CC BY
160
УДК 631.4
АКТИВАЦИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ХИМИЧЕСКИМИ ОТХОДАМИ НА ПРИМЕРЕ ФЕНОЛА
© Н.А. Ильина, Т.В. Фуфаева, Н.А. Казакова
Ключевые слова: плесневые грибы; актиномицеты; гетеротрофные бактерии; фенол; чернозем выщелоченный. Интерес к почвенным микроорганизмам во многом определяется их исключительной ролью в формировании качества почвы. В статье представлены данные по влиянию различных доз фенола на почвенные микроорганизмы.
АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМОЙ ТЕМЫ
Почва образуется в результате дифференциации поверхностных отложений на горизонты почвенного профиля, т. е. происходит все более усложняющееся развитие системы. Первоначально характер почвы определяют почвообразующие породы и минералы.
При недостаточно продуманном антропогенном воздействии и нарушении сбалансированных природных экологических связей в почвах быстро развиваются нежелательные процессы минерализации гумуса, повышается кислотность или щелочность, усиливается соленакопление, развиваются восстановительные процессы - все это резко ухудшает свойства почвы, а в предельных случаях приводит к локальному разрушению почвенного покрова. Высокая чувствительность, уязвимость почвенного покрова обусловлены ограниченной буферностью и устойчивостью почв к воздействию сил, не свойственных ему в экологическом отношении.
В связи с этим возник интерес к почвенным микроорганизмам, который во многом определяется их исключительной ролью в формировании качества почвы (почвенного «здоровья») как способности почвенной биосистемы в заданных пространственных границах поддерживать продуктивность растений и животных, сохранять приемлемое качество воды и воздуха, а также обеспечивать здоровье людей, животных и растений.
Активизация почвенных микроорганизмов (деструкторов), обеспечивая необходимые условия для наиболее эффективной работы деструктора, является неотъемлемой частью процесса биоремедиации.
Технология активизации почвенных микроорганизмов представляет собой совокупность последовательных операций, обеспечивающих создание и поддержание оптимальных условий (температуры, влажности, величины рН, достаточного снабжения кислородом, источниками азота и фосфора) для эффективной работы биодеструктора в данном типе почв в режимах неоднородной загрязненности.
Учитывая природу и свойства экотоксикантов, выбранных в качестве объекта исследований, тип почвы, химический состав почвы, климатические условия, на основании анализа имеющихся способов активизации почвенных микроорганизмов на начальной стадии раз-
работки лабораторной технологии активизации целесообразно применение следующих технологических приемов: увлажнение; рыхление (аэрация); поддержание оптимальной температуры; внесение сорбента.
Был проведен отбор, подготовка и анализ почвы (чернозем выщелоченный).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Отбор почвы проводили в соответствии с ГОСТ 28168-89 [1]. С каждых 40 га паспортизированного поля методом маршрутных ходов были отобраны на глубину пахотного слоя (до 35 см) смешанные пробы (каждая из 40 индивидуальных проб). Смешанные пробы помещали в чистые полипропиленовые мешки по 25-30 кг; мешки маркировались [2].
Испытания проводили в весенне-летний период в статических условиях. В связи с этим такие параметры, как температура окружающей среды и относительная влажность воздуха были фактическими на период проведения испытаний. Средняя температура воздуха в период проведения испытаний ставила 22-25 °С, относительная влажность воздуха 30-45 %.
Почву после просеивания помещали в пластиковые контейнеры. Увлажнение почвы проводили при равномерном поливе водой через рассеиватель лейки. Количество воды, используемое при однократном проведении операции увлажнения, рассчитывается с учетом влагопотребления конкретного типа почв и должно обеспечивать влажность 60 %.
После операции увлажнения в почву вносили рассчитанное количество суспензии загрязнителя для моделирования режима неоднородного загрязнения. Суспензию загрязнителя равномерно выливали на поверхность почвы через рассеиватель лейки. После внесения загрязнителя проводили объемное рыхление. В качестве загрязнителя был выбран фенол.
Фенол относится к веществам II класса опасности и не обладает канцерогенными свойствами.
В течение семи суток после проведения операций увлажнения и создания неоднородного загрязнения происходит «старение» почвы, для чего почву выдерживали при фиксированной температуре.
Во время операции «старения» проводили операцию поверхностного рыхления (аэрации). Рыхление
1679
почвы проводили в поверхностном слое почвы продольными движениями. Пласты земли при этом не переворачивают.
После этапа «старения» почвы вносили сорбент в необходимом количестве.
Сорбент вводили в почву в сухом виде. Для этого навеску сорбента, соответствующую требуемой расчетной дозе, равномерно наносили на поверхность почвы. После внесения сорбента проводили объемное рыхление на всю глубину контейнера.
После операции рыхления на поверхность почвы вносили суспензии деструктора.
