CC BY
86
Медицинская иммунология 2000, Т. 2, №1, стр 59-64 © 2000, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
АКТИВАЦИЯ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ОКОЛОНОСОВЫХ ПАЗУХ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГНОЙНЫМ РИНОСИНУСИТОМ ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ПРИМЕНЕНИИ БЕТАЛЕЙКИНА
*Азнабаева Л.Ф., Арефьева Н.А. *Кильсенбаева Ф.А. **Симбирцев А.С.
Кафедра оториноларингологии Башкирского медицинского университета, г.Уфа *Иммунологическая лаборатория Республиканской клинической больницы им.Г.Г.Куватова, г. Уфа
**Лаборатория иммунофармакологии ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург
Резюме. Проведено исследование состояния местного иммунитета у 36 больных хроническим гнойным риносинуситом, не поддающихся традиционным методам терапии. Для лечения больных был использован препарат рекомбинантного IL-ip - Беталейкин, который вводили ежедневно внутривенно капельно из расчета 5 нг/кг веса, курс лечения составил пять суток. Состояние нейтрофилов, полученных непосредственно из воспалительного очага, и уровень цитокинов в промывной жидкости синусов оценивали в динамике до лечения, после 1, 2 и 3 инъекции, а также после лечения. Установлено, что внутривенное введение Бета-лейкина оказывает стимулирующее влияние на состояние местного иммунитета слизистой оболочки околоносовых пазух, связанное с активацией практически всех функций лейкоцитов непосредственно в очаге воспаления. Выздоровление больных ХГРС при лечении Беталейкином прямо коррелирует со степенью активации функций лейкоцитов воспалительного очага.
Ключевые слова: хронический гнойныйриносинусит, нейтрофилы, цитокины, рекомбинантный интерлейкин-ip человека
*Aznabaeva L.F., Arefyeva N.A., *Kilsenbaeva F.A., **Simbirtsev A.S.
ACTIVATION OF LOCAL IMMUNITY OF THE PARANASAL SINUSES IN PATIENTS WITH CHRONIC PURULENT RHINOSINUSITIS AFTER INTRAVENOUS APPLICATION OF BETALEUKIN
Abstract. The local immune function of 36 patients with rhinosinusitis resistant to traditional methods of therapy was investigated. Patients were treated with human recombinant IL-ip - Betaleukin applied like a course of 5 daily intravenous injections at a dose 5 ng/kg of body weight. The functional activity of neutrophils isolated from the inflamatory site and the level of cytokines in the sinus washes were studied before treatment, after i, 2 and 3 injections and also after the whole treatment. It was shown that the intravenous injections of IL-ip produced immunostimulating effect on the immune condition of the tunica mucosa of paranasal sinuses and activated nearly all functions of leukocytes directly in the inflammatory lesion. The results of the treatment of patients with chronical purulent rhinosinusitis with Betaleukin directly correlate with the level of functional activation of leko-cytes within the inflammatory site. (Med. Immunol., 2000, vol. 2, № 1, pp 59-64)
Адрес для переписки: Азнабаева Лилия Фаритовна
450076, Башкортостан, Уфа, ул. Достоевского, 132, Республиканская клиническая больница им. Г.Г.Куватова, иммунологическая лаборатория Тел.: (3472) 22-62-23
Введение
Проблема воспаления носа и околоносовых пазух является одной из актуальных проблем клинической оториноларингологии. Хронические ри-носинуситы, сопровождаемые накоплением гнойных масс в пазухах, характеризуются длительным течением, способствуют ухудшению качества жизни и создают условия для развития риногенных внутричерепных осложнений. Известно, что в патогенезе хронических гнойных риносинуситов лежат изменения в различных звеньях иммунитета, особенно в состоянии местной иммунной системы [2,5,10]. В то же время доказано, что длительно протекающие воспалительные процессы на слизистой носа и око-лоносовых пазух приводят к вторичным имму-нодефицитным состояниям и угнетению местных защитных механизмов [12], и создается порочный круг развития заболевания, который организм больного сам не может преодолеть.
Наряду с этим, традиционные методы лечения хронических гнойных риносинуситов, включающие в себя хирургическое вмешательство, применение антибиотиков и гормонов, способствуют усугублению иммунодефицитного состояния и, в том числе, нарушают естественное течение местных защитных механизмов [5,9].
