CC BY
119
активация и апоптоз тромбоцитов под действием
патогенных иммунных комплексов, содержащих
тромбоцитарный фактор 4
Т.А. Невзорова, Э.Р. Мордаханова, И.А. Андрианова, Р.И. Литвинов Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
Platelet activation and apoptosis induced by pathogenic immune complexes containing platelet factor 4
TA. Nevzorova, E.R. Mordakhanova, I.A. Andrianova, R.I. Litvinov Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
Одним из тяжелых осложнений гепаринотерапии является гепарин-индуцированная тромбоцитопения, которая проявляется диффузным микротромбозом . В основе этого состояния лежит образование антител к тромбоцитарному фактору 4 после его связывания с гепарином, а одним из пусковых факторов микротробоза может быть массивная активация тромбоцитов под действием патогенных иммунных комплексов . Механизмы повреждения тромбоцитов комплексами антиген-анитело во многом не известны В данной работе изучено прямое влияние иммунных комплексов рекомбинантного тромбоцитарного фактора 4 с патогенным моноклональным антителом на изолированные тромбоциты человека in vitro . Морфологические и биохимические изменения тромбоцитов изучены методами сканирующей электронной микроскопии и проточной цитометрии . Показано, что патогенные иммунные комплексы вызывают образование псевдоподий и агрегацию тромбоцитов, экспрессию фосфатидилсерина на плазматической мембране, снижение трансмембранного потенциала митохондрий, а также образование внеклеточных тромбоцитарных микровезикул . Результаты свидетельствуют о выраженной активации тромбоцитов и появлении признаков апоптоза под действием патогенных иммунных комплексов, содержащих тромбоцитарный фактор 4 . Эти изменения могут быть важной частью патогенеза тромбоцитопении и микротромбозов, осложняющих гепаринотерапию
Ключевые слова: тромбоциты, тромбоцитарный фактор 4, иммунные комплексы, гепарин-индуцированная тромбоцитопения
A severe complication of heparin therapy is heparin-induced thrombocytopenia, which manifests as thrombophilia, including diffuse microthrombosis . One of the main triggers of thrombosis are immune complexes formed by antibodies against platelet factor 4 and heparin , followed by massive activation of platelets probably under the influence of these pathogenic immune complexes . The mechanisms of platelet impairment by the antigen-antibody complexes are largely unknown . In this work direct effects of the immune complexes formed by recombinant platelet factor 4 and a pathogenic anti-platelet factor 4 monoclonal antibody on isolated human platelets in vitro were investigated . Morphological and biochemical changes in platelets were studied by scanning electron microscopy and flow cytometry It is shown that the pathogenic immune complexes cause platelet activation including formation of pseudopods and platelet aggregation In addition, an increase of phosphatidylserine exposure on the platelet surface and a decrease in mitochondrial membrane potential were observed accompanied by formation of platelet-derived microparticles bearing phosphatidylserine The results indicate that the platelet factor 4-containing pathogenic immune complexes induce platelet activation and apoptosis, which can be an important part of the pathogenesis of thrombocytopenia and microthrombosis complicating heparin administration
Keywords: platelets, platelet factor 4, immune complexes, heparin-induced thrombocytopenia
Введение
Гепарин-индуцированная тромбоцитопения (ГИТ) — одно из тяжелых осложнений применения нефрак-ционированного гепарина, широко используемого антикоагулянта для профилактики и лечения артериальных и венозных тромбозов . ГИТ характеризуется диффузным микротробозом сосудистого русла при одновременном уменьшении количества тромбоцитов в крови (тромбоцитопения). ГИТ развивается у 1—5% пациентов через 4—15 дней после начала гепаринотерапии и характеризуется выработкой специфических антител, в основном класса IgG, к комплексу гепарина с белком — тромбоцитарным фактором 4 (ТФ4) [1-3].
ТФ4 — это положительно заряженный глико-протеин альфа-гранул тромбоцитов, который се-кретируется в кровь при их активации, например, тромбином . Связывание отрицательно заряженного сульфатированного гепарина с ТФ4 приводит к его олигомеризации, конформационным изменениям и резко повышает иммуногенность . Иммунная реакция с образованием антител класса IgG (реже IgA и IgM) к комплексу гепарин/ТФ4 развивается у 25—60% пациентов, леченных гепарином, следовательно, не все иммунные комплексы ^/гепаринДФ4 являются
e-mail: Tatyana . Nevzorova@kpfu . ru
патогенными и не обязательно вызывают тромбоци-топению [4—6], что позволяет разделять их на патогенные и непатогенные.