Загрязнитель (фенол) вносили в почву в виде суспензии. Суспензию деструктора из сосуда равномерно наносили на поверхность почвы. Объем вносимого количества суспензии рассчитывается в зависимости от величины полной влагоемкости почвы, степени увлажнения почвы на момент внесения деструктора, плотности клеток в суспензии и плотности клеток, которую необходимо создать на 1 г почвы. Требуемая плотность клеток на 1 г почвы 109-1011.
После внесения деструктора через 5-10 мин. производили перемешивание почвы на всю глубину сосуда.
Образцы почвы для лабораторно-аналитических исследований отбирали на 7, 14 и 30 сутки от момента загрязнения.
В течение всего лабораторного испытания по мере необходимости (поддержание влажности на уровне 60 %) проводили увлажнение почвы, рыхление почвы осуществляли один раз в неделю.
Контроль остаточной концентрации загрязнителей в почве проводили в соответствии с [3-8].
Для оценки эффективности ремедиации зараженных образцов почв применяли методы тестирования экотоксикантов в почвенных вытяжках.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В почву вносили 1,36, 13,6 и 136 мг/кг фенола, что соответствовало 10, 100 и 1000 доз предельно допустимой концентрации (ПДК).
Полученные результаты, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что все дозы фенола в первые дни опыта обладали стимулирующим действием на плесневые грибы, увеличивая их количество в 1,52,5 раза, по сравнению с контролем. Причем стимулирующий эффект усиливался с увеличением концентрации ксенобиотика. Однако на 30-й день выявлено снижение количественных показателей микромицетов до уровня контроля.
На актиномицеты фенол практически не оказывал никакого влияния. Лишь при внесении малой дозы численность актиномицетов оставалась на исходном уровне. При внесении же повышенных доз наблюдалось торможение ростовых процессов, но на 30-й день их численность восстанавливалась до контрольных показателей. Данные по влиянию различных доз фенола на численность актиномицет приведены на рис. 2.
Как видно из рис. 3, гетеротрофные бактерии оказались весьма чувствительными к загрязнителю. Наблюдалось подавление их роста, снизившее их количественные показатели до 70 %. К 30-м суткам в пробах, содержащих рабочую концентрацию препарата и в 10 раз
350 300 250 200 150 і
100 -Гґ
50
0
0
30
Время, сут.
Рис. 1. Влияние различных доз фенола на численность плесневых грибов
5
------10 ПДК
------100 ПДК
—1000 ПДК —х— контроль
Вре мя, сут.
Рис. 2. Влияние различных доз фенола на численность актиномицетов
10 ПДК 100 ПДК 1000 ПДК контроль
1680
Время, сут.
Рис. 3. Влияние различных доз фенола на численность гетеротрофных бактерий
-----10ПДК
-----100 ПДК
----- 1000 ПДК
----- контроль
тЯЕшШШжЯЕійЯ
Я№?ЭЕК;^ИКч11|С5Э(Р
шЯЕШйвшЯШВт
•.. * ,-. Щ , . >; ЇТУ'*. г Р
яш9 У Іі
Рис. 4. Результаты микроскопического изучения выделенных штаммов деструкторов фенола (шифр Фл1, Фл2, Фл3, Фл4 и Фл5)
превышающую ее, наблюдалось слабое возобновление роста бактерий. Однако численность их все же не достигала контрольного уровня. В пробе почвы, содержащей дозу, в 1000 раз превышающую ПДК, ингибирующее влияние фенола на бактерии сохранялось, что говорит о сильном бактерицидном свойстве фенола.
После шести пассажей в новую питательную среду из культуральной жидкости с накопительной культурой производили высев на чашки Петри с элективной твердой агаризованной средой М9 + фенол и отбирали изолированные колонии (изоляты). Таким образом удалось получить 5 изолятов, устойчивых к фенолу, которые были исследованы на способность к деструкции в условиях непрерывного культивирования в аэробных условиях на минеральной среде М9. Выделенные штаммы бактерий были обозначены под шифрами Фл1, Фл2, Фл3, Фл4 и Фл5. При микроскопическом изучении видов бактерий установлено, что это мелкие грамположительные и грамотрицательные палочки гетеротрофных бактерий, образующие на агаре мелкие, блестящие, гладкие, с однородной структурой, выпуклые колонии с ровным краем. Результаты микроскопического изучения выделенных штаммов деструкторов фенола представлены на рис. 4. Определение систематического положения отобранных штаммов проводится в соответствии с определителем бактерий Берги [9] по настоящее время.
В связи с тем, что фенол достаточно сложно поддается трансформации и не способен подвергаться пол-
ной минерализации только одним штаммом в результате отсутствия одного или нескольких генов деградации, то при изучении деструкции мы использовали всю популяцию устойчивых штаммов. Известно, что в ассоциации или в консорциуме почвенных микроорганизмов генный пул, отвечающий за деструкцию, на несколько порядков выше и разнообразнее, чем у отдельных видов.
