CC BY
93
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Е.В. Четина
Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва
АКТИВАЦИЯ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ МАТРИКСА И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ХОНДРОЦИТОВ, СОПРОВОЖДАЮЩАЯ ИНДУКЦИЮ РАСЩЕПЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ КОЛЛАГЕНОВОГО ПЕПТИДА В ХРЯЩЕ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
Контакты: Елена Васильевна Четина [email protected]
Цель. Изучить влияние пептида коллагена 2-го типа (СВ12-2), способного индуцировать расщепление коллагена в эксплантатах хряща коленного сустава, активирующее матриксную металлопротеиназу (ММП) и дифференцировку суставных хондро-цитов.
Материал и методы. Эксплантаты хрящей человека культивировали в присутствии СВ12-2 (аминокислотные остатки 195—218) в концентрации 10 мкМ. Расщепление коллагена 2-го типа оценивали, используя иммуноферментный анализ. Для им-муногистохимического анализа коллагена 10-го типа (C0L10A1) использовали криосрезы хряща. Апоптозную активность измеряли методом концевого мечения в области разрыва по dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL). Экспрессию генов определяли посредством полуколичественной полимеразной цепной реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
Результаты. При высоких, но встречающихся в природе концентрациях (10 мкМ) СВ12-2 индуцировал расщепление коллагена 2-го типа коллагеназой в эксплантатах хряща здорового человека. Пептид индуцировал увеличение экспрессии ММП 13, 1, 9, МТ1-ММП, а также генов, ассоциированных с дифференцировкой эмбриональных хондроцитов в ростковой пластинке, — трансформирующего фактора роста (TGF) /31/2, 9-го бокса, определяющего половую область Y(Sox9), индийского ежика (Ihh), пептида, родственного паратироидному гормону (PTHrP), фактора роста фибробластов (FGF) 2; маркера пролиферации циклина В2 и цитокинов фактора некроза опухоли (ФНО) а и интерлейкина (ИЛ) 1р. При этом повышение экспрессии маркера гипертрофии хондроцитов — C0L10A1 — сопровождалось усилением окрашивания на коллаген 10-го типа на криосрезах хряща, а при повышении экспрессии маркера апоптоза — каспазы 3 — увеличивалось количество TUNEL-положительных клеток в поверхностной зоне хряща.
Заключение. В настоящем исследовании показано, что индукция коллагеназной активности в присутствии СВ12-2 в хондроци-тах суставного хряща человека сопровождается терминальной дифференцировкой/гипертрофией этих клеток. Терминальная дифференцировка хондроцитов может быть одним из механизмов разрушения хряща при остеоартрозе, поскольку происходит естественным путем не только при эндохондральной оссификации, но и при развитии патологии.
Ключевые слова: суставной хрящ, экспрессия генов, гипертрофия хондроцитов, коллагеназа, коллаген 2-го типа, пептид
THE ACTIVATION OF MATRIX METALLOPROTEINASES AND CHONDROCYTE DIFFERENTIATION, WHICH ACCOMPANIES THE INDUCTION OF COLLAGEN DECOMPOSITION UNDER THE ACTION OF COLLAGEN PEPTIDE IN THE CARTILAGE OF
HEALTHY INDIVIDUALS E.V. Chetina
Research Institute of Rheumatology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow Contact: Elena Vasilyevna Chetina [email protected]
Objective: To study the effect of type II collagen peptide (CB12-2) that is able to induce the collagen decomposition in the knee articular cartilage explants, which activates matrix metalloproteinase (MMP) and articular chondrocyte differentiation.
Material and methods. Human cartilage explants were cultured in the presence of CB12-2 (amino acid residues 195—218) at a concentration of 10 ^M. Type II collagen decomposition was evaluated by enzyme immunoassay. Immunohistochemical assay of type X collagen (C0L10A1) used frozen cartilage sections. Apoptotic activity was measured by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUPTnick end-labeling method (TUNEL). Gene expressions were determined by semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results. CB12-2 at high, but naturally occurring concentrations (10 ^M) induced type II collagen decomposition by collagenase in the cartilage explants from a healthy individual. The peptide caused an increase in the expression of MMP 13, 1, 9, MT1-MMP, and the genes associated with the differentiation of embryo chondrocytes in the growth plate — transforming growth factor (TGF) fi1/2, sex-determining region Y-box 9 (Sox9), Indian hedgehog (Ihh), parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), fibroblast growth factor (FGF-2); a marker for proliferation of cyclin B2 and cytokines of tumor necrosis factor-a (TNF-a) and interleukin-1fl (IL-1fi). At the same time the increased expression of the chondrocyte hypertrophy marker C0L10A1 was accompanied by enhanced staining for type X collagen in the frozen cartilage sections whereas the number of TUNEL-positive cells increased in the cartilage surface area as the expression of the apoptotic marker caspase 3 became higher.