Именно патогенные антитела способны вызывать активацию тромбоцитов, эндотелиальных клеток и моноцитов, вовлеченных в сложные механизмы системного иммунного воспаления . Тромбоциты — клетки крови, принимающие самое важное и непосредственное участие в реакциях гемостаза и тромбоза [7] . Показано, что патогенные комплексы ^/гепаринДФ4 вызывают активацию тромбоцитов с последующим выделением в кровь различных медиаторов (серото-нина, гистамина, АДФ и других) [4, 8—10], которые активируют и повреждают другие клетки . Массивная вторичная активация клеток крови и сосудистой стенки ведет к экспрессии тканевого фактора и образованию тромбина, что в совокупности приводит к внутрисосудистой агрегации тромбоцитов, отложению фибрина и тромбозам [11]. Однако, механизмы первичного действия иммунных комплексов, содержащих ТФ4, на тромбоциты до конца не ясны
Целью работы было изучение влияния комплекса ТФ4 с патогенным антителом к ТФ4 и гепарину на тромбоциты периферической крови человека in vitro .
Материал и методы
Материал исследования. Использовали рекомби-нантный ТФ4 человека и мышиное моноклональное патогенное антитело (KKO) класса IgG2bk к комплексу гепарин/ТФ4 человека, которое индуцирует ГИТ на мышиных моделях in vivo [12]. Препараты были любезно предоставлены доктором Любикой Рауовой (Dr . Lubica Rauova) из Гематологического отделения Детской больницы Филадельфии, США.
Выделение тромбоцитов. Плазму, богатую тромбоцитами, получали центрифугированием цельной цитратной крови здоровых доноров при 200g в течение 10 минут при комнатной температуре (разрешение этической комиссии Казанской государственной медицинской академии № 2/2012) . Тромбоциты из плазмы выделяли гель-фильтрацией на Сефарозе 2В (GE Healthcare, Швеция), уравновешенной буфером Тироде (4 мМ HEPES, 135 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 2,4 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl2, 5,6 мМ D-глюкоза, 3,3 мМ NaH2PO4, 0,35 мг/мл бычий сывороточный альбумин, pH 7,4) . Подсчет тромбоцитов проводили в камере Горяева с использованием микроскопа PrimoStar (Zeiss, Германия) .
Инкубация тромбоцитов с иммунным комплексом ТФ4-ККО. Тромбоциты (200 тыс . клеток в 150 мкл буфера Тироде) инкубировали при 37°С в течение 15 мин . в присутствии: 1) смеси препарата ТФ4 и антитела ККО в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно; 2) 50 мкг/мл ККО; 3) 10 мкг/мл ТФ4 . Отрицательный контроль — тромбоциты, инкубированные в буфере Тироде; положительный контроль — тромбоциты, стимулированные тромбином (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 1 U/мл .
Сканирующая электронная микроскопия. По окончании инкубации тромбоциты фиксировали 2% глу-таровым альдегидом в 50 мМ какодилате натрия, содержащем 100 мМ NaCl, рН 7,4 . Клетки осаждали центрифугированием на поликарбонатный фильтр (размер пор 0,4 мкм) и фиксировали раствором 2% глутарового альдегида в течение ночи при 4—8°С . Образцы дегидратировали растворами этанола от 30% до 100%, фиксировали гексаметилдисилаза-ном (HMDS, Sigma-Aldrich, США) и напыляли слой золота с палладием (Polaron, e5100 sputter coater, Quorum Technologies, Великобритания) . Морфологию тромбоцитов изучали на сканирующем электронном микроскопе Quanta 250G (FEI, США) .