Выделенные штаммы изучали на способность разлагать фенол, используя его как единственный источник углерода. Деструкцию наблюдали в условиях непрерывного культивирования штаммов в колбах Эр-ленмейера со 100 мл жидкой среды М9, в которую вносили фенол в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрациях 50 и 100 мкг/л. Инкубацию культуры проводили при плюс 28 °С в течение 10 суток в условиях аэрации в шейкер-инкубаторе при частоте вращения платформы 50-70 об./мин. Определение фенолов проводили в соответствии с ПНД Ф 16.1:2.3:3.44-05 [4].
Получены данные об изменении оптической плотности клеточной суспензии в процессе роста периодических культур в жидкой среде М9 с добавлением фенола в различной концентрации. Высокую плотность популяции штаммов наблюдали при внесении 50 мкг/л.
Для штаммов деструкторов в периодической культуре наблюдалось существенное изменение оптической плотности клеточной суспензии, начиная с 3-х суток культивирования. Наибольшей плотности культуры достигали к 6-ти суткам культивирования и затем заканчивали свой рост.
При добавлении концентрации 100 мкг/л происходила гибель культур на 2-е сутки инкубации. В процессе инкубации штаммов наблюдалось уменьшение концентрации фенола, которое уменьшалось на 6-е сутки от начальной концентрации 50 мкг/л до 15 мкг/л. Из этих данных следует, что выделенный консорциум бактерий осуществляет деградацию фенола. Так как деградация протекала при низкой концентрации фенола, поиск наиболее оптимальных условий и устойчивых штаммов ведется и по настоящее время.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как показали исследования видового состава некоторых групп почвенных микроорганизмов чернозема выщелоченного, изменения происходили под влиянием
1681
различных доз фенола, данный фактор вызывает изменения в комплексе почвенных микроорганизмов. Фактор выражается в снижении видового разнообразия, увеличении доли толерантных к загрязнению микроорганизмов.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГОСТ 28168-89. Почвы. Отбор проб. Введ.1990-04-01. М.: Изд-во стандартов, 1989. 8 с.
2. Практикум по почвоведению / под ред. И.С. Кауричева. М., 1980. С. 106-108.
3. Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды. Сборник методических указаний. Вып. 3. Ч. 5. МУК 4.1.1404 -4.1.1407-03 Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 24.06.2003 г.
4. ПНД Ф 16.1:2.3:3.44-05 Методика выполнения измерений массовой доли летучих фенолов в пробах почв, осадков сточных вод и отходов фотометрическим методом после отгонки с водяным паром.
5. РД 52.18.156-99 Методические указания. Охрана природы. Почвы. Методы отбора объединенных проб почвы и оценки загрязнения сельскохозяйственного угодья остаточными количествами пестицидов.
6. РД 52.18.188-89 Методические указания. Методика выполнения измерений массовой доли триазиновых гербицидов симазина и прометрина в пробах почвы методом газожидкостной хроматографии.
7. РД 52.18.310-2001 Определение массовой доли фосфорорганиче-ских пестицидов паратион-метила, фозалона, диметоата в пробах почвы. Методика выполнения измерений методом газожидкостной хроматографии.
8. Санитарные нормы допустимых концентраций химических веществ в почве. СанПиН 42-128-4433-87.
9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriologi. Baltimore; London; Los Angeles; Sydney, 1984. V. 1; 1986. V. 2; 1989. V. 3; 1989. V. 4.
Поступила в редакцию 21 мая 2014 г.
Ilyina N.A., Fufayeva T.V., Kazakova N.A. ACTIVATION OF SOIL MICROORGANISMS DURING POLLUTION OF LEACHED CHERNOZEM BY CHEMICAL WASTE BY THE EXAMPLE OF PHENOL
The interest in soil microorganisms is largely determined by their exceptional role in the forming of soil quality. The article deals with some information about the influence of different phenol doses on soil microorganisms.
Key words: mold fungi; actinomyces; heterotrophic bacteria; phenol; leached chernozem.
Ильина Наталья Анатольевна, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова, г. Ульяновск, Российская Федерация, доктор биологических наук, профессор, проректор по научной работе, e-mail: [email protected]
Ilyina Natalya Anatolyevna, Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov, Ulyanovsk, Russian Federation, Doctor of Biology, Professor, Pro-rector for Scientific Work, e-mail: [email protected]
Фуфаева Татьяна Валентиновна, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова, г. Ульяновск, Российская Федерация, сотрудник учебного управления, e-mail: [email protected]
Fufayeva Tatyana Valentinovna, Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov, Ulyanovsk, Russian Federation, Worker of Study Management, e-mail: [email protected]
Казакова Наталья Анатольевна, Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова, г. Ульяновск, Российская Федерация, ассистент кафедры географии, e-mail: [email protected]
Kazakova Natalya Anatolyevna, Ulyanovsk State Pedagogical University named after I.N. Ulyanov, Ulyanovsk, Russian Federation, Assistant of Geography Department, e-mail: [email protected]
1682