Conclusion. This study has shown that the induction of collagenase activity by CB12-2 in the human articular cartilage chondrocytes is attended by terminal differentiation/hypertrophy of these cells. The terminal differentiation of chondrocytes may be one of the mechanisms of chondrolysis in osteoarthrosis since it naturally occurs not only in endochondrial ossification, but also in the development of pathology.
Key words: articular cartilage, gene expression, chondrocyte hypertrophy, collagenase, type II collagen, peptide
Остеоартроз (ОА) характеризуется деградацией суставного хряща, при которой происходит разрушение внеклеточного матрикса (ВКМ). Последнее включает повышение активности расщепления коллагена 2-го типа кол-лагеназами [1] и денатурацию этих молекул с экспонированием скрытых эпитопов [2], которые могут иметь определенную биологическую активность. Продукты деградации молекул матрикса могут также влиять на хондроциты и индуцировать как анаболические, так и катаболические процессы в хряще.
Мы недавно показали, что пептид коллагена 2-го типа, состоящий из 24 аминокислот (СВ12-2), может активизировать расщепление коллагена 2-го типа коллагеназой в эксплантатах бычьего суставного хряща [3]. При этом разрушение коллагена пептидом сопровождается активацией генов, участвующих в дифференцировке хондроцитов ростковой пластинки и ответственных за пролиферацию, экспрессию коллагена 10-го типа [4], аннексинов и щелочной фосфатазы, пептида, родственного паратироидному гормону (PTHrP), кальцификацию матрикса и апоптоз терминально дифференцированных хондроцитов [5].
В других наших исследованиях было показано, что образование ранних фокальных ОА-подобных повреждений хряща коленного сустава человека также характеризуется усиленным расщеплением коллагена 2-го типа и сопровождается экспрессией генов, связанных с гипертрофией хондроцитов [6]. Это позволило предположить, что дифференцировка хондроцитов суставного хряща может происходить на ранней стадии развития ОА, а расщепление коллагена может регулироваться теми же факторами, которые используются при дифференцировке хондроцитов ростковой пластинки. Это подтверждается результатами наших недавних исследований [7], показавших, что как разрушение коллагена в суставном хряще при ОА, так и экспрессию генов, характерных для гипертрофной фазы дифференцировки хондроцитов, можно ингибировать действием факторов роста, которые способны подавлять гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки [8].
В данной работе мы показываем, что пептид коллагена 2-го типа (СВ12-2) способен индуцировать экспрессию матриксной металлопротеиназы (ММП) 13 и опосредованное коллагеназой расщепление коллагена 2-го типа, которое сопровождается манифестацией гипертрофных изменений в хондроцитах здорового хряща человека. Более того, изменения, индуцируемые СВ12-2, ингибируются смесью факторов роста, способных подавлять гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки.
Материал и методы
Подготовка суставного хряща
Суставной хрящ дистальной части бедренной кости здоровых людей получали не позднее чем через 16 ч после их скоропостижной смерти в результате автомобильной аварии. В исследовании использовали хрящи 3 индивидов мужского пола 26, 48 и 57 лет. Исследования хрящей этих людей показали сходные результаты, поэтому приведены данные, полученные для одного из них.
Хрящи готовили по общепринятой методике [1]. Хрящи трижды отмывали ДМЕМ-А (Дюльбекко-модифициро-ванной средой Игла-А; Life Technologies), содержащей также 20 ммоль/л буфера HEPES, рН 7,4; 45 ммоль/л NaHCO3; 100 ед/мл пенициллина; 100 ед/мл стрептомицина и 150 мкг/мл гентамицина сульфата. Суставной хрящ, срезанный с кости, разрезали на кубики размером 2x2x2 мм. 50—70 мг
(5—7 кубиков) предварительно культивировали на планшетах (48 лунок от Costar 3548) в течение 48 ч при 37 °С в 1 мл ДМЕМ-А в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2. Культивирование хрящевых эксплантатов Среду меняли через 48 ч (следующий после смены среды день считали началом опыта, день 0), а затем — через каждые 4 дня. В работе использовали синтетический пептид, описанный нами ранее [3] и представляющий собой фрагмент коллагена 2-го типа (аминокислотные остатки 195-218) GERGPP*GPQGARGFP*GTP*GLP*GVK (где * означает оксипролин). Пептид СВ 12 добавляли в среду также при каждой ее смене в концентрации 10 мкМ.