Проточная цитометрия. Для оценки митохон-дриального потенциала к тромбоцитам добавляли MitoTracker DeepRed FM (Invitrogen, США) в конечной концентрации 150 нМ . Для оценки экспрессии фосфатидилсерина на внешней поверхности плазматической мембраны тромбоцитов к 150 мкл суспензии клеток в связывающем буфере (10 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 2 . 5 мМ CaCl2) добавляли 1,5 мкл Аннексин V-ФИТЦ (BioLegend, США) . Для идентификации тромбоцитов и доказательства тром-боцитарного происхождения микровезикул добавляли 30 мкг/мл меченого фикоэритрином моноклональ-ного антитела к тромбоцитарному маркеру CD41 (Invitrogen, США) Измеряли 30 000 частиц на проточном цитометре BD Biosciences FacsCalibur (США) с аргоновым ионным лазером с длиной волны 488 нм и диодным красным лазером с длиной волны 635 нм Данные проточной цитометрии обрабатывали с помощью программного обеспечения Cell Quest Рго .
Статистическая обработка результатов. Каждый опыт в конкретных экспериментальных условиях проводили в трех повторах на тромбоцитах из крови как минимум трех различных доноров . Результаты проточной цитометрии представлены как среднее арифметическое и стандартное отклонение . Для определения достоверности различий между средними при доверительном уровне 95% (Р<0,05) использовали С-критерий Стьюдента .
Результаты
Морфология тромбоцитов. Методом сканирующей электронной микроскопии обнаружено, что контрольные тромбоциты имеют дисковидную форму, клетки располагаются отдельно друг от друга (рис . 1А), что соответствует морфологии нормальных не активированных (покоящихся) тромбоцитов . После инкубации с иммунным комплексом ТФ4-КК0 (рис . 1Б) морфология тромбоцитов претерпела существенные изменения, а именно: клетки приобрели неправильную форму, образовали мембранные выросты (псевдоподии) и клеточные агрегаты . Эти сдвиги аналогичны морфологическим изменениям тромбоцитов под действием тромбина, что позволяет идентифицировать их как признаки активации клеток . Инкубация тромбоцитов с чистыми антителами ККО (рис . 1В) вызывала деформацию и их агрегацию, однако выраженность морфологических изменений была меньше, чем под влиянием иммунных комплексов . В присутствии чистого ТФ4 тромбоциты несколько меняли форму, но не агрегировали (рис . 1Г) .
Проточная цитометрия тромбоцитов. Цитоме-трический анализ распределения частиц по размеру (FSC) и гранулярности (SSC) в контрольном образце позволил выявить сигналы, соответствующие не активированным тромбоцитам, идентифицированным с помощью моноклональных антител к тромбоцитарному маркеру Сй41 (рис . 2А). На основании этих данных был определен гейт тромбоцитов, который использовали в дальнейших измерениях Патогенный иммунный комплекс ТФ4-КК0 приводил к изменению характера частиц в измеряемом диапазоне: уменьшался их размер и изменялась гранулярность; одновременно число целых тромбоцитов уменьшалось приблизительно в 10 раз (рис . 2Б) . В отличие от комплекса ТФ4-КК0, после инкубации клеток с чистыми ККО (рис 2В) или ТФ4 (рис . 2Г) значительных качественных и количественных изменений светорассеяния тромбоцитов не обнаружено
Экспрессия фосфатидилсерина на плазматической мембране тромбоцитов. Одним из проявлений активации и апоптоза тромбоцитов является появление на внешней поверхности плазматической мембраны фосфатидилсерина [13—16], который выявляется по связыванию белка аннексина^. Цитофлюориметрия тромбоцитов в гейте показала, что инкубация с комплексом ТФ4-КК0 приводила к достоверному, примерно 12-кратному увеличению доли тромбоцитов, окрашиваемых флюоресцентно меченым аннексином^, по сравнению с контрольными клетками (рис 3А) Аналогичное, хотя и гораздо менее выраженное увеличение доли Аннексин^-связывающих клеток наблюдалось под действием тромбина, чистых антител КК0 или препарата ТФ4 (рис 3А)
оригинальные исследования
49
Рис. 1.
Тромбоциты в различных экспериментальных условиях: А — покоящиеся интактные тромбоциты;
Б — тромбоциты после инкубации с иммунным комплексом ТФ4-КК0, образованном в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно; В — тромбоциты после инкубации с чистыми антителами ККО (50 мкг/мл); Г — тромбоциты после инкубации с чистым ТФ4 (10 мкг/мл). Сканирующая электронная микроскопия.