Важную роль в развитии адекватного местного иммунного ответа на внедрение инфекции играют цитокины, запускающие каскад реакций, направленных на обнаружение, уничтожение и удаление повреждающего агента. Продукция провоспали-тельных цитокинов (TNF-a, IL-1, IL-8) служит первым звеном активации неспецифической резистентности и затем специфического иммунного ответа [8]. Одним из основных провоспалительных медиаторов, которые контролируют все этапы воспалительной реакции, является IL-1ß. Кроме того, IL-1ß обладает стимулирующим влиянием на рост и метаболизм соединительной ткани и регулирует регенерацию в очаге воспаления [6,13]. Учитывая характеристики IL-1 ß и его иммуностимулирующие возможности, для лечения больных хроническим гнойным риносинуситом был выбран лекарственный препарат на основе рекомбинатного IL-1ß -Беталейкин (пр-во ГосНИИ ОЧБ, Санкт-Петербург).
В настоящей работе изучены механизмы иммуностимулирующего влияния Беталейкина при внутривенном введении на состояние местного иммунитета у лиц, страдающих хроническим гнойным ри-носинуситом (ХГРС).
Материалы и методы
Исследование состояния местного иммунитета проведено у 36 больных хроническим гнойным ри-носинуситом в возрасте от 20 до 56 лет. Критериями
для отбора больных являлось затяжное, склонное к хронизации течение гнойного воспалительного процесса в околоносовых пазухах и отсутствие положительной клинической картины после традиционных методов терапии. Беталейкин вводили ежедневно внутривенно капельно из расчета 5 нг/кг веса, курс лечения составил пять суток.
Для иммунологического исследования брали венозную кровь с добавлением 20 ед/мл гепарина и содержимое околоносовых пазух, которое ежедневно получали по трансназальному катетеру путем промывания пазух физиологическим раствором в объеме 10 мл (до лечения, после 1, 2 и 3 инъекции Беталейкина и через день после окончания курса лечения).
Нейтрофилы периферической крови выделяли на двойном градиенте фиколл-верографин [11]. Из содержимого околоносовых пазух нейтрофилы получали путем 10-минутного центрифугирования при 1500 об/мин с последующим двукратным отмыванием фосфатно-солевым буфером, рН=7,2-7,4 (PBS). Супернатанты отбирали в микропробирки и хранили при -86°С.
Исследование функциональной активности ней-трофилов проводили путем определения адгезионной способности [7], фагоцитарной активности с частицами латекса [1] с расчетом фагоцитарного числа (процент фагоцитирующих нейтрофилов) и фагоцитарного показателя (среднее количество поглощенных частиц в одном активном нейтрофиле) и метаболической активности в НСТ- тесте (спонтанном и стимулированном частицами латекса) на стеклах [4].
Цитологический состав оценивали по методу, предложенному Л.А.Матвеевой [3], с учетом степени повреждения исследуемых клеток. При этом рассчитывали средний показатель деструкции клеток, СПД=(1^п1+2^п2+3^п3+4^п4)/100, индекс деструкции клеток ИДК=(п1+п2+п3+п4)/100, индекс цитолиза клеток ИЦК=п4/(п0+п1+п2+п3+п4), где п0 -число клеток нулевого класса деструкции, п1 -число клеток первого класса деструкции, п2 - второго класса , п3 - третьего класса и п4 - четвертого класса.
Исследование содержания цитокинов IL-1ß, IL-
8, TNF-a в супернатантах промывных вод проводили методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем ООО “Цитокин” (С-Петербург).
Результаты
Результаты внутривенного применения Беталейкина у больных ХГРС показали его высокую клиническую эффективность. У 34 больных из 36 на вторые-третьи сутки применения препарата наблюдали очищение промывных вод от гнойных масс, сокращение отечности слизистой
Таблица 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И ПРОМЫВНЫХ ВОД ОКОЛОНОСОВЫХ ПАЗУХ БОЛЬНЫХ С ХРОНИЧЕСКИМИ ГНОЙНЫМИ РИНОСИНУСИТАМИ ДО ЛЕЧЕНИЯ
Показатели Исследуемый материал Досто-
нейтрофилы периферической крови (n=36) нейтрофилы промывных вод (n=36) верность различий (p)
Фагоцитарное число, % 54,29±5,06 40,52±3,63 <0,05
Фагоцитарный показатель 5,51±0,41 5,12±0,44 >0,05
НСТ-положительные клетки (спонтанный НСТ-тест), % 10,88±0,7 43,24±4,83 <0,001
НСТ-положительные клетки (стимулированный НСТ-тест), % 14,47±0,87 33,5±4,45 <0,001
Индекс стимуляции в НСТ-тесте (НСТ стим./ НСТ спонт.) 1,37±0,09 0,86±0,1 <0,001
Адгезия, % 7,43±2,57 7,64±2,64 >0,05
носа, рост грануляционной ткани и уменьшение сроков заживления раны. У двух больных не было отмечено достоверных изменений клинической картины.