Хрящи (каждый опытный вариант в 3 повторностях) культивировали 16 дней. Культуральную среду меняли каждые 4 дня и собирали ее при каждой смене, а затем хранили при -20 °С до использования. По окончании опыта в образцах измеряли активность расщепления коллагена. Для анализа экспрессии генов эксплантаты культивировали 1, 4, 8 и 12 дней и анализировали, как описано ниже.
Для проверки присутствия эндотоксина в препаратах пептида СВ12-2 использовали набор для определения эндотоксина (Sigma). При этом оказалось, что найденные уровни эндотоксина 1-2 нг/мл значительно ниже концентраций (1,0 мкг/мл), необходимых для индукции разрушения хряща [9].
Определение активности расщепления коллагена 2-го типа коллагеназой с использованием фермент-зависимого иммуносорбентного метода (ELISA)
После 16 дней культивирования эксплантаты хрящей экстрагировали а-химотрипсином, чтобы перевести в раствор, не переваривая, денатурированный коллаген, включая карбокситерминальный неоэпитоп COL2-3/4C (C1,2C), образуемый при расщеплении коллагена 2-го типа коллагена-зой. Его содержание в культуральной среде и а-химотрип-синовом экстракте хряща определяли посредством ELISA [3]. Суммарный неоэпитоп расщепления в хряще и среде рассчитывали суммированием данных анализа каждого образца среды и экстракта хряща. Результаты выражали в пикомолях эпитопа на 1 мг сырой массы хряща. Молекулярная масса стандартного пептида эпитопа равна 608 Да.
Подготовка криосрезов хряща. Фрагменты хряща человека в конце культивирования замораживали в ОСТ-реагенте и готовили срезы толщиной 7,5 мкм с использованием криостата. Далее эти срезы фиксировали 5 мин в 4% растворе параформальдегида, отмывали фосфатно-солевым раствором (PBS) в течение 15 мин и блокировали непрореагировавшие альдегидные группы в растворе с 1% нормальной кроличьей сывороткой в PBS в течение 15 мин. Активность эндогенной пероксидазы блокировали инкубированием срезов в свежеприготовленном 0,5% растворе Н2О2 в абсолютном метаноле в течение 10 мин. Для увеличения проницаемости внеклеточного матрикса хондроитин сульфат удаляли обработкой срезов хондроитиназой АВС (ICN/Flow Laboratories) с активностью 0,0125 ед/50 мкл на один срез в 0,1 М трис-ацетатном буфере с рН 7,6 в течение 90 мин при 37 °С во влажной камере. После 3-кратной отмывки по 15 мин в PBS срезы инкубировали в растворе 0,2 М ЭДТА в 50 мМ Трис-НС1 буфере при рН 7,6 в течение 1 ч при комнатной температуре для удаления всех кальциевых отложений в образцах. Далее срезы отмывали 15 мин в PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA).
Локализация коллагена 10-го типа Срезы инкубировали 30 мин при комнатной температуре во влажной камере с добавлением по 50 мкл на срез разве-
денного раствора моноклональных антител домена NCl коллагена 10-го типа [10] (асцитная жидкость, разведенная 1:100) или, в качестве контроля, с неиммунной асцитной жидкостью, каждый из которых разводили PBS, содержащим 1% в/о BSA. Другим специфическим контролем служила преадсорб-ция разведенных антител соответствующим им иммунизирующим пептидом. Срезы отмывали PBS, содержащим 0,1% в/о BSA, 3 раза по 10 мин. ^стему детекции биотин-стрептави-дин (Amersham) использовали в соответствии с рекомендациями производителя. Эта система состояла из кроличьих анти-мышиных меченных биотином F(ab’)2 иммуноглобулинов (Ig) и стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой в качестве индикатора. Биотинилированные антимышиные F(ab’)2 кролика разводили в PBS, содержащем 1% в/о BSA, добавляли по 50 мкл на срез и инкубировали в течение 30 мин. После отмывания в не содержащем азида PBS срезы обрабатывали по 50 мкл на срез разведенным стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой в не содержащем азида PBS с 1% BSA в течение 20 мин при комнатной температуре. После развития пероксидазной реакции продукт усиливали, используя метод медно-НЮ2/серебряной интенсификации [11]. Далее готовили перманентные препараты.