Масштабный отрезок — 5 мкм
РБС
Рис. 2.
Цитометрический анализ частиц после инкубации тромбоцитов в различных экспериментальных условиях в течение 15 мин. при 37°С: А — отрицательный контроль, покоящиеся интактные тромбоциты; Б — тромбоциты в присутствии иммунных комплексов ТФ4-КК0, смешанных в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно; В — тромбоциты в присутствии ККО (50 мкг/мл); Г — тромбоциты в присутствии ТФ4 (10 мкг/мл). Ось абсцисс — прямое светорассеяние (FSC), ось ординат — боковое светорассеяние (SSC)
А
контроль тромбин
ККО
ТФ4
ТФ4-ККО
контроль тромбин
ККО
ТФ4
ТФ4-ККО
Рис. 3.
Результаты цитометрического определения доли тромбоцитов, окрашиваемых аннексин-У-ФИТЦ (А) и М^оТгаскег DeepRed FM (Б) после инкубации тромбоцитов в различных экспериментальных условиях в течение 15 мин. при 37°С: контроль — покоящиеся интактные тромбоциты; тромбин — тромбоциты в присутствии 1 и/мл тромбина; ККО — тромбоциты в присутствии 50 мкг/мл ККО; ТФ4 — тромбоциты в присутствии 10 мкг/мл ТФ4; ТФ4-ККО — тромбоциты в присутствии смеси ТФ4 и ККО в конечных концентрациях 10 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно. В пределах гейта количество тромбоцитов в каждом образце принято за 100%
Митохондриальный потенциал тромбоцитов . Важным показателем функционального состояния тромбоцитов является митохондриальный трансмембранный потенциал (АТт) и его изменения [15—17]. Относительную величину АТт определяют методом проточной цитофлюориметерии по флуоресценции красителя М^оТпаскеп DeepRed FM; при этом чем выше мембранный потенциал, тем больше интенсивность свечения маркера . Таким образом, снижение или отсутствие флуоресценции свидетельствует о снижении энергетического обмена клеток и является одним из проявлений апоптоза В наших опытах инкубация тромбоцитов с комплексом ТФ4-ККО вызывала уменьшение суммарной флюоресценции митотрекера (рис . 3Б), прежде всего, за счет существенного понижения (на ~30%) содержания клеток с нормальным свечением, присущим не активированным покоящимся тромбоцитам . Инкубация с тромбином и чистыми антителами ККО (рис . 3Б) приводила к умеренному уменьшению количества тромбоцитов с нормальным митохондриальным потенциалом (примерно на 11% и 3%, соответственно) . Чистый ТФ4 не оказывал видимого влияния на трансмембранный потенциал митохондрий по флюоресценции митотрекера (рис. 3Б) .
Субпопуляции тромбоцитов. Для изучения относительной роли активации и апоптоза тромбоцитов был проведен количественный цитометрический анализ тромбоцитов в гейте по их одновременному двойному окрашиванию флуоресцентно-меченым аннексином^ и митотрекером (рис . 4А, Б).
На рисунке 4В представлено содержание двух субпопуляций тромбоцитов, окрашенных аннексин-V-ФИТЦ и М^оТпаскеп DeepRed FM . Одна субпопуляция представлена тромбоцитами, которые экспрессируют фосфатидилсерин (связывание аннексина^-ФИТЦ) при сохранении АТт (свечение М^оТпаскеп); это значит, что клетки преимущественно активированы без признаков апоптоза Вторая субпопуляция клеток окрашивается только аннексином^-ФИТЦ, т . е . это клетки, экспрессиру-ющие фосфатидилсерин, но с нарушенным митохондриальным потенциалом, что является признаком апоптоза тромбоцитов
Обнаружено, что инкубация тромбоцитов с комплексом ТФ4-ККО приводит к достоверному увеличению количества тромбоцитов, принадлежащих двум описанным субпопуляциям Обе субпопуляции клеток экспрессировали фосфатидилсерин, при этом доля клеток с сохраненным митохондриаль-ным потенциалом была примерно в 9 раз больше субпопуляции тромбоцитов в контроле, а доля клеток с нарушенным митохондриальным потенциалом была примерно в 15 раз больше, чем в контроле (рис 4В) Инкубация с тромбином и чистыми ккО приводила к увеличению числа тромбоцитов с двойным окрашиванием аннексином^ и митотрекером (в 7 и 5 раз больше контроля, соответственно) (рис . 4В), которое характеризует активированные тромбоциты без признаков апоптоза Чистый ТФ4 достоверного влияния на тромбоциты не оказывал (рис 4В)
30
аГ 1— 25
>s
Ф
m
m
о
Is 20
=г
о
ю
о
Q.