Проведение сравнительной комплексной оценки функционального состояния нейтрофилов, полученных из венозной крови и из промывных вод до лечения, показало отличия в параметрах, характеризующих фагоцитарную и метаболическую активность фагоцитов (табл.1). При этом адгезионная способность фагоцитов практически не отличалась. Показатели фагоцитарной активности у клеток периферической крови были выше, чем у нейтрофилов, полученных из промывных вод. В то же время отмечалось, что метаболическая активность (НСТ-тест) фагоцитов в воспалительном очаге значительно выше, чем у клеток, находящихся в кровяном русле. Индекс стимуляции в НСТ-тесте нейтрофилов периферической крови был более 1,0, что достоверно выше, чем у клеток промывных вод (р<0,001).
При цитологическом анализе промывных вод было установлено, что клеточный состав в основном представлен нейтрофилами (>80%) различной степени деструкции. Отмечена зависимость степени деструкции от сроков лечения. У лиц с положительной клинической динамикой показатели деструкции нейтрофилов увеличиваются после первой инъекции Беталейкина (СПД с 1,26±0,1 до 1,51±0,13, р>0,05 и ИДК с 0,68±0,04 до 0,81±0,04, р<0,05). Соотношение количества лейкоцитов к количеству клеток эпителия (лейко-эпителиальный индекс) начинает снижаться уже после второй инъекции (с 64,48 ± 7,19 до лечения до 30,51±15,31 после второй инъекции, р<0,05) и соответствует фазе резкого сокращения гнойного содержимого в промывных водах.
Изучение в динамике функциональной активности нейтрофилов промывных вод у больных показало, что применение Беталейкина оказало стимулирующее действие на исследуемые функции фагоцитов непосредственно в очаге воспаления. При этом наблюдались отличия в группах с отличным и хорошим клиническим результатом лечения (п=21 и п=13 соответственно). За отличный результат принимали исчезновение всех субъективных и объективных симптомов болезни к третьему дню лечения. За хороший результат принимали состояние, когда на 4 и 5 день лечения сохранялись отдельные объективные симптомы заболевания (слизистое отделяемое, отек), исчезавшие к шестому дню от начала лечения.
Анализ адгезивной способности нейтрофилов показал ее активацию в процессе лечения. У лиц с отличным результатом адгезионная способность нейтрофилов увеличивалась уже после 1-й и 2-й инъекции Беталейкина (с 6,79±2,87% до 10,86±2,95% и до 11,77±2,37%, р>0,05), у лиц с хорошим результатом - после 3-й инъекции (с 8,88±6,22% до 13,68±5,15% , р>0,05) и после лечения у всех возвращалась к исходному уровню (соответственно до 5,84±1,68%, р<0,05 и до 9,72±5,78%, р>0,05).
Анализ фагоцитоза нейтрофилами микроорганизмов непосредственно в воспалительном очаге показал, что в группе больных с отличным результатом способность фагоцитов к поглощению микроорганизмов также растет уже после 1-й инъекции и постоянно возрастает, достигая своего пика после 3-йинъекции (с 18,0±7,1% до лечения до 41,0±8,4% после лечения, р<0,05). В группе с хорошим результатом поглотительная способность нейтрофилов практически не меняется (27,0±7,8% до лечения и 24,0±16,0% после лечения).
Исследование способности к фагоцитозу свободных от микроорганизмов фагоцитов in vitro в тесте с частицами латекса показало, что пик фагоцитарной активности нейтрофилами частиц латекса приходится на период после 3-й инъекции Беталейки-на. У лиц с отличным результатом фагоцитарное число увеличивается (с 48,17±4,8% до 61,0±4,0%, p <0,05), но в меньшей степени, чем у больных с хорошим результатом (с 31,1±5,4% до 76,7±6,8%, p<0,001).
Анализ суммарных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов (сумма активных нейтрофи-лов в тесте с частицами латекса и клеток, которые уже поглотили микроорганизмы непосредственно в воспалительном очаге) показал, что в процессе лечения функциональная активность фагоцитов возрастает в обеих группах больных (табл.2). Однако способность нейтрофилов к фагоцитозу возрастает у лиц с отличным клиническим результатом уже после 1-й инъекции Беталейкина (до 84,7±8,8%, p<0,05), достигая своего пика после 3-й инъекции и остается высокой после курса лечения. У пациентов с хорошим результатом активация фагоцитоза происходит лишь после 3-й инъекции, и показатель возвращается к исходному уровню после лечения (см.табл.2).