Выявление апоптозных клеток
Для выявления клеток, погибших в результате апоп-тоза, использовали систему TUNEL (Roche Diagnostics) в соответствии с инструкциями производителя. При этом на участках однонуклеотидных разрывов (nicks), производи-
мых терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT), dUTP метили флюоресцеином. Для этого использовали криосрезы хряща человека, приготовленные как описано выше. Разведения реагентов, предварительную обработку и условия проявления тщательно отрабатывали во избежание ложноположительных результатов. Для этой цели использовали продольные срезы эмбриональной ростковой пластинки быка, где в поздней гипертрофной фазе хондроциты погибают вследствие апоптоза и могут служить положительным контролем, а прегипертрофные хон-дроциты — отрицательным контролем.
Для пермеабилизации клеток срезы инкубировали в 1х IC Perm-буфере, содержащем 0,1% сапонина (BioScience International), в течение 1 ч на льду. После этого проводили TUNEL-реакцию. Ядра окрашивали бромистым этидием в концентрации 25 мкг/мл в 5% в/о ЭДТА в дистиллированной воде, содержащей 0,005% азида натрия в качестве консерванта. Тканевые срезы окрашивали в течение 2 мин и отмывали дистиллированной водой в течение 5 мин. Срезы фиксировали с использованием реагента Vestashield Mounting Medium H-1000 (Vector). Флюоресцеи-новые метки детектировали с использованием флюоресцентного микроскопа.
Выделение общей РНК, обратная транскрипция (ОТ)
РНК выделяли из эксплантатов ОА хрящей после их культивирования в течение 1, 4, 8 или 12 дней по общепринятой методике [7]. В реакции обратной транскрипции ис-
Таблица 1
Последовательности праймеров, использованные в работе
Коллагеназа 3 (MMП 13): D(1241 — 1259)GATAAAGACTATCCGAGAC, R(1369-1386) GAGTAACCGTATTGTTCG
Meмбpaнного типа 1 MMП (МП-ММП): D (833-850) GCATCCAGCAACTTTATG, R (951—970) CATCTGTGACGGGAACTTTG
MMП 1: D (1095-1114) CA AAGGGAATAAGTACTGGG, R (1211-1232) CTGAGGAAAACACTGGAAAAAC
Желатиназа B (MMП 9): D (139-156) GCAGAGGAATACCTGTAC, R (361-377) CACAACATCACCTACTG
Коллаген 10-го (X) типа (COL10A1): D (213-232) CTGAGCGATACCAAACACC, R (297-319) GTAAAGGTGTATCACTGAGAGG
Циклин B2: D (932-949) GTTGACTATGACATGGTG; R (1272-1290) GTTCGTGCACTTTGTCTTG
Граис-формирующий ростовой фактор P1 (TGF P1): TGFb1-D (126-143) GGCAACAAAATCTATGAC, TGFb1-R (471-490) CTTCAAGTGGACATTAACGG
Tpaнсфоpмиpующий ростовой фактор p2 (TGF p2): TGFb2-D (943-962) GATTTGACGTCTCAGCAATG, TGFb2 (1324-1343) CATATACCAGTGGTGATCAG
Indian hedgehog (Ihh):
IHH-D (476-494) CAGGTCATCGAGACTCAGG, IHH-R (773-789) GCTCAGTTGGCCTTCTG
Основной ростовой фактор фибробластов (bFGF, FGF-2): bFGF-D (975-994) GGCACACATTAATCTACATG, bFGF-R (1262-1282) CCACT CACACTTTAAGCATT C
Пептид, родственный паратироидному гормону (PTHrP): PTHrP-D (233-253) GAAATCAGAGCTACCTCGGAG;
PTHrP-R (317-336) GATGAGGGCAGATACCTAAC
Sox-9: Sox9-D (21-39) CATGAAGATGACCGACGAG, Sox9-R (283-303) GTCAACGGCTCGAGCAAGAAC
Каспаза 3: D (262-282) CTGGTACAGATGTCGATGCAG; R (581-600) CATTGAGACAGACAGTGGTG
Интерлейкин 1p (ИЛ 1p): D (710—728) GGAAAAGCGATTTGTCTTC, R (844-863) GCCAGGATATAACTGACTTC
Фактор некроза опухоли а (ФНО а): D (633-650) GTCTCCTACCAGACCAAG, R (816-837) GAGTCTGGGCAGGTCTACTTTG
Глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH):
G3PDH-D (605-628) GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC, G3PDH-R (927-950) AGCTCATTTCCTGGTATGAC
Рис. 1. Индукция активности расщепления коллагена 2-го типа в среде (а) и при объединении среды и хряща (б) в эксплантатах хряща здорового мужчины 26лет
пользовали суммарную РНК хряща и проводили ее по общепринятой методике [7].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Олигонуклеотидные последовательности праймеров, использованные в работе, представлены в табл. 1. ПЦР проводили как описано ранее [7]. GAPDH (глицеральде-гидфосфат дегидрогеназу) использовали в качестве эндогенного контроля. Используя серийные разведения сДНК при амплификации, следили, чтобы интенсивность полос на геле не превышала уровень насыщения. Для предотвращения вариаций по эффективности в разных экспериментах во всех образцах одновременно проводили ОТ и ампли-фицировали в ПЦР
Статистический анализ
Данные количественных экспериментов представлены как среднее арифметическое ± стандартная вариация. Анализы проводили в 3 повторностях. Тест на нормальность показал, что результаты соответствовали кривой распределения Гаусса. Для статистической обработки результатов использовали тесты Манна—Уитни и парный тест Стьюдента (t-тест). Значения вероятности ошибки <0,05 считались достоверными.