1-
X 15
s
3"
2
Q-
S
о 10
Q)
о_
О
С
в
CK 5
с;
о
et
А
Б
В
§ 101 105 104 s Аннексии V-ФИТЦ (FL1)
г.,
Й : • ' 1
' 'l<Р 101 10* 104 ' Аннексии V-ФИТЦ (FL1)
контроль тромбин
ККО
ТФ4
ТФ4-ККО
Рис. 4.
Влияние иммунного комплекса ТФ4-ККО на экспрессию фосфатидилсерина (FL1) и трансмембранный потенциал митохондрий (FL4) тромбоцитов в гейте. Цитометрический анализ покоящихся интактных тромбоцитов в отрицательном контроле (А) и тромбоцитов после инкубации с иммунным комплексом ТФ4-КК0 (Б).
Доля тромбоцитов после инкубации в течение 15 мин. при 37°С в различных экспериментальных условиях (В): светло-серый столбик — тромбоциты с двойным окрашиванием аннексин^-ФИТЦ и MitoTracker DeepRed FM; темно-серый столбик — тромбоциты, окрашенные аннексин^-ФИТЦ. Обозначения — см. рис. 3. В пределах гейта количество тромбоцитов в каждом образце принято за 100%
Образование микровезикул. Одним из признаков активации и апоптоза тромбоцитов является образование микровезикул, экспрессирующих фосфа-тидилсерин [14, 15, 17]. Цитометрический анализ общего количества всех частиц показал, что инкуба-
ция тромбоцитов с комплексом ТФ4-КК0 приводит к 6-кратному увеличению количества аннексин^-связывающих мелких частиц (рис . 5), т . е . частиц, размер которых заведомо меньше, чем размер тромбоцитов ^С <101, рис . 5).
Рис. 5.
Результаты цитометрического определения доли микровезикул, окрашенных аннексин^-ФИТЦ, после инкубации тромбоцитов в различных экспериментальных условиях в течение 15 мин. при 37°С. Обозначения — см. рис. 3. Общее количество всех частиц в каждом образце принято за 100%. Вставка — цитометрический анализ микровезикул (FSC < 101), окрашенных аннексин^-ФИТЦ
Применение моноклонального антитела к CD41 показало, что аннексин^-положительные мелкие частицы (микровезикулы), в основном, имеют тромбоцитарное происхождение . При инкубации с тромбоцитами тромбин и чистые антитела KKO также вызывают увеличение числа мелких частиц, но в меньшей степени, чем имунный комплекс ТФ4-КК0 (рис . 5) . Доля микровезикул, реагирующих с аннексином-V, увеличивается по сравнению с контролем приблизительно в 4,5—5 раз . Чистый ТФ4 не влияет на образование тромбоцитами микрочастиц (рис 5)
Обсуждение
Гепарин является наиболее широко применяемым антикоагулянтом, поэтому осложнения гепариноте-рапии встречаются сравнительно часто . Одним из тяжелых последствий применения гепарина является состояние, называемое гепарин-индуцированной тромбоцитопенией (ГИТ), ведущим проявлением которого является снижение уровня тромбоцитов в крови [18]. Как ни странно, ГИТ крайне редко сопровождается кровоточивостью, гораздо чаще у пациентов развивается тромбофилия, главным образом, в форме диффузного микротромбоза . Это дает основание объяснить снижение числа тромбоцитов в крови прежде всего их потреблением в процессе тромбообра-зования в результате внутрисосудистой активации и агрегации клеток Однако степень тромбоцитопении и выраженность микротромбоза не всегда коррелируют, что указывает на существование альтернативных механизмов тромбоцитопении, не связанных с отложением клеток внутри сосудов Одной из возможных причин тромбоцитопении при ГИТ является апоптоз, который до последнего времени считался маловероятным в безъядерных клетках, но, тем не менее, был убедительно показан в многочисленных исследованиях [19—22]. Учитывая, что главным механизмом ГИТ служит образование патогенных иммунных комплексов, образуемых антителами к ТФ4, мы исследовали прямое влияние таких комплексов на тромбоциты in vitro, пытаясь воспроизвести активацию и (или) апоптоз тромбоцитов в условиях ГИТ . Нами показано, что иммунный комплекс, состоящий из ТФ4 человека и анти-ТФ4 патогенного антитела ККО, индуцирует морфологические и биохимические изменения в тромбоцитах, которые в совокупности свидетельствуют об их выраженной активации, со-провождающйся апоптозом части активированных клеток