Оценка метаболической активности нейтрофилов воспалительного очага в НСТ-тесте (спонтанном и индуцированном) показала, что эти показатели возрастают в процессе лечения в обеих группах после 3-й инъекции Беталейкина (НСТ спонтанный с 43,24±4,83% до 72,25±3,22%, p<0,001; НСТ стимулированный с 33,5±4,45% до 54,5±8,29, p<0,05). У пациентов в группе с отличным результатом высокая метаболическая активность сохраняется после лечения (НСТ спонтанный - 76,67+11,57%, НСТ стимулированный - 57,0+16,09%), тогда как у лиц с хорошим результатом этот показатель снижается до исходных значений (НСТ спонтанный до 46,0+8,39%, НСТ стимулированный до 46,62+8,65). Резервные возможности метаболической активности клеток в обеих группах остаются очень низкими - соотношение НСТ стим./НСТ спонт. на всех сроках лечения менее 1,0.
Параллельно проводилось изучение продукции провоспалительных цитокинов непосред-
■341Т1
I L- ■ 3 L-S »т\-
Рис. 1. Уровни ^-1Р, ^-8 и 1№-а в супернатантах промывных вод у больных ХГРС в процессе лечения Беталейкином.
ственно в очаге воспаления. Для этого у 12 больных ХГРС на фоне терапии Беталейкином исследовали в динамике концентрацию ^-1р, ^-8 и TNF-a в супернатанте промывных вод. Полученные данные отображены на рис. 1. Результаты исследования свидетельствуют, что в процессе лечения концентрация ^-8 в промывных жидкостях синусов снижается с 529,65 ± 167,99 пг/мл до 167,52 ± 35,89 пг/мл, р<0,05. Уровень TNF-a имеет тенденцию к повышению, а эндогенного IL-1в - к снижению, однако изменения содержания этих цитокинов оказались статистически недостоверны.
Обсуждение
В настоящей работе обследовано 36 больных с ХГРС, у которых гнойный процесс в пазухах не удалось излечить с использованием традиционных методов терапии. В связи с этим этой группе больных был проведен курс общей иммуностимулирующей терапии препаратом рекомбинантного интерлейкина-1 Р человека (Беталейкин), вводившимся внутривенно в виде курса из 5 ежедневных инфузий. Согласно клиническим результатам, которые лишь кратко описаны в этой работе, внутривенное введение ^-1р вызывало быстрое купирование местного
Таблица 2. ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ФАГОЦИТОЗА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОЧАГА В ХОДЕ ТЕРАПИИ БЕТАЛЕЙКИНОМ
Показатели фагоцитоза лейкоцитов ( фаг.число, %)
Клинический результат До начала лечения На 3 сутки курса лечения После окончания курса лечения
Отличный (n=21) 60,2 ± 5,1 106,0 ± 7,0* 78,5 ± 8,5*
Хороший (n=13) 57,1 ± 7,4 90,0 ± 5,0*** 61,0 ± 3,3**
* - различия с результатом до начала лечения достоверны, р < 0,05
** - различия между группами больных достоверны, р < 0,05
гнойно-воспалительного процесса в пазухах носа. Уже после первого введения Беталейкина отмечалась выраженная положительная клиническая динамика, подтвержденная объективными показателями исчезновения гнойного отделяемого из полости. Лабораторный мониторинг ряда показателей местного иммунитета в ходе проводимой терапии показал, что очевидное клиническое улучшение состояния больных коррелирует с результатами изучения особенностей местного воспалительного процесса.
При анализе функционального состояния лейкоцитов, полученных из воспалительного очага, оказалось, что показатели фагоцитоза и индексы стимуляции в НСТ-тесте снижены по сравнению с аналогичными показателями лейкоцитов периферической крови тех же пациентов. Возможно, это вызвано хроническим местным гнойно-воспалительным процессом, приводящим к нарушению этих функций клеток. В то же время нейтрофилы больных ХГРС, находящиеся непосредственно в гнойном очаге, в сравнении с клетками периферической крови характеризуются более высокими параметрами метаболической способности клеток, судя по данным спонтанного и индуцированного НСТ-теста.