Результаты
Индукция расщепления коллагена 2-го типа под действием пептида СВ12-2. Ранее мы показали, что СВ12-2 способен индуцировать расщепление коллагена коллагеназой в эксплантатах хряща взрослых быков [3]. Для проверки, оказывает ли данный пептид аналогичное действие на хря-
Дни
СВ12-2
l 4
+ - +
8 l2 + - +
COL X ММП 9 TGF в1 Ihh ММП 1З SOX 9 Каспаза З
TGF /32 PTHrP bFGF Циклин В2
ММП 1 МТ1-ММП ИЛ 1в ФНО а GAPDH
Рис. 2. Влияние пептида СВ12-2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща здорового мужчины 26 лет
щи человека, эксплантаты хряща коленного сустава культивировали в присутствии СВ 12-2, что сопровождалось повышением активности расщепления коллагена 2-го типа (рис. 1). При этом значительно более высокое накопление эпитопов, образующихся при расщеплении коллагена 2-го типа коллагеназой, происходило как в среде, так и в самой хрящевой ткани по сравнению с контрольными образцами, инкубируемыми в отсутствие пептида.
Влияние пептида СВ12-2 на экспрессию генов в эксплантатах хряща человека. Повышение расщепления коллагена 2-го типа при культивировании эксплантатов хряща в присутствии СВ12-2 сопровождалось увеличением экспрессии ММП 13, 9, 1, МТ1-ММП, маркера гипертрофии — коллагена 10-го типа, маркера пролиферации циклина В2, цитоки-нов интерлейкина (ИЛ) 1|3, фактора некроза опухоли (ФНО) а, сопутствующих воспалительному процессу, каспазы 3, свидетельствующей о готовности клеток к апоптозу, и факторов роста: трансформирующего фактора роста (TGF) |31 и |32, пептида, родственного паратироидному гормону (РТНгР), фактора роста фибробластов (FGF) 2, индийского ежика (ШИ), активирующихся в хондроцитах пролиферативной и гипертрофной зон ростковой пластинки в процессе эндо-хондральной оссификации (рис. 2). Увеличение экспрессии наблюдалось начиная с 1-х суток инкубации в присутствии пептида и продолжалось в течение 12 дней. При этом повышение экспрессии ряда генов было конститутивным (COL10A1, МТ1-ММП, TGF |32). Напротив, экспрессия отдельных генов повышалась кратковременно (TGF |31 — только на 4-е сутки). А в случае некоторых генов наблюдали несколько максимумов экспрессии: для ШИ — на 1-е и 8-е сутки, для цитокинов ИЛ 1, ФНО а, ММП 9, 13, 1, 9-го бокса,
Контроль СВ12-2
Рис. 3. Локализация коллагена 10-го типа в эксплантатах хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ12-2 в течение 8 дней
Рис. 4. Формирование апоптозных клеток в поверхностной зоне эксплантата хряща человека, культивируемых в присутствии пептида СВ12-2
определяющего половую область Y (SOX 9), пептида, родственного пара-тироидному гормону (PTHrP), фактора роста фибробластов (FGF) 2, цик-лина В2 — на 1, 8 и 12-й день. Экспрессия каспазы 3 значительно усиливалась на 1-й и 4-й дни, а при дальнейшем культивировании слабо отличалась от контрольных образцов.
Локализация коллагена 10-го типа. Повышение экспрессии гена C010A1 сопровождалось также повышенным синтезом соответствующего белка. В частности, на рис. 3 представлена локализация коллагена 10-го типа в эксплантате хряща человека на 8й день его культивирования при добавлении пептида СВ12-2. В отличие от контрольного образца, в присутствии СВ12-2 происходило окрашивание зоны матрикса хряща вблизи его поверхности, причем более темная окраска, свидетельствующая о более высокой концентрации коллагена 10-го типа, наблюдалась вокруг хондроцитов.