Инструментами воздействия на изолированные интактные тромбоциты были препараты ТФ4 и KKO . ТФ4 — это хемокин подсемейства СХС, состоит из 70 аминокислотных остатков, положительно заряженный гомотетрамер, находится в альфа-гранулах тромбоцитов и высвобождается при их активации [23]. ТФ4 с высокой аффинностью связывается с отрицательно заряженным гепарином, образуя крупные олигомерные комплексы, что способствует развитию иммунного ответа и образованию антител [24—26]. KKO — это мышиное моноклональное антитело класса IgG2bk, специфичное к ТФ4 и, особенно, комплексу гепарин/ТФ4, которое индуцирует ГИТ-подобное состояние на мышиных моделях in vivo [12].
Известно, что активация тромбоцитов сопровождается морфологическими сдвигами, прежде всего изменением формы, формированием псевдоподий
и агрегатов [11]. Именно такие изменения были выявлены методом сканирующей электронной микроскопии после инкубации тромбоцитов с комплексом ТФ4-ККО (рис . 1Б), что свидетельствует об активации тромбоцитов Аналогичные, хотя и менее выраженные, морфологические изменения клеток под действием чистых антител (см . рис . 1В) могут быть связаны с образованием комплекса ккО с эндогенным ТФ4, секретируемым тромбоцитами in vitro, что, в свою очередь, вызывает их активацию [27] Образование псевдоподий у тромбоцитов в присутствии чистого ТФ4 (рис . 1Г) может быть обусловлено наличием рецепторов к этому хемокину, которые могут вызывать частичную активацию клеток [9, 28—30].
Среди биохимических проявления клеточной активации одним из наиболее универсальных является экспрессия фосфатидилсерина в результате нарушения мембранной асимметрии фосфолипидов . Наши данные показывают, что инкубация тромбоцитов с комплексом сопровождается значительным увеличением способности клеток связывать аннексин-V — маркер фосфатидилсерина на клеточной мембране (рис . 2А) . Наличие на плазматической мембране тромбоцитов фосфатидилсерина — важнейший прокоагулянтный механизм, способствующий формированию теназного комплекса и генерации тромбина [13]. Наряду с активацией клеток, экспрессия фосфатидисерина происходит при апоптозе . Чтобы дифференцировать активацию и апоптоз тромбоцитов, одинаково сопровождающихся экспозицией фосфатидилсерина, мы исследовали изменения мембранного потенциала митохондрий, снижение которого является биохимическим признаком апоп-тоза [15—17, 31, 32]. После инкубации тромбоцитов с комплексом ТФ4-ККО увеличивалась доля клеток, в которых величина мембранного потенциала мио-хондрий снижалась, что проявлялось уменьшением или исчезновением флуоресценции митотрекера — маркера функционального состояния митохондрий (рис 2Б) Тромбоциты характеризуются коротким временем жизни (7—10 дней) и одним из энергозависимых механизмов регуляции времени циркуляции тромбоцитов в кровотоке является апоптоз [33, 34] Активация апоптоза под действием иммунных комплексов ТФ4-ККО может быть самостоятельной причиной тромбоцитопении при ГИТ, которая не связана с потреблением тромбоцитов в реакциях внутрисосудистого тромбообразования.