Внутривенное введение IL-1 ß приводит к быстрому росту практически всех основных показателей функциональной активности нейтрофильных гра-нулоцитов воспалительного очага, т.е. системное введение препарата способно оказать существенное влияние на клетки местно в области развития воспалительной реакции. Показатели функциональной активности лейкоцитов увеличиваются уже после первого введения IL-1ß и растут к окончанию курса терапии. Разделение больных на две группы с отличным и хорошим результатом лечения позволило установить прямую зависимость между клиническими результатами и показателями функциональной активности лейкоцитов. Оказалось, что лучшие клинические результаты лечения совпадают с более выраженной активацией лейкоцитов воспалительного очага под влиянием терапии Беталейкином. Видимо, местная активация фагоцитоза, бактерицидной и других функций лейкоцитов является одним из важных механизмов иммуностимулирующего действия IL-1ß. Мощная активация лейкоцитов дает возможность эффективно элиминировать микроорганизмы, вызывавшие хронический гнойный воспалительный процесс, с которым была не в состоянии справиться иммунная система больного, и где были не эффективны обычные лечебные процедуры.
Результаты изучения местного уровня таких провоспалительных цитокинов и маркеров воспаления, как IL-1ß, IL-8 и TNF, показали, что динамика изменения их содержания в воспалительном очаге в процессе лечения Беталейкином соответ-
ствует клинической картине прекращения воспалительного процесса в околоносовых пазухах. Основные обнаруженные изменения связаны с падением изначально высокого уровня IL-8 в промывных водах. Видимо, элиминация патогена активированными лейкоцитами приводит к прекращению стимуляции синтеза IL-8 и других ци-токинов.
Таким образом, внутривенное введение рекомбинантного IL-ip оказывает стимулирующее влияние на состояние иммунитета слизистой оболочки око-лоносовых пазух, связанное с активацией практически всех функций лейкоцитов непосредственно в очаге воспаления. Выздоровление больных ХГРС при лечении Беталейкином прямо коррелирует со степенью активации функций лейкоцитов воспалительного очага.
Список литературы
1. Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., Круглова Н.Б., Никитина Т.А. Определение поглотительной способности нейтрофилов и моноцитов периферической крови // Клиническая лабораторная диагностика.- 1996.- № 2.- С. 18-20.
2. Иммунология, иммунопатология и проблемы иммунотерапии в ринологии // Под ред. Н.А. Арефьевой - Уфа, 1997.- 120 с.
3. Матвеева Л.А. Местный иммунитет при болезнях легких у детей // Томск: Изд-во Томск.ун-та, 1986.- 192с.
4. Нагаев Б.С., Шубич М.Г. Значение теста восстановления нитросинего тетразолия для изучения функциональной активности нейтрофилов // Лаб.дело.- 1981. -№4.-С.195-198.
5. Окунь О.С. Динамика иммунологических показателей в сыворотке крови и смывах из верхнечелюстных пазух при местном применении антибиотиков у больных хроническим гнойным гайморитом // Журнал вушних, носових i горлових хвороб. - 1997.- №3.- С.18-22.
6. Симбирцев А.С. Новые подходы к клиническому применению рекомбинантного интерлейкина - 1р // Медицинская иммунология.- 1999.- т.1. -№ 1-2.- С.141-146.
7. Тишко Н.А., Гавриленко Т.И. Определение адгезивной способности фагоцитирующих клеток при саркоидозе // Клиническая лабораторная диагностика.- 1992. - № 7-8.- С. 25-27.
8. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. Иммунные комплексы и цитокины // Медицинская иммунология.- 1999.- т.1. - № 1-2.- С.27-36.
9. Чернушевич И.И. Опыт применения препарата “Беталейкин” при лечении хронических гнойных средних отитов // Новости оториноларингологии и логопатологии. - 1999. -№ 1 (17).- С.37-39.
10. Чернышева И.Э., Бажора Ю.И., Дюмин О.В. Некоторые показатели местного иммунитета у боль-
ных острым и хроническим экссудативным гайморитом при ультрафиолетовой лазеротерапии // Журнал вушних, носових і горлових хвороб. - 1997.-№1.- С.47-54.
11. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Invest.- 1968, 21. - Suppl. 97. - P.177-185.
12. Brandtzaeg P. Immunocompetent cells of the upper airways: functions in normal and diseased mucosa // Eur. Arch. Otorhinolaryng.-1995. - Suppl.50. -P.98-121.
13. Dinarello C.A. Inflammatory cytokines: interleukin-1 and tumor necrosis factor as effector molecules in autoimmune diseases // Curr. Opin. Immunol. - 1991. - Vol.3. - P.941-948.
поступила в редакцию 10.12.1999 принята к печати 20.01.2000
