится к эктогенезу, а жизнеспособный и развивающийся в искусственной утробе (экзомбе/ exowomb) человеческий эмбрион/плод получил название «эктогенетический субъект». При этом выделяют частичный (если эмбрион/плод развивался какое-то время в материнской/женской утробе, а затем был помещен в искусственную матку) и полный (развитие только в экзомбе) разновидности эктогенеза. Если первый из названных видов применяется в неонатологии уже сегодня (например, создание кувезов для недоношенных или заболевших новорожденных), то второй — в настоящее время находится еще на стадии научных исследований. Технология AWT в случае полного эктогенеза способна породить существенные изменения в понимании человеческой сущности, материнства, роли женщины в обществе, поэтому решение такого рода проблем требует их философского осмысления и, соответственно, определенных философских оснований для правового регулирования [2]. Перечислим некоторые из таких проблем:
1) уже сейчас технология AWT воспринимается в обществе неоднозначно: с одной стороны, она несет в себе благо (например, существенно продвигает развитие пре-натальной медицины), но, с другой стороны, порождает многочисленные риски (например, связанные с возможными отклонениями в развитии ребенка, выращенного в экзомбе) [3]. Поэтому применение технологии AWT должно быть разрешено только по медицинским показаниям, а с правовой точки зрения ее использование можно отнести к ситуациям крайней необходимости;
2) задачи правового регулирования — не только упорядочить общественные отношения, связанные с AWT, но, в первую очередь, защитить права эмбриона/плода — эктогенетического субъекта, который развивается вне утробы матери, самостоятельно, что требует повышенных мер его правовой защиты. В связи с этим требуют пересмотра философские основания правосубъектности эктогенетического субъекта как субъекта «sui generis», а также переосмысление понятий «рождение ребенка», «уголовно-правовая защита эмбриона/плода». Необходимо ввести в правовое регулирование