как активация, так и апоптоз тромбоцитов сопровождаются их микровезикуляцией, т . е . высвобождением фосфолипидных микрочастиц размером 0,1—1,0 микрон, на мембране которых содержится фосфатидилсерин [11, 17, 32, 35]. Микровезикулы участвуют в реакциях гемостаза и тромбоза, воспаления и межклеточных взаимодействий, вносят вклад в пролиферацию и дифференциров-ку клеток [36]. Возможность микровезикуляции тромбоцитов под действием комплексов ТФ4-ККО была показана в наших опытах с использованием проточной цитометрии по увеличению количества аннексин-V- и С041-положительных частиц, имеющих размер меньше, чем тромбоциты (рис 5), при одновременном уменьшении числа целых клеток
Полученные результаты свидетельствуют о том, что патогенный иммунный комплекс ТФ4-КК0, который образуется в кровотоке у больных ГИТ,
оригинальные исследования
53
способен не только прямо активировать тромбоциты, но и стимулировать их апоптоз . Скорее всего, апоптоз тромбоцитов является следствием их активации, но нельзя исключать и прямого апоптоти-ческого эффекта иммунного комплекса на клетки, результатом которого является ускоренная гибель тромбоцитов . Дальнейшее изучение механизмов взаимодействия патогенного комплекса ТФ4-^ на клетки крови позволит понять патегенез ГИТ и разработать методы предупреждения и лечения этой ятрогенной патологии
Благодарности
Авторы выражают благодарность профессору Любике Рауовой из Детской больницы Филадельфии (США) за любезно предоставленные препараты белков, использованных в данной работе.
Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Warkentin T . E . , Kelton J . G . Temporal aspects of heparin-induced thrombocytopenia . N . Engl . J . Med . 2001; 344: 1286-92 .
2 . Arepally G . M ., Ortel T. L . Heparin-induced thrombocytopenia . Annu . Rev . Med . 2010; 61: 77-90 .
3 . Sakr Y . Heparin-induced thrombocytopenia in the ICU: an overview . Crit . Care . 2011; 15: 211-19 .
4 . Visentin G . P ., Ford S . E ., Scott J . P . el al . Antibodies from patients with heparin-induced thrombocytopenia/thrombosis are specific for platelet factor 4 complexed with heparin or bound to endothelial cells . J . Clin . Invest . 1994; 93: 81-88 .
5 Lee S H , Liu C Y , Visentin G P Heparin-induced Thrombocytopenia: Molecular Pathogenesis . Int . J . Hematol . 2002; 76 Suppl I: 346-51.
6 . Kasper B . , Petersen F . Molecular pathways of platelet factor 4/ CXCL4 signaling . Eur . J . Cell Biol . 2011; 90: 521-26 .
7 Semple J W , Italiano J E , Freedman J Platelets and the immune continuum . Nat . Rev . Immunol . 2011; 11: 264-74.
8 . Reilly M . P ., Taylor S . M ., Hartman N . К . et al . Heparin-induced thrombocytopenia/thrombosis in a transgenic mouse model requires human platelet factor 4 and platelet activation through FcgRIIA . Blood 2001; 98(8): 2442-47 .
9 . Rauova L. , Hirsch J . D . , Greene T. К . et al . Monocyte-bound PF4 in the pathogenesis of heparin-induced thrombocytopenia . Blood . 2010; 116(23): 5021-31.
10 . Kasthuri R . S . , Glover S . L ., Jonas W . et al . PF4/heparin-antibody complex induces monocyte tissue factor expression and release of tissue factor positive microparticles by activation of FcgRI . Blood 2012; 119(22): 5285-93 .
11 Rao G H R Handbook of platelet physiology and pharmacology London: Kluwer Academic Publishers; 1999 .
12 . Arepally G . M ., Kamei S ., Park К . S . et al . Characterization of a murine monoclonal antibody that mimics heparin-induced thrombocytopenia antibodies . Blood 2000; 95: 1533-40 .
13 . Bevers E . M ., Comfurius P ., van Rijn J . L . M . L . et al . Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets Eur J Biochem 1982; 122: 429-36 .
14 . Thiagarajan P ., Tait J . F . Collagen-induced Exposure of Anionic Phospholipid in Platelets and Platelet-derived Microparticles J Biol Chem . 1991; 266(36): 24302-7 .
15 Leytin V Apoptosis in the anucleate platelet Blood Rev 2012; 26: 51-63 .
16 Gyulkhandanyan A V , Mutlu A , Freedman J et al Selective triggering of platelet apoptosis, platelet activation or both Br J Haematol . 2013; 161: 245-54.