Локализация апоптозной активности. Повышенная экспрессия кас-пазы 3 в эксплантатах суставного хряща в присутствии пептида СВ12-2 сопровождалась усилением апоптозной активности в хондроцитах. При этом в первые дни культивирования никаких изменений не происходило (рис.
4). Однако на 12-й день апоптозные клетки появлялись вблизи поверхности эксплантата хряща, в зоне локализации коллагена 10-го типа.
Ингибирование активности расщепления коллагена, индуцированного пептидом СВ12-2, смесью факторов роста. Ранее мы показали, что расщепление коллагена 2-го типа в эксплантатах хрящей больных ОА можно подавить смесью факторов роста (GF): TGF |32, FGF 2 и инсулина, которые ранее использовались для ингибирования гипертрофии эмбриональных хондроцитов [7].
Поскольку под действием пептида СВ12-2 присходило усиление расщепления коллагена, а также наблюдалось повышение экспрессии генов, ассоциированных с дифференцировкой хондроци-тов, мы предположили, что эти изменения сходны с теми, что происходят в хряще при ОА. Поэтому повышенную активность расщепления коллагена можно подавить смесью факторов роста (GF), блокирующих разрушение коллагена и гипертрофный фенотип в хряще больных ОА.
Оказалось, что добавление смеси факторов роста (GF): TGF |32, FGF 2 и инсулина — в среду, содержащую CB12-2, при культивировании эксплантатов хрящей человека действительно приводило к ингибированию активности расщепления коллагена до его уровня в контрольных
эксплантатах (рис. 5). При этом добавление смеси ростовых факторов к контрольным эксплантатам не приводило к значительному изменению коллагеназной активности.
Подавление смесью факторов роста экспрессии генов, индуцированных пептидом СВ12-2. Анализ экспрессии генов в эксплантатах хряща человека, культивируемых с пептидом СВ12-2 в присутствии или без GF, показал, что в 1-е сутки после добавления GF происходит подавление экспрессии всех исследованных протеиназ (ММП 13, 1, 9), цитокинов (ИЛ 1|3 и ФНО а) и белков, сопряженных с гипертрофией хондроцитов (коллагена 10-го типа, каспазы 3,
о
к
ия
ени
епле
щ
с
а
р
о
вно
и
т
к
14
12 :
1O
Контроль СВ12-2 СВ12-2 GF + GF
Рис. 5. Подавление коллагенолитического действия пептида СВ12-2 смесью факторов роста (GF) в культуре эксплантатов хряща здорового мужчины 26 лет
Рис. 6. Ингибирование экспрессии генов, индуцированных пептидом СВ12-2, посредством факторов роста (GF)
8
б
4
2
O
SOX 9 и ростовых факторов TGF |32, FGF 2 и PTHrP), индуцированных пептидом СВ12-2 (рис. 6). На 4-е сутки повышенная действием пептида СВ 12-2 экспрессия генов, ассоциированных с терминальной дифференцировкой хондроцитов, коллагена 10-го типа и каспазы 3, по-прежнему ингибировалась смесью факторов роста. Вместе с тем смесь факторов роста повышала экспрессию TGF |32 и PTHrP, которые, как показано выше, сами способны подавлять гипертрофию хондроцитов.
Обсуждение
Интенсивное расщепление коллагена коллагеназами хондроцитов происходит как на ранних этапах образовании ОА-подобных повреждений [6, 12], так и при идиопа-тическом ОА [1, 13—15]. При этом коллагенолиз связан с повышением экспрессии генов, участвующих в терминальной дифференцировке (гипертрофии) хондроцитов [6, 7, 16]. Эти изменения сопровождаются значительным увеличением содержания денатурированного коллагена 2-го типа, состоящего из коротких пептидов [17]. Пептид, который мы исследовали в данной работе, экспонируется в больших количествах (10—25 мкМ) в хряще больных ОА [3, 17], т. е. в той концентрации, при которой мы наблюдали его активность in vitro.
Усиленная резорбция коллагена матрикса, связанная с гипертрофией хондроцитов и приводящая к расщеплению коллагена 2-го типа, происходит и в ростковой пластинке [18]. Это также сопровождается увеличением содержания денатурированного коллагена 2-го типа. При этом ингибирование коллагеназы ММП 13, ответственной за расщепление коллагена в суставном хряще [14] и ростковой пластинке, может предотвращать гипертрофию хон-дроцитов ростковой пластинки [19]. Поэтому мы предположили, что усиленное расщепление коллагена 2-го типа коллагеназой, которое индуцируется в нормальном суставном хряще СВ12-2, может также быть связано с терминальной дифференцировкой (гипертрофией) хондроцитов. Недавно мы показали, что это действительно происходит в культуре эксплантатов бычьего суставного хряща. В данном исследовании мы наблюдали, что аналогичные изменения происходят также в культуре эксплантатов хряща человека: пептид СВ12-2 индуцировал расщепление коллагена 2-го типа, которое сопровождалось экспрессией маркера гипертрофии — коллагена 10-го типа и апоптозом хондроцитов в поверхностной зоне хряща, там, где наблюдаются первичные изменения в хряще при ОА.