17 Gyulkhandanyan A V , Mutlu A , Freedman J et al Markers of platelet apoptosis: methodology and applications J Thromb Thrombolysis 2012; 33: 397-411.
18 . McKenzie S . E ., Sachais B . S . Advances in the pathophysiology and treatment of heparin-induced thrombocytopenia . Curr. Opin . Hematol . 2014; 21: 380-7 .
19 Leytin V , Allen D J , Mykhaylov S et al Pathologic high shear stress induces apoptosis events in human platelets Biochem Biophys Res . Commun . 2004; 320: 303-10 .
20 . Zhang H ., Nimmer P . M . , Tahir S . К . et al . Bcl-2 family proteins are essential for platelet survival . Cell Death Differ. 2007; 14: 943-51.
21. Schoenwaelder S . M ., Jarman К . E ., Gardiner E . E . et al . Bcl-xL-inhibitory BH3 mimetics can induce a transient thrombocytopathy that undermines the hemostatic function of platelets . Blood 2011; 118(6): 1663-74 .
22 . Shiri R . , Yari F . , Ahmadinejad M . et al . The caspase-3 inhibitor (peptide Z-DEVD-FMK) affects the survival and function of platelets in platelet concentrate during storage . Blood Res . 2014; 49: 49-53
23 . Zucker M . B ., Katz I . R . Platelet factor 4: production, structure, and physiologic and immunologic action Proc Soc Exp Biol Med 1991; 198(2): 693-702 .
24 . Rauova L ., Poncz M ., McKenzie S . E . et al . Ultralarge complexes of PF4 and heparin are central to the pathogenesis of heparin-induced thrombocytopenia . Blood 2005; 105(1): 131-8 .
25 . Kowalska M .A., Rauova L., Poncz M . Role of the platelet chemokine platelet factor 4 (PF4) in hemostasis and thrombosis Thromb . Res . 2010; 125: 292-6 .
26 . Vandercappellen J . , Damme J .V ., Struyf S . The role of the CXC chemokines platelet factor-4 (CXCL4/PF-4) and its variant (CXCL4L1/ PF-4var) in inflammation, angiogenesis and cancer . Cytokine Growth Factor Rev . 2011; 22: 1-18 .
27 . Prechel M . M ., Jeske W. P ., Walenga J . M . Physiological changes in membrane-expressed platelet factor 4: Implications in heparin-induced thrombocytopenia . Thromb . Res . 2010; 125: 143-8 .
28 Visentin G P , Moghaddam M , Beery S E et al Heparin is not required for detection of antibodies associated with heparin-induced thrombocytopenia/thrombosis . J . Lab . Clin . Med . 2001; 138(1): 22-31
29 . Poncz M ., Rauova L ., Cines D . B . The role of surface PF4: glycosaminoglycan complexes in the pathogenesis of heparin-induced thrombocytopenia (HIT) Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35(1-2): 46-9 .
30 Capitanio A M , Niewiarowski S , Rucinski B et al Interaction of platelet factor 4 with human platelets Biochim Biophys Acta 1985; 839(2): 161-73 .
31 Leytin V , Allen D J , Mykhaylov S et al Thrombin-triggered platelet apoptosis J Thromb Haemost 2006; 4: 2656-63
32 . Thushara R . M ., Hemshekhar M ., Kemparaju К . et al . Therapeutic drug-induced platelet apoptosis: an overlooked issue in pharmacotoxicology . Arch . Toxicol . 2014; 88: 185-98 .
33 . Kile B . T . The role of the intrinsic apoptosis pathway in platelet life and death . J . Thromb . Haemost . 2009; 7 Suppl 1: 214-7 .
34 Michelson A D , editor Platelets 3rd ed Amsterdam: Academic Press; 2013 . p . 51-64 .
35 Burnouf T , Goubran H A , Chou M -L et al Platelet microparticles: Detection and assessment of their paradoxical functional roles in disease and regenerative medicine Blood Rev 2014; 28: 155-66 .
36 Thushara R M , Hemshekhar M , Basappa et al Biologicals, platelet apoptosis and human diseases: an outlook . Crit . Rev . Oncol . Hematol . 2015; 95: 149-58 .
Поступила: 14.10.2015