Наши результаты свидетельствуют о том, что ко-триггером экспрессии гипертрофного фенотипа может быть усиленная денатурация коллагена 2-го типа и что хондроциты поддерживают свой предгипертрофный фенотип, когда они контактируют с матриксом, обогащенным нативным коллагеном 2-го типа. Но как только происходит усиленная денатурация этого коллагена, экспонируются криптические последовательности и клетки отвечают тем, что приступают к следующему этапу гипертрофной дифференцировки, завершающейся апоптозом.
Изменения, индуцируемые пептидом, происходят в поверхностной зоне хряща, как и в случае развития ОА. При ОА наблюдается увеличение объема хондроцита [20], что свойственно и гипертрофным хондроцитам ростковой пластинки, а также появление повышенного количества денатурированного коллагена 2-го типа [17], окрашивание на коллаген 10-го типа [4, 26], продукция аннексинов 2, 5, 6 и 8 [20, 21], кластерина, пролиферативного клеточного ядерного
антигена (РСNА), синдекана 3 и щелочной фосфатазы [21]. Продукции этих белков не наблюдается в здоровом хряще.
Поскольку общими чертами между разрушением коллагена 2-го типа при ОА и в гипертрофной зоне первичной ростковой пластинки являются повышение активности расщепления коллагена 2-го типа коллагеназами и экспрессия генов, связанных с гипертрофией хондроцитов [18, 23], неудивительно, что снижение активности расщепления коллагена 2-го типа индуцируется теми же факторами роста, которые подавляют гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки в культуре клеток [8].
В нашем исследовании GF ингибировали экспрессию ИЛ 1 и ФНО а, которые, как и остальные исследованные гены, а именно СОЬІОАІ, ММП 13, 9, РТНгР, обычно не экспрессируются в нормальном суставном хряще [24]. При этом подавление экспрессии цитокинов ИЛ 1|3 и ФНО а важно, поскольку они являются катаболическими факторами при ОА, а ингибирование этих цитокинов приводит к подавлению коллагеназной активности в хряще при ОА [25].
Заключение
Таким образом, наши исследования показали, что пептид коллагена 2-го типа способен вызывать повышенное расщепление коллагена в эксплантатах хряща человека, которое сопровождается экспрессией белков, в норме участвующих в дифференцировке эмбриональных хондроцитов. Коллагенолитическую активность, экспрессию провоспалительных цитокинов ИЛ 1|3 и ФНО а и гипер-трофного фенотипа суставных хондроцитов, индуцированные пептидом, можно подавить факторами роста, способными ингибировать гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки. Поэтому взаимодействие пептида с эксплантатами хряща человека может являться модельной системой развития остеоартрозных изменений в хряще человека. Поскольку факторы роста могут играть роль, которая благоприятствует предгипертрофному фенотипу, лекарственные препараты, способные регулировать дифференциров-ку хондроцитов, могут быть эффективны при лечении разрушения хряща у больных ОА.
ЛИТЕРАТУРА
1. Billinghurst R.C., Dahlberg L., Ionescu M. et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic cartilage. J Clin Invest 1997;99:1534-45.
2. Hollander A.P., Pidoux I., Reiner A. et al. Damage to type II collagen in aging and osteoarthritis starts at the articular surface, originates around chondrocytes and extends into the cartilage with progressive degeneration. J Clin Invest 1995;96:2859-69.
3. Yasuda T., Tchetina E., Ohsawa K. et al. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of type II collagen and aggrecan in articular cartilage. Matrix Biol 2006;25:419-29.
4. Von der Mark K., Kirsh T., Nerlich A. et al. Type X collagen synthesis in human osteoarthritic cartilage. Arthr Rheum 1992;35:806-11.
5. Poole A.R. Cartilage in health and disease. In: Koopman W.J., Moreland L.W. (eds). Arthritis and Allied Conditions. A Textbook of Rheumatology, 15 th ed. Philadelphia: Lippincott, Williams&Wilkins, 2005;223-69.
6. Tchetina E.V., Squires G., Poole A.R. Increased type II collagen degradation and very early focal cartilage degeneration is associated with the upregulation of chondrocyte differentiation related genes in early human articular cartilage lesions. J Rheumatol 2005;32:876-86.
7. Tchetina E.V., Antoniou J., Tanzer M. et al. Growth factors capable of suppressing chondrocyte hypertrophy arrest collagen cleavage in human osteoarthritic cartilage. Am J Pathol 2006;168:131-40.
8. Szuts V., Mollers U., Bittner K. et al. Terminal differentiation of chondrocytes is arrested at distinct stages identified by their expression repertoire of marker genes.
Matrix Biol 1998;17:435-48.
9. Morales T.I., Wahl L.M., Hascall V.C. The effect of bacterial lipopolysaccharides on the biosynthesis and release of proteoglycans from calf articular cartilage cultures. J Biol Chem 1984;259:6720-9.
10. Van der Kraan P.M., Vitters E.L., Meijers T.H. et al. Collagen type I antisense and collagen type IIA messenger RNA is expressed in adult murine articular cartilage.
Osteoarthr Cartilage 1998;6:417-26.
11. Gallyas F., Merchenthaler I. Copper-H2O2 oxidation strikingly improves silver intensification of the nickel-diaminobenzi-dine (Ni-DAB) end-product of the peroxidase reaction. J Histochem Cytochem 1988;36:807-10.
12. Aurich M., Squires G.R., Reiner A. et al. Differential matrix degradation and turnover in early cartilage lesions of human knee and ankle joints. Arthr Rheum 2005;52:112-9.
13. Wu W., Billinghurst R.C., Pidoux I. et al. Sites of collagenase cleavage and denatura-tion of type II collagen in aging and osteoarthritic articular cartilage and their relationship to the distribution of matrix metalloproteinase 1 and matrix metallopro-teinase 13. Arthr Rheum 2002;46:2087-94.
14. Dahlberg L., Billinghurst R.C., Manner P. et al. Selective enhancement of collage-nase-mediated cleavage of resident type II collagen in cultured osteoarthritic cartilage and arrest with a synthetic inhibitor that spares collagenase 1 (matrix metallopro-teinase 1). Arthr Rheum 2000;43:673-82.
15. Squires G.R., Pidoux I., Okouneff S. et al. The development of focal lesions in ageing human articular cartilage involves molecular changes in type II collagen and aggrecan characteristic of osteoarthritis. Arthr Rheum 2002;48:1261-70.
16. Sandel L.J., Aigner T. Articular cartilage and changes in arthritis. An introduction: Cell biology of osteoarthritis. Arthr Res 2001;3:107-13.
17. Hollander A.P., Heathfield T.F., Webber C. et al. Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay. J Clin Invest 1994;93:1722-32.
18. Mwale F., Tchetina E., Wu C.W. et al.
The assembly and remodeling of the extracellular matrix in the growth plate in relationship to mineral deposition and cellular hypertrophy: an in situ study of collagens II and IX and proteoglycan. J Bone Miner Res 2002;17:275-83.
19. Wu W., Tchetina E., Mwale F. et al. Proteolysis involving MMP-13 (collagenase-3) and the expression of the chondrocyte hypertrophic phenotype. J Bone Miner Res 2002;7:639-51.
20. Bush P.G., Hall A.C. The volume and morphology of chondrocytes within nondegenerate and degenerate human articular cartilage. Osteoarthr Cartilage 2003;11:242-51.
21. Pfander D., Swoboda B., Kirsch T. Expression of early and late differentiation markers (proliferating cell nuclear antigen, syndecan-3, annexin VI, and alkaline phosphatase) by human osteoarthritic chondrocytes. Am J Pathol 2001;159:1777-83.
22. Kirsch T., Swoboda B., Nah H. Activation of annexin II and V expression, terminal differentiation, mineralization and apoptosis in human osteoarthritic cartilage. Osteoarthr Cartilage 2000;8:294-302.
23. Tchetina E., Mwale F., Poole A.R. Distinct phases of coordinated early and late gene expression in growth plate chondrocytes in relationship to cell proliferation, matrix assembly, remodeling, and cell differentiation. J Bone Miner Res 2003;18:844-51.
24. Aigner T., McKenna L. Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage. Cell Mol Life Sci 2002;59:5-18.
25. Kobayashi M., Squires G.R., Mousa A. et al. Role of interleukin-1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage. Arthr Rheum 2005;52:128-35.
26. Boos N., Nerlich A.G., Wiest I. et al. Immunohistochemical analysis of type-X-collagen expression in osteoarthritis of the hip joint. J Orthop Res 1999;17:495-502.
Поступила 13.03.2010
